高效凝膠色譜法測(cè)定猴頭菇多糖分子量及含量

周春暉，周丹丹，劉婷婷，馬炳南

（廣東太陽(yáng)神集團(tuán)有限公司，廣東 廣州510665）

高效凝膠色譜法測(cè)定猴頭菇多糖分子量及含量

周春暉，周丹丹，劉婷婷，馬炳南

（廣東太陽(yáng)神集團(tuán)有限公司，廣東 廣州510665）

利用高效凝膠過濾色譜法（GFC），示差折光檢測(cè)猴頭菇子實(shí)體和猴頭菇口服液中的猴頭菇多糖的分子量和含量。通過建立不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品校正曲線，測(cè)定了猴頭菇多糖的分子量和分子量分布；以保留時(shí)間與猴頭菇多糖最接近的葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用峰面積外標(biāo)法定量測(cè)定猴頭菇多糖的含量。結(jié)果表明，猴頭菇子實(shí)體和猴頭菇口服液多糖數(shù)均分子量Mn均為1.6×104Da，重均分子量Mw均為1.7×104Da，分布寬D值在1.05～1.07范圍，重復(fù)良好。猴頭菇子實(shí)體多糖含量為0.66%，猴頭菇口服液多糖含量為37.1mg/100mL，方法學(xué)驗(yàn)證基本符合要求。

猴頭菇多糖；凝膠過濾色譜法（GFC）；分子量；含量

猴頭菇（Hericium erinaceus）是一藥膳兩用菌，性平、味甘。研究證明，其提取物對(duì)多種消化系統(tǒng)疾病如慢性胃炎、消化不良和胃潰瘍都具有較好的療效，同時(shí)猴頭菌還具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、降血糖和保護(hù)神經(jīng)等活性［1-7］。目前已廣泛應(yīng)用于藥品、保健食品及食品等領(lǐng)域，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和臨床試驗(yàn)的反復(fù)證明，猴頭菇的功效價(jià)值不斷地被挖掘出新的內(nèi)涵，在產(chǎn)品劑型上，在傳統(tǒng)的丸、片、湯劑基礎(chǔ)上開發(fā)出了口服液、浸膏、酒、粉劑、乳品、蛋糕、蜜餞、飲料、餅干等多種產(chǎn)品。其中猴頭菇口服液對(duì)胃黏膜損傷的保護(hù)功能尤為突出［8-9］。

一般認(rèn)為，猴頭菇的主要活性成分是多糖。除多糖外，猴頭菌還含有低聚糖甾醇類猴頭菌素和猴頭菌酮等生物活性物質(zhì)［10］，其中研究最多的、最引起人們注意的是猴頭菇多糖類物質(zhì)。猴頭菇中糖類物質(zhì)主要以多糖、糖蛋白、糖苷的形式存在［11］。關(guān)于猴頭菇多糖的組成，多數(shù)認(rèn)為是由葡萄糖、半乳糖、甘露糖組成，以葡萄糖為主，是由β（1→3）鍵連接的主鏈和β（l→6）鍵連接的支鏈構(gòu)成的葡聚糖［12-13］。多糖的活性，特別是抗腫瘤作用與其聚合度、分子量有關(guān)［14］，故掌握其多糖分子量和含量對(duì)猴頭菇運(yùn)用具有較強(qiáng)的科學(xué)依據(jù)。

真菌多糖的應(yīng)用價(jià)值已受到人們的關(guān)注，但其各方面的研究缺乏系統(tǒng)性，對(duì)活性起決定作用的結(jié)構(gòu)和機(jī)理的研究不夠深入，另外在哪種提取和分析方法是否靈敏適用方面缺乏相應(yīng)的參考［15］。傳統(tǒng)的多糖含量可用硫酸-酚法測(cè)定，蛋白含量用Lowry法測(cè)定，分子量的測(cè)定常采用超濾、沉降法等測(cè)定［16］，其操作方法比較繁瑣。高效凝膠過濾色譜法（GFC）因其快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，近年廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室中多糖的分子量和含量測(cè)定［17-18］。目前，香菇多糖、太子參多糖、白芨多糖、多花黃精多糖和甘草多糖等分子量及含量測(cè)定已有此類方法驗(yàn)證報(bào)道［19-23］。文獻(xiàn)表明［24-25］，猴頭菇多糖分子量及含量也可采用凝膠過濾色譜法進(jìn)行檢測(cè)，但暫無方法驗(yàn)證的系統(tǒng)報(bào)道。故本研究參考魏遠(yuǎn)安［26］、陳軼蘭［27］、Eliza Malinowska［25］等用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定多糖純度及分子量方法條件，對(duì)猴頭菇多糖分子量及含量進(jìn)行方法系統(tǒng)研究探討。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

猴頭菇子實(shí)體：購(gòu)于福建省古田縣吉發(fā)食用菌有限公司；猴頭菇口服液：廣東太陽(yáng)神集團(tuán)有限公司。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（1 g/支97%）：Flukar公司；無水乙醇、硫酸銅（五水）、檸檬酸鈉：廣州番禺力強(qiáng)化工廠；三氯乙酸、苯酚、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水硫酸鈉：廣州化學(xué)試劑廠；濃硫酸：衡陽(yáng)市凱信化工試劑有限公司；疊氮化鈉（含量大于99%）：成都化夏化學(xué)試劑有限公司。

銅貯存液：稱取3.0 g硫酸銅（五水），30.0檸檬酸鈉加水溶解至1 L，此溶液可貯存2周；銅應(yīng)用溶液：取銅貯存液50 mL，加水50 mL混勻后加入無水硫酸鈉12.5 g，臨用現(xiàn)配；銅洗滌液：取水50 mL，加入10 mL銅應(yīng)用溶液，10 mL 2.5 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻。除特殊要求外，所有試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀1260（示差折光檢測(cè)器）：Agilent公司；凝膠色譜柱（GPC）：TSK Gel 4000 SWXL；分析天平（感量0.1mg）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FW100型粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；LXJIIB型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；BMC110kz水浴鍋：上海錦屏儀器儀表有限公司；KQ-300E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公；20目篩（孔徑0.9 mm）：浙江乙達(dá)金屬砂篩廠。

1.3方法

1.3.1供試品溶液制備

猴頭菇子實(shí)體多糖樣品：粉碎后，過20目篩，稱取2.00 g，于50℃浸泡2 h，超聲波振蕩提取20 min，抽濾，收集濾液；殘?jiān)偌铀?0 mL，超聲波振蕩提取20 min，抽濾；合并兩次濾液，于90℃水浴濃縮至10 mL，冷卻至室溫，加30 mL無水乙醇（即乙醇濃度為75%）沉淀多糖；靜置過夜，于4 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀即為猴頭菇粗多糖。取其粗多糖，加10 mL水溶解，再加5 mL 33%乙醇沉淀大分子化合物，棄去沉淀；溶液再加5 mL 50%乙醇沉淀多糖。用5 mL水溶解沉淀，加入2.5 mol/L NaOH 5 mL，銅應(yīng)用溶液5 mL，混勻，在沸水浴中煮沸2 min，冷卻后以4 000 r/min離心5 min，棄去上清液；沉淀用銅洗滌液洗滌2次，加5%HCl乙醇溶液5 mL混合，4 000 r/min離心5 min，得沉淀為猴頭菇子實(shí)體中的多糖［28-30］。

猴頭菇口服液多糖樣品：直接采用75%醇沉方法得到，以上述乙醇分級(jí)沉淀和堿性銅試劑沉淀法純化［31-32］。

1.3.2對(duì)照溶液制備

分子量測(cè)定對(duì)照品溶液：稱取分子量分別為1.0× 103、5.0×103、1.20×104、2.50×104、5.00×104、8.00×104、1.50×105、2.70×105、4.100×105、6.70×105的一系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相配制成每種標(biāo)樣的質(zhì)量濃度約為1.0 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，將樣品用流動(dòng)相溶解，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，即得。

含量測(cè)定對(duì)照品溶液：稱取分子量為2.50×104葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，精確到0.000 1 g，用流動(dòng)相配制成濃度為0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 mg/mL的系列對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，即得。

1.3.3猴頭菇多糖分子量和含量測(cè)定色譜條件

色譜條件：TSKGel3000SWXL凝膠色譜柱，7.8mm× 300 mm；柱溫35℃；流動(dòng)相為0.025 mol/L NaH2PO4+ 0.025 mol/L Na2HPO4（pH=6.7）+0.05%NaN3；流速0.8mL/min；檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器（RID），恒溫35℃［26］。

1.3.4猴頭菇多糖分子量測(cè)定

1.3.4.1校正曲線的繪制

分別取一系列不同分子量的對(duì)照品溶液20 μL進(jìn)入凝膠色譜測(cè)試，根據(jù)其凝膠色譜的保留時(shí)間和分子量數(shù)據(jù)，建立多糖分子量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2分子量測(cè)定方法及重復(fù)性考察

取猴頭菇子實(shí)體和猴頭菇口服液樣品各6份，按照1.3.1中方法對(duì)多糖進(jìn)行提取和純化處理，得到猴頭菇子實(shí)體和猴頭菇口服液多糖沉淀，用5 mL水溶解并定容，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾，作為待測(cè)液，再按1.3.3色譜條件測(cè)定多糖的分子量。根據(jù)其保留時(shí)間和多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，計(jì)算猴頭菇子實(shí)體、猴頭菇口服液中多糖的分子量。

1.3.5猴頭菇多糖含量測(cè)定

1.3.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

進(jìn)行凝膠色譜分析。通過色譜峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。

1.3.5.2含量測(cè)定方法

將1.3.4.2處理好的猴頭菇子實(shí)體多糖和猴頭菇口服液多糖的待測(cè)液，進(jìn)行凝膠色譜測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)線性方程計(jì)算猴頭菇子實(shí)體、猴頭菇口服液中多糖的含量。

1.3.6猴頭菇多糖含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證

1.3.6.1精密度考察

取猴頭菇子實(shí)體、猴頭菇口服液樣品，各平行6份，按照1.3.1中方法對(duì)多糖進(jìn)行提取和純化處理，按1.3.3方法測(cè)定多糖含量，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.3.6.2回收率考察

取9份猴頭菇子實(shí)體樣品2.0 g，分別添加相當(dāng)于其猴頭菇多糖含量80%、100%、120%的分子量為2.50×104Da葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.1方法對(duì)多糖進(jìn)行提取和純化處理，用5 mL純化水溶解定容，上凝膠色譜測(cè)定其含量，平行測(cè)定3次；取猴頭菇口服液樣品10.0 mL，分別添加相當(dāng)于其猴頭菇多糖含量80%、100%、120%的分子量為2.50×104Da葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.1方法對(duì)多糖進(jìn)行提取和純化處理，用5 mL純化水溶解定容，上凝膠色譜測(cè)定其含量，平行測(cè)定3次。計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2　結(jié)果與分析

2.1猴頭菇多糖分子量測(cè)定

2.1.1校準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果中凝膠色譜的保留時(shí)間和分子量數(shù)據(jù)，建立多糖分子量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，如圖1、圖2所示。

圖1　葡聚糖標(biāo)樣的凝膠色譜（a）和多糖分子量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線（b）Fig.1　Gel chromatography of dextran standard（a）and standard calibration curve for molecular weight determination of polysaccharides（b）

圖2　猴頭菇子實(shí)體多糖的凝膠色譜（a）和猴頭菇口服液多糖的凝膠色譜（b）Fig.2　Gel chromatograms of Hericium erinaceus polysaccharide（a）and oral liquid prepared from Hericium erinaceus（b）

2.1.2猴頭菇多糖分子量及重復(fù)性

猴頭菇多糖分子量測(cè)定結(jié)果表明，猴頭菇子實(shí)體和猴頭菇口服液多糖數(shù)均分子量Mn均為1.6×104Da，重均分子量Mw均為1.7×104Da，分布寬（D）在1.05～1.07范圍，RSD值均小于1%，重復(fù)性良好。結(jié)果見表1，典型的猴頭菇子實(shí)體和猴頭菇口服液多糖見圖2。

表1　猴頭菇多糖的分子量及重復(fù)性Table 1　Molecular weight of hericium erinaceus polysaccharide and repeatability

2.2猴頭菇多糖含量測(cè)定的方法研究

2.2.1校準(zhǔn)曲線的繪制

選擇分子量為2.50×104Da的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)系列，通過色譜峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，多糖質(zhì)量濃度在0.1 mg/100 mL～10 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性，線性方程為y=354.9+1.926× 105x，相關(guān)系數(shù)為0.999 96，見圖3、圖4。

圖3　系列多糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的凝膠色譜圖Fig.3　Gel chromatogram of a series of polysaccharide standard

圖4　多糖含量校準(zhǔn)曲線Fig.4　Calibration curve of polysaccharide content

2.2.2猴頭菇多糖含量及重復(fù)性

根據(jù)峰面積外標(biāo)法進(jìn)行單點(diǎn)定量測(cè)定，猴頭菇子實(shí)體多糖含量為0.634%～0.679%，猴頭菇口服液多糖含量為36.4 mg/100 mL～37.9 mg/100 mL。結(jié)果見表2。

表2　猴頭菇多糖的含量及重復(fù)性Table 2　The content of polysaccharide of Hericium erinaceus and repeatability

2.3猴頭菇多糖含量方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1精密度考察

由表2可知，猴頭菇子實(shí)體和猴頭菇口服液多糖含量的RSD分別為2.46%和1.71%，可見含量精密度良好，儀器連續(xù)進(jìn)樣誤差小。

2.3.2回收率考察

根據(jù)猴頭菇多糖分子量試驗(yàn)結(jié)果顯示，校正曲線中分子量為2.50×104Da的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間與猴頭菇多糖最接近，故選擇其作為回收率加標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)樣品。猴頭菇多糖的回收率見表3。

表3　猴頭菇多糖的回收率（n=9）Table 3　Hericium erinaceus polysaccharide recovery rate（n=9）

由表3可知，猴頭菇子實(shí)體多糖含量的回收率在84.0%～86.8%之間，猴頭菇口服液多糖含量的回收率在86.7%～88.5%之間，鑒于重復(fù)性較好，為更準(zhǔn)確反映多糖的實(shí)際含量，故實(shí)際含量可以經(jīng)折算回收率后確定。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過利用高效凝膠過濾色譜法（GFC）配合示差折光檢測(cè)儀，以不同分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品系列繪制分子量曲線，通過猴頭菇分子量的檢測(cè)，得出其分子量的大致區(qū)間。試驗(yàn)結(jié)果表明，猴頭菇子實(shí)體和猴頭菇口服液多糖數(shù)均分子量Mn均為1.6×104Da，重均分子量Mw均為1.7×104Da，分布寬D在1.05～1.07范圍，重復(fù)良好。用猴頭菇多糖相對(duì)應(yīng)分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制含量校準(zhǔn)曲線，測(cè)得猴頭菇子實(shí)體多糖和猴頭菇口服液多糖含量分別為0.66%和37.1 mg/ 100 mL。同時(shí)，猴頭菇多糖的分子量和含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證均基本符合要求，獲得一個(gè)系統(tǒng)性的檢測(cè)方法。

本研究經(jīng)系統(tǒng)驗(yàn)證獲得的高效凝膠過濾色譜法和示差折光法測(cè)定猴頭菇多糖的分子量及含量，方法新穎、選擇性好、靈敏度高、重復(fù)性好。為一種靈敏適用的猴頭菇多糖檢測(cè)與分析方法提供理論基礎(chǔ)與操作指導(dǎo)，同時(shí)為以猴頭菇為原料的功能性保健食品或藥品的的開發(fā)提供基礎(chǔ)研究技術(shù)支持，使猴頭菇的深加工產(chǎn)業(yè)具有更廣泛的發(fā)展前景。

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Determination of Molecular Weight and Content of Hericium erinaceus Polysaccharide by High Performance Gel Chromatography

ZHOU Chun-hui，ZHOU Dan-dan，LIU Ting-ting，MA Bing-nan
（Guangdong Apollo Co.，Ltd.，Guangzhou 510665，Guangdong，China）

High performance gel filtration chromatography（GFC）and differential refraction detection were used to carry out the molecular weight and quantitive analysis on polysaccharide in the fruiting body of Hericium erinaceus and oral liquid prepared from Hericium erinaceus.A standard calibration curve was first established with different molecular weight dextran and determination of Hericium erinaceus polysaccharide molecular weight and its molecular weight distribution were performed.The retention time was used as the standard and the peak area external standard method was used to determine the content of polysaccharides of Hericium erinaceus. The results showed that polysaccharide of Hericium erinaceus fruiting body and Hericium erinaceus oral liquid had molecular weight 16 000 Da to 17 000 Da，and wide D distribution from 1.05 to 1.07.Polysaccharide content of the average was 0.66%in Hericium erinaceus fruiting body and 37.1 mg/100 mL in oral liquid.The validation of the method meets the basic requirements.

Hericium erinaceuspolysaccharide；gelfiltrationchromatography（GFC）；molecularweight；content

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.028

廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B090600008）

周春暉（1974—），女（漢），高級(jí)工程師，碩士，研究方向：保健食品的研究與開發(fā)。

2015-12-23