• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    乙酰半胱氨酸抑制脂多糖誘導的人肺N C I-H 292細胞粘蛋白M U C 5AC表達△

    2016-11-22 07:57:44林曉萍福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科泉州362000
    北方藥學 2016年11期
    關(guān)鍵詞:乙酰黏液半胱氨酸

    林曉萍(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科泉州362000)

    乙酰半胱氨酸抑制脂多糖誘導的人肺N C I-H 292細胞粘蛋白M U C 5AC表達△

    林曉萍(福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科泉州362000)

    目的:研究乙酰半胱氨酸(NAC)對脂多糖(LPS)誘導的氣道粘蛋白MUC5AC表達的調(diào)控作用并探討可能的機制。方法:體外培養(yǎng)人氣道上皮細胞NCI-H292,實驗分為對照組、黏液高表達組(LPS組)及乙酰半胱氨酸干預組(NAC+LPS組),分別采用Real time PCR和Western blot方法檢測NCI-H292細胞MUC5AC、Nrf2的mRNA含量及蛋白表達水平。結(jié)果:LPS刺激NCI-H292細胞表達MUC5AC,MUC5AC mRNA及蛋白表達分別增加7.169±1.785及1.473±0.098(P均<0.05)。NAC促進NCI-H292細胞Nrf2表達,抑制LPS誘導的MUC5AC表達(P<0.05),以30mM最為顯著。結(jié)論:乙酰半胱氨酸通過促進Nrf2基因表達,抑制氣道上皮細胞粘蛋白MUC5AC分泌。

    乙酰半胱氨酸 粘蛋白 MUC5AC Nrf2信號通路

    正常分泌的氣道黏液具有保護氣道、濕潤空氣等作用,但在吸煙、感染、氧化應(yīng)激等多種致病因素作用下,可產(chǎn)生大量促分泌因子作用于分泌細胞,產(chǎn)生過量黏液[1]。氣道黏液高分泌是慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、支氣管擴張癥及肺囊性纖維化等慢性氣道炎癥性疾病的特征性病理生理改變和臨床表現(xiàn)[2~3]。在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)許多患者死于氣道黏液高分泌導致的氣道阻塞或窒息,因此深入探索氣道黏液高分泌的發(fā)病機制及調(diào)控措施具有重要意義。2015年我國撰寫了第一個《慢性氣道炎癥性疾病氣道黏液高分泌管理的專家共識》[4],指出祛痰治療有助于減輕慢性氣道炎癥性疾病患者的氣道狹窄,避免反復感染,延緩肺功能下降。目前臨床常用的祛痰藥物有愈創(chuàng)甘油醚、羧甲司坦、N-乙酰半胱氨酸、厄多司坦、氨溴索等,可能的作用機制各不相同[5]。其中,N-乙酰半胱氨酸是一種經(jīng)典的抗氧化劑,可降低黏液的黏稠度,促進黏液排出[6]。但目前關(guān)于N-乙酰半胱胺酸下調(diào)氣道黏液表達的具體調(diào)控機制尚不完全清楚。

    氣道黏液的主要成分是粘蛋白MUC5AC,多種刺激因子如香煙煙霧、細菌、卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)等均可引起氣道MUC5AC表達增高,銅綠假單胞菌是慢性氣道炎癥性疾病的常見病原菌,因此本研究使用銅綠假單胞菌的胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激人氣道上皮細胞NCI-H292建立粘蛋白MUC5AC高表達模型,以探討N-乙酰半胱氨酸在氣道粘蛋白MUC5AC表達中的調(diào)控作用及可能的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1主要材料:人氣道上皮細胞NCI-H292株(購自中國科學院上海細胞庫),RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清(購自Gibco);N-乙酰半胱氨酸(購自sigma公司),RIPA細胞裂解液及BCA蛋白定量試劑盒(購自上海碧云天生物有限公司),Trizol(購自Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real time PCR試劑盒(均購自TARAKA公司),Real time PCR引物(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成),鼠抗人MUC5AC單克隆抗體(購自Thermo公司),兔抗人Nrf2單克隆抗體(購自abcam公司),其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2主要方法

    1.2.1細胞培養(yǎng):人氣道上皮細胞NCI-H292使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3d更換一次培養(yǎng)液,每4~5d以1∶3比例傳代一次。

    1.2.2實驗分組:取對數(shù)生長期的NCI-H292細胞接種于6孔培養(yǎng)板,細胞總數(shù)5.0×105個/2mL,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),18~24h后細胞達90%左右融合時,換用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。

    實驗分組:①對照組:無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng);②黏液高表達模型組:無血清培養(yǎng)基中分別加入不同濃度LPS分別干預24h,提取細胞總RNA,采用Q-PCR方法檢測各組細胞MUC5AC mRNA的表達,挑選最佳干預濃度;③NAC干預組:細胞預先予不同濃度NAC(10~40uM)預處理30min后,加入LPS干預24h,提取細胞總RNA,采用Q-PCR方法檢測各組細胞MUC5AC mRNA的表達,挑選NAC最佳干預濃度。各組均設(shè)3個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細胞進行檢測,實驗重復3次。

    1.2.3Real-time PCR檢測:采用TRIzol法提取細胞總RNA,通過分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測所提總RNA的濃度及完整性。取1μg總RNA,參照TAKARA PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,采用10μL反應(yīng)體系,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。接著,采用20μL反應(yīng)體系、使用SYBR實時熒光定量試劑盒進行擴增反應(yīng)。使用GADPH作為內(nèi)參照,采用2-ΔΔCt法確定靶基因的mRNA的相對表達量,以空白對照組作為矯正樣本(引物序列詳見表1)。

    表1 實時熒光定量PCR的引物序列

    1.2.4Western blot:用RIPA試劑盒提取細胞總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度,100℃10min致蛋白變性。經(jīng)5%~10%聚丙烯酰胺的梯度SDS-PAGE電泳分離,后電轉(zhuǎn)1~2h至PVDF膜上,經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1h,相應(yīng)一抗4℃孵育過夜,辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2h,經(jīng)化學發(fā)光法顯影、曝光。以與內(nèi)參照GADPH產(chǎn)物條帶的比值作為相對含量,分析各條帶灰度值。1.3統(tǒng)計學方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,各組檢測數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1建立LPS誘導的氣道粘蛋白MUC5AC高表達模型:使用2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL PA-LPS干預NCI-H292細胞24h后,提取細胞總RNA,Real time PCR結(jié)果顯示MUC5AC mRNA表達水平顯著增高,以10μg/mL為著,MUC5AC mRNA表達量為對照組的(7.169±1.785)倍(P=0.026)(圖1A),MUC5AC蛋白表達量為對照組的(1.473±0.098)倍(P= 0.014)(圖1B)。

    圖1A:不同濃度LPS均可誘導NCI-H292細胞MUC5AC mRNA表達,以10μg/mL為著(*組P=0.010);圖1B:LPS可誘導NCI-H292細胞MUC5AC蛋白表達(P<0.05)。

    2.2N-乙酰半胱氨酸抑制NCI-H292細胞粘蛋白MUC5AC表達:實驗分為3組:對照組、黏液高表達組、NAC干預組。預先使用不同濃度(10~40mM)N-乙酰半胱氨酸預處理NCI-H292細胞30min后加LPS 10μg/mL刺激,24h后收集細胞總RNA和蛋白裂解液,分別應(yīng)用Real time PCR和Western blot方法檢測細胞MUC5AC的mRNA和蛋白水平。結(jié)果顯示分別使用10mM、20mM、30mM和40mM的N-乙酰半胱氨酸預處理30min后,NCI-NCI-H292細胞MUC5AC mRNA表達量分別為3.372± 0.549(P=0.065)、3.052±1.125(P=0.018)、2.215±1.089(P= 0.015)、2.569±0.778(P=0.025);30mM NAC組和10mM及20mM NAC組相比,P<0.05,40mM NAC組和30mM NAC組相比,P= 0.205,差異無統(tǒng)計學意義。綜上所述,不同濃度NAC均能抑制LPS誘導的MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達,以30mM抑制效果最強(圖2A)。圖2B顯示使用30mM NAC預處理后LPS誘導的MUC5AC蛋白表達量降低至0.856±0.109,與LPS刺激組MUC5AC表達量1.473±0.098相比P=0.035,差異有統(tǒng)計學意義。說明N-乙酰半胱氨酸能抑制LPS誘導的MUC5AC表達。

    2A:不同濃度NAC均可抑制LPS誘導的MUC5AC mRNA表達,亦以30mM為甚(#組P=0.026、*組P=0.065、**組P= 0.018、***P=0.015、****P=0.025,****組與***組相比、P= 0.205,無顯著差異);2B:NAC可抑制LPS誘導的NCI-H292細胞MUC5AC蛋白表達(*組P<0.05)。

    2.3N-乙酰半胱氨酸對Nrf2信號通路的影響:圖3A顯示分別使用10mM、20mM、30mM和40mM的N-乙酰半胱氨酸預處理30min后,NCI-NCI-H292細胞Nrf2 mRNA的表達量分別為2.083±0.274(P=0.023)、3.218±0.201(P=0.003)、3.599±0.142(p= 0.001)、3.416±0.045(P=0.00),與LPS誘導的黏液高表達組Nrf2 mRNA的表達量1.081±0.019相比,P值均<0.05,差異有統(tǒng)計學意義;NAC可以促進Nrf2 mRNA表達,且當劑量<30mM時,隨著NAC劑量增加Nrf2 mRNA的表達量逐步增加(P< 0.05),當劑量>30mM時,隨著NAC劑量增加Nrf2 mRNA的表達量與基礎(chǔ)值相比是有增加、但和30mM比較數(shù)值有所下降,但無顯著差異(P=0.177)。MUC5AC mRNA在10μg/mL LPS作用時,隨著NAC促進Nrf2 mRNA表達的增加而有下降。且NAC劑量<30mM時,隨著NAC干預劑量增加,Nrf2 mRNA表達增加、而MUC5AC mRNA表達下降(P<0.05);當NAC劑量為40Mm(>30mM)時,MUC5AC mRNA表達較30Mm NAC組增加,而Nrf2 mRNA表達較30mM增加不明顯。

    圖2B示NAC干預組Nrf2蛋白表達量為2.318±0.287,與LPS誘導的黏液高表達組Nrf2蛋白表達量1.288±0.088相比,P=0.034,結(jié)果說明N-乙酰半胱氨酸通過激活Nrf2發(fā)揮LPS誘導粘蛋白MUC5AC表達的作用。

    3A不同濃度的NAC均可誘導NCI-H292細胞Nrf2 mRNA的表達,以30uM為甚,隨著NAC濃度增加,Nrf2 mRNA表達量不再繼續(xù)上升;3B:NAC誘導NCI-H292細胞Nrf2蛋白的表達(P<0.05)。

    3 討論

    N-乙酰半胱氨酸是一種療效較好的祛痰劑,含有活性巰基(-SH),可以打斷黏液蛋白的雙硫鍵,分解粘蛋白,降低痰液的黏稠度,同時還能增強黏液纖毛系統(tǒng)的生理轉(zhuǎn)運能力,促進黏液排出[6]。本實驗結(jié)果也表明,各濃度N-乙酰半胱氨酸均可抑制LPS誘導的粘蛋白MUC5AC表達,其中以30mM NAC組最明顯。證實N-乙酰半胱氨酸能參與調(diào)控氣道粘蛋白的表達。

    研究表明N-乙酰半胱氨酸同時也是谷胱甘肽的前體,能夠增加細胞內(nèi)的GSH,通過激活Nrf2信號通路清除自由基、抗細胞凋亡[6]。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是細胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,可以上調(diào)多種抗氧化酶,提高谷胱甘肽和超氧化物歧化酶等抗氧化物的表達水平,清除自由基等氧化物質(zhì),維持細胞內(nèi)氧化還原平衡,發(fā)揮抗氧化、抗炎反應(yīng)及其他細胞保護作用[7]。目前也有不少研究發(fā)現(xiàn)Nrf2信號通路參與調(diào)控香煙煙霧或中性粒細胞彈性蛋白酶誘導的氣道粘蛋白MUC5AC表達[8~9]。N-乙酰半胱氨酸作為Nrf2的誘導劑,很有可能也是通過Nrf2信號通路發(fā)揮抑制黏液過表達作用。本研究通過分析不同劑量NAC干預下NCI-H292細胞Nrf2及MUC5AC mRNA表達的變化,研究Nrf2在NAC抑制粘蛋白MUC5AC表達中的作用。研究結(jié)果顯示,不同劑量NAC均能促進NCIH292細胞Nrf2 mRNA表達。當NAC劑量<30mM時,隨著NAC干預劑量增加,Nrf2 mRNA表達逐步增加、MUC5AC mRNA表達逐步下降(P<0.05),以30mM為著;繼續(xù)增加NAC的濃度(> 30mM),NCI-NCI-H292細胞Nrf2 mRNA表達量增加不明顯,而MUC5AC mRNA表達較30Mm NAC組增加。說明N-乙酰半胱氨酸通過Nrf2參與下調(diào)MUC5AC表達。

    綜上所述,本研究通過體外細胞實驗首次揭示了N-乙酰半胱氨酸下調(diào)氣道黏液分泌的可能調(diào)控機制,為N-乙酰半胱氨酸的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù),具有一定的創(chuàng)新性。

    [1]Fahy JV,Dickey BF.Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med,2010,363(23):2233-2247.

    [2]Curran DR,Cohn L.Advances in mucous cell metaplasia:a plug for mucus as a therapeutic focus in chronic airway disease. Am J Respir Cell Mol Biol,2010,42(3):268-275.

    [3]Rogers DF.Mucoactive agents for airway mucus hypersecretory diseases.Respir Care,2007,52(9):1176-1193.

    [4]慢性氣道炎癥性疾病氣道黏液高分泌管理中國專家共識編寫組.慢性氣道炎癥性疾病氣道黏液高分泌管理中國專家共識[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2015,38(10):723-729.

    [5]Balsamo R,Lanata L,Egan CG.Mucoactive drugs.European Respiratory Review,2010,19(116):127-133.

    [6]Samuni Y,Goldstein S,Dean OM,et al.The chemistry and biological activities of N-acetylcysteine.Biochim Biophys Acta,2013,1830(8):4117-4129.

    [7]Lu MC,Ji JA,Jiang ZY,et al.The Keap1-Nrf2-ARE Pathway As a Potential Preventive and Therapeutic Target:An Update. Med Res Rev,2016,May 18.

    [8]Ying YH,Lin XP,Zhou HB,et al.Nuclear erythroid 2 p45-related factor-2 Nrf2 ameliorates cigarette smoking-induced mucus overproduction in airway epithelium and mouse lungs.Microbes Infect,2014,16(10):855-863.

    [9]Qi L,Xiangdong Z,Hongmei Y,et al.Regulation of neutrophil elastase-induced MUC5AC expression by nuclear factor erythroid-2 related factor 2 in human airway epithelial cells.J Investig Med,2010,58(5):730-736.

    Role of N-acetylcysteine in the MUC5AC mucin production of NCI-NCI-H292 cells

    Lin Xiaoping(Department of Respiratory Medicine,the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou 362000,China)

    0bjective:To demonstrate the role and underlying mechanism of N-acetylcysteine(NAC)in the regulation of airway MUC5AC mucin expression in NCI-H292 cell line.Methods:NCI-H292 cells divided into three groups:the control group,the model group(LPS)and the intervention groups(NAC+LPS).The intervention groups were pretreated with NAC for 30 min before exposure to LPS. The MUC5AC,Nrf2 mRNA levels were analyzed by Real time PCR,and protein production was assayed by Western blot.Results:Compared with the control group,expression of MUC5AC mucin was increased after being stimulated by LPS(P<0.05),but it was significantly inhibited by NAC(P<0.05).Conclusion:N-acetylcysteine suppresses MUC5AC hypersecretion by Nrf2 signaling pathway.

    N-acetylcysteine Mucus MUC5AC Nrf2 signaling pathway

    R 363

    B

    1672-8351(2016)11-0122-03

    △福建省自然科學基金資助(編號:2013J01289);福建省衛(wèi)生廳青年科研課題資助(編號:40935);福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院青年苗圃基金課題(編號:2012MP37)。

    猜你喜歡
    乙酰黏液半胱氨酸
    脲衍生物有機催化靛紅與乙酰乙酸酯的不對稱Aldol反應(yīng)
    分子催化(2022年1期)2022-11-02 07:11:08
    鞍區(qū)軟骨黏液纖維瘤1例
    會陰部侵襲性血管黏液瘤1例
    黏液型與非黏液型銅綠假單胞菌Cif基因表達研究
    西安地區(qū)同型半胱氨酸參考區(qū)間的初步建立
    黏液水腫性苔蘚1例
    HPLC測定5,6,7,4’-四乙酰氧基黃酮的含量
    反式-4-乙酰氨基環(huán)己醇催化氧化脫氫生成4-乙酰氨基環(huán)已酮反應(yīng)的研究
    同型半胱氨酸與慢性心力衰竭合并腎功能不全的相關(guān)性分析
    N-(取代苯基)-N′-氰乙酰脲對PVC的熱穩(wěn)定作用:性能遞變規(guī)律與機理
    中國塑料(2014年4期)2014-10-17 03:00:50
    亚洲国产精品成人久久小说| 波野结衣二区三区在线| 18在线观看网站| av片东京热男人的天堂| 久久国产亚洲av麻豆专区| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩电影二区| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲国产欧美在线一区| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲人成77777在线视频| 美女主播在线视频| 91精品国产国语对白视频| 韩国高清视频一区二区三区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 精品一区二区三区四区五区乱码 | 26uuu在线亚洲综合色| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产日韩欧美视频二区| 欧美精品高潮呻吟av久久| 波野结衣二区三区在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 中文字幕最新亚洲高清| 久久久久国产精品人妻一区二区| 精品人妻在线不人妻| 成人亚洲欧美一区二区av| 一区二区三区精品91| 夫妻午夜视频| 九色亚洲精品在线播放| kizo精华| 国产黄频视频在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 韩国高清视频一区二区三区| 国产精品不卡视频一区二区| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品一区二区免费观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久亚洲精品成人影院| 男女免费视频国产| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产一区亚洲一区在线观看| 日韩大片免费观看网站| 电影成人av| 国产成人免费观看mmmm| 黑人欧美特级aaaaaa片| 99久国产av精品国产电影| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日韩精品免费视频一区二区三区| 女人久久www免费人成看片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 少妇人妻久久综合中文| 国产男人的电影天堂91| 各种免费的搞黄视频| 桃花免费在线播放| 久久综合国产亚洲精品| 老司机影院成人| 丝瓜视频免费看黄片| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 最新中文字幕久久久久| 精品久久蜜臀av无| 日本av手机在线免费观看| 嫩草影院入口| 欧美人与性动交α欧美软件| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲三区欧美一区| 精品视频人人做人人爽| 在线天堂中文资源库| 2022亚洲国产成人精品| 欧美精品国产亚洲| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品日本国产第一区| 久久午夜福利片| 男人爽女人下面视频在线观看| 丝袜在线中文字幕| 亚洲欧美色中文字幕在线| 少妇被粗大的猛进出69影院| 在线天堂最新版资源| av有码第一页| 免费观看a级毛片全部| 精品久久蜜臀av无| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲精品av麻豆狂野| videossex国产| 久久久精品区二区三区| 国产日韩欧美亚洲二区| 一区二区三区四区激情视频| 波多野结衣一区麻豆| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品偷伦视频观看了| av免费在线看不卡| 国产国语露脸激情在线看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产人伦9x9x在线观看 | 欧美另类一区| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 黄色怎么调成土黄色| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲欧美清纯卡通| 一区二区三区激情视频| 午夜精品国产一区二区电影| 久热这里只有精品99| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产av精品麻豆| 老鸭窝网址在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲人成77777在线视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产在线免费精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 免费大片黄手机在线观看| 免费高清在线观看日韩| 人体艺术视频欧美日本| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 捣出白浆h1v1| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 午夜日本视频在线| 国产一区二区三区av在线| 一区二区三区精品91| 久久久久视频综合| 制服人妻中文乱码| 最近手机中文字幕大全| 韩国高清视频一区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一个人免费看片子| 午夜福利乱码中文字幕| 久久亚洲国产成人精品v| 色网站视频免费| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品成人在线| 中文字幕色久视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 九色亚洲精品在线播放| 国产成人欧美| 久久久久久人妻| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲国产看品久久| 精品酒店卫生间| 国产精品国产三级专区第一集| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品三级大全| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产午夜精品一二区理论片| 久久免费观看电影| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲国产最新在线播放| www.自偷自拍.com| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 免费观看性生交大片5| 777久久人妻少妇嫩草av网站| av线在线观看网站| 免费少妇av软件| 丝袜喷水一区| 久久这里有精品视频免费| 国产精品.久久久| 中文欧美无线码| 一级片'在线观看视频| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av综合色区一区| 秋霞伦理黄片| 男女免费视频国产| 女人精品久久久久毛片| 久久午夜福利片| 老熟女久久久| 国产在线免费精品| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 五月伊人婷婷丁香| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 一级a爱视频在线免费观看| 国产免费又黄又爽又色| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲av男天堂| 久久ye,这里只有精品| 色视频在线一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 国产日韩欧美视频二区| 成年女人在线观看亚洲视频| 黑丝袜美女国产一区| 最新中文字幕久久久久| av一本久久久久| 又黄又粗又硬又大视频| 久久久久久久国产电影| 91精品三级在线观看| av在线观看视频网站免费| xxx大片免费视频| 高清欧美精品videossex| 欧美成人午夜免费资源| 欧美av亚洲av综合av国产av | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 成人二区视频| 丝袜喷水一区| 国产不卡av网站在线观看| 五月开心婷婷网| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品 欧美亚洲| 9191精品国产免费久久| 性色av一级| 国产毛片在线视频| 丝袜美腿诱惑在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| av网站在线播放免费| 黄色毛片三级朝国网站| 免费黄色在线免费观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久婷婷青草| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 成年人黄色毛片网站| 久久久久久久久免费视频了| 在线观看66精品国产| 国产成人系列免费观看| 成人免费观看视频高清| 99香蕉大伊视频| av天堂久久9| 高清欧美精品videossex| 日韩成人在线观看一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲av五月六月丁香网| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 51午夜福利影视在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲专区字幕在线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美日韩乱码在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 高清欧美精品videossex| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 后天国语完整版免费观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 真人做人爱边吃奶动态| 嫩草影视91久久| 久久精品国产清高在天天线| 日韩av在线大香蕉| 男女高潮啪啪啪动态图| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产91精品成人一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产99白浆流出| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 男人操女人黄网站| 精品欧美一区二区三区在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲成人久久性| 久久久精品欧美日韩精品| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲欧美一区二区三区久久| 男女下面进入的视频免费午夜 | 女警被强在线播放| 日韩欧美在线二视频| 色综合婷婷激情| 国产深夜福利视频在线观看| videosex国产| 青草久久国产| 最新美女视频免费是黄的| 免费在线观看影片大全网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲一区二区三区不卡视频| 韩国精品一区二区三区| 久久久久久大精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 美女国产高潮福利片在线看| 他把我摸到了高潮在线观看| 大香蕉久久成人网| 精品第一国产精品| 成人av一区二区三区在线看| a级片在线免费高清观看视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品一区二区精品视频观看| avwww免费| 国产精品成人在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产成人影院久久av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 在线观看免费视频日本深夜| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产成人精品久久二区二区91| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产成人精品久久二区二区91| 久久伊人香网站| av免费在线观看网站| 久久中文看片网| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 91麻豆av在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 乱人伦中国视频| 国产精品日韩av在线免费观看 | 国产成人一区二区三区免费视频网站| 美国免费a级毛片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产午夜精品久久久久久| 99在线视频只有这里精品首页| 91在线观看av| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 岛国在线观看网站| 欧美在线黄色| 51午夜福利影视在线观看| 精品日产1卡2卡| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产99白浆流出| 国产欧美日韩一区二区三| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 一级毛片女人18水好多| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩三级视频一区二区三区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲片人在线观看| 欧美色视频一区免费| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲 国产 在线| 久久中文字幕人妻熟女| 日本三级黄在线观看| 亚洲成人久久性| 国产精品av久久久久免费| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲成人久久性| 亚洲熟妇熟女久久| 久久香蕉激情| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产精品综合久久久久久久免费 | www.自偷自拍.com| 日韩人妻精品一区2区三区| 丝袜美足系列| 亚洲精品一区av在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品高清国产在线一区| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 久久青草综合色| av天堂在线播放| 成人亚洲精品一区在线观看| 中出人妻视频一区二区| 激情在线观看视频在线高清| 男女床上黄色一级片免费看| 狂野欧美激情性xxxx| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 在线天堂中文资源库| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美黄色片欧美黄色片| 一级毛片女人18水好多| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 国产三级黄色录像| 亚洲精品av麻豆狂野| 啦啦啦 在线观看视频| 黄色a级毛片大全视频| 久久中文看片网| 久久热在线av| 亚洲久久久国产精品| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 91精品三级在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲av美国av| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久香蕉国产精品| netflix在线观看网站| 成在线人永久免费视频| 午夜福利影视在线免费观看| 在线看a的网站| 一边摸一边抽搐一进一出视频| cao死你这个sao货| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美日韩精品网址| 嫁个100分男人电影在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 青草久久国产| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲美女黄片视频| 亚洲avbb在线观看| 在线永久观看黄色视频| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲精品美女久久av网站| 黄色毛片三级朝国网站| 久久中文字幕一级| 曰老女人黄片| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品在线美女| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 极品人妻少妇av视频| 亚洲成人免费av在线播放| 精品久久蜜臀av无| 国产免费av片在线观看野外av| 在线播放国产精品三级| 国产真人三级小视频在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 精品人妻1区二区| 满18在线观看网站| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 精品一品国产午夜福利视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久99一区二区三区| av电影中文网址| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产野战对白在线观看| 69精品国产乱码久久久| 水蜜桃什么品种好| 日韩视频一区二区在线观看| 窝窝影院91人妻| 少妇被粗大的猛进出69影院| 久久久久九九精品影院| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 免费av毛片视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美性长视频在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 两个人看的免费小视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲男人天堂网一区| 黄色毛片三级朝国网站| 午夜亚洲福利在线播放| 成年女人毛片免费观看观看9| 在线看a的网站| 亚洲专区国产一区二区| 天堂中文最新版在线下载| a级毛片黄视频| www.www免费av| 悠悠久久av| 欧美色视频一区免费| 好男人电影高清在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲美女黄片视频| 高清在线国产一区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 黄色女人牲交| 首页视频小说图片口味搜索| 黄色女人牲交| 中文字幕av电影在线播放| 国产av精品麻豆| 欧美不卡视频在线免费观看 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 中文欧美无线码| 97碰自拍视频| 狂野欧美激情性xxxx| 黄色女人牲交| 一级毛片女人18水好多| 久久久久久久午夜电影 | 精品午夜福利视频在线观看一区| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 在线观看舔阴道视频| 久久99一区二区三区| 久久香蕉精品热| 操出白浆在线播放| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 狂野欧美激情性xxxx| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久 成人 亚洲| 天堂中文最新版在线下载| 久热爱精品视频在线9| 男人操女人黄网站| 新久久久久国产一级毛片| 成人亚洲精品av一区二区 | 国产精品野战在线观看 | 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 美女午夜性视频免费| 国产在线精品亚洲第一网站| 黄色视频,在线免费观看| 午夜激情av网站| 69精品国产乱码久久久| 搡老岳熟女国产| 中文字幕最新亚洲高清| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费日韩欧美在线观看| tocl精华| 亚洲国产精品999在线| 国产激情久久老熟女| 国产一卡二卡三卡精品| 日日夜夜操网爽| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲三区欧美一区| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产av一区二区精品久久| 日日爽夜夜爽网站| 69av精品久久久久久| 999精品在线视频| 性欧美人与动物交配| 少妇被粗大的猛进出69影院| 精品高清国产在线一区| 亚洲五月天丁香| 午夜精品国产一区二区电影| 成人亚洲精品av一区二区 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产成人影院久久av| 99久久人妻综合| 国产激情久久老熟女| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲一区中文字幕在线| 99精品久久久久人妻精品| 欧美在线黄色| 国产精品电影一区二区三区| 男女下面插进去视频免费观看| 黄色 视频免费看| 大码成人一级视频| 久久精品影院6| 免费日韩欧美在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲第一av免费看| 国产99久久九九免费精品| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲成人久久性| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久精品影院6| 色婷婷久久久亚洲欧美| 又大又爽又粗| 久久久久亚洲av毛片大全| 在线播放国产精品三级| 91成年电影在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 无人区码免费观看不卡| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 婷婷丁香在线五月| 国产精品二区激情视频| 午夜91福利影院| a级毛片在线看网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产精品永久免费网站| videosex国产| 久热爱精品视频在线9| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产xxxxx性猛交| 91老司机精品| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 久久久国产成人精品二区 | av电影中文网址| 国产精品偷伦视频观看了| 最好的美女福利视频网| 人人澡人人妻人| 日日干狠狠操夜夜爽| 纯流量卡能插随身wifi吗| 一级片'在线观看视频| 亚洲中文av在线| av免费在线观看网站| 亚洲欧美激情综合另类| 午夜免费观看网址| 亚洲欧美一区二区三区久久| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲国产精品sss在线观看 | 国产成人系列免费观看| 免费观看精品视频网站| 老鸭窝网址在线观看| 韩国精品一区二区三区| 色尼玛亚洲综合影院| 极品教师在线免费播放| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲av电影在线进入| 日本黄色视频三级网站网址| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲中文av在线| 在线观看免费视频日本深夜| 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品免费一区二区三区在线| 91九色精品人成在线观看| 69av精品久久久久久| 成人特级黄色片久久久久久久| 高清毛片免费观看视频网站 | 免费高清在线观看日韩| 午夜激情av网站| 黄色片一级片一级黄色片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 香蕉国产在线看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲av成人一区二区三| 欧美成狂野欧美在线观看| av欧美777| 午夜91福利影院| 波多野结衣一区麻豆| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产视频一区二区在线看| 成年女人毛片免费观看观看9| av有码第一页| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | www.自偷自拍.com| 精品第一国产精品| 人成视频在线观看免费观看| 韩国精品一区二区三区| 亚洲在线自拍视频| 69av精品久久久久久| 国产男靠女视频免费网站| 久久青草综合色| 又大又爽又粗| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕|