微膠囊造粒儀制備青春雙歧桿菌微膠囊

王歡，肖軍霞，黃國清，楊劍，*

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳518055；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

微膠囊造粒儀制備青春雙歧桿菌微膠囊

王歡1，肖軍霞2，黃國清2，楊劍2，*

（1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳518055；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

采用微膠囊造粒儀Encapsulator B-395 Pro制備青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）微膠囊，以多孔淀粉、海藻酸鈉、殼聚糖為壁材，以青春雙歧桿菌的包埋率為檢測指標(biāo)，研究多孔淀粉用量、包埋溫度、pH值和振蕩時間，以及海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度和CaCl2濃度對微膠囊包埋率的影響。結(jié)果表明，最佳工藝為：多孔淀粉用量按0.08 g/mL菌懸液和菌懸液混合，調(diào)節(jié)pH值為6.0，在30℃恒溫振蕩40min后和1.6%的海藻酸鈉混合，在微膠囊造粒儀中將混合液滴加到1.0%的CaCl2溶液中，固化成膜后，在0.75%的殼聚糖溶液中覆膜40min，洗滌，制得濕微膠囊，其包埋率可達到94.62%，活菌數(shù)為3.1×108cfu/mL。制得的青春雙歧桿菌微膠囊均為白色，粒徑分布均勻，粒徑為497.8 μm的濕膠囊占56.26%。

青春雙歧桿菌；微膠囊；制備

微膠囊造粒儀（Encapsulator B-395 Pro）的功能原理是高頻振動技術(shù)，振動噴嘴通過疊加振動將層流型流體噴射流分成尺寸相等的液滴，從而制造出極其均勻的圓形微膠囊。其操作簡單，可根據(jù)需求選擇不同尺寸的噴嘴，制備出0.15 mm～2 mm的微膠囊顆粒，尺寸統(tǒng)一、分布較窄（可實現(xiàn)＜5%標(biāo)準偏差）［1］。

微膠囊造粒儀可在溫和無菌條件下，利用反應(yīng)器進行細胞的生物微膠囊化。其與包埋混合物接觸的部件均可經(jīng)高溫高壓消毒，反應(yīng)容器可滿足無菌樣品制備的要求［2］。相比噴霧干燥法和擠壓法等傳統(tǒng)益生菌微膠囊制備方法，微膠囊造粒儀可在溫和條件下將藥物、香精香料、酶、顏料、微生物或動植物細胞包埋在聚合物基質(zhì)中［3-6］，形成顆粒均勻、粒徑適中的微膠囊，其穩(wěn)定高效的包埋效果得到了廣泛認可。

青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）是雙歧桿菌當(dāng)中很重要的一種，具有多種生理活性，但外界環(huán)境中許多不利的因素會導(dǎo)致青春雙歧桿菌死亡，降低了其生理活性。微膠囊作為雙歧桿菌的包埋技術(shù)手段之一，它常被用來提高雙歧桿菌在不良環(huán)境中的存活率并實現(xiàn)雙歧桿菌腸道釋放的目的。目前關(guān)于青春雙歧桿菌微膠囊的研究很少，對青春雙歧桿菌的研究主要集中于其耐氧性馴化及生理代謝機理研究。雙歧桿菌微膠囊的研究主要集中于兩歧雙歧桿菌微膠囊。鄒強等［7］以海藻酸鈉為壁材，采用乳化內(nèi)源凝膠法制備兩歧雙歧桿菌微膠囊，包埋效果不明顯，在模擬胃腸液中兩歧雙歧桿菌的活性下降了3個對數(shù)值。楊基礎(chǔ)等［8］采用擠壓法將海藻酸鈉與雙歧桿菌直接混合后滴入CaCl2中固化，制得雙歧桿菌微膠囊。該微膠囊不能很好地阻隔胃液，產(chǎn)品不具有耐胃酸性。

本文以多孔淀粉、海藻酸鈉、殼聚糖為壁材，以包埋效率為檢測指標(biāo)，研究了多孔淀粉添加量/mL菌懸液、作用溫度、pH值、作用時間以及海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、CaCl2濃度、菌懸液/海藻酸鈉質(zhì)量比對包埋率的影響，篩選出青春雙歧桿菌微膠囊最佳的制備條件，以期制備出外觀形狀和菌株活性良好的青春雙歧桿菌微膠囊，擴大其在食品領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

海藻酸鈉、殼聚糖、TPY培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、無水氯化鈣、多孔淀粉、氫氧化鈉、檸檬酸鈉、冰醋酸、鹽酸、L-半胱氨酸：均為分析純；青春雙歧桿菌（GIMI. 278）：購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

1.2儀器

B-395 Pro微膠囊造粒儀：瑞士步琦有限公司；95-1磁力攪拌器：Barnsteed International；ES-315高壓滅菌器：TOMY Corporation；SPX-150細菌恒溫培養(yǎng)箱、SHZ-C恒溫振蕩培養(yǎng)箱：Sheldon Manufacturing，Inc.；PB-10pH計：Sartorius；5810R高速離心機：Eppendorf；XW-80A漩渦混合器：上海醫(yī)大儀器廠；DHE-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；BS 224S電子天平：Sartorius；BCD-518WSA海爾低溫冰柜：海爾集團；激光MICROTRACS3500粒度分析儀：美國Microtrac公司。

1.3方法

1.3.1菌懸液的制備

挑取復(fù)蘇培養(yǎng)好的雙歧桿菌菌落接種于20 mL TPY液體培養(yǎng)基中，并在37℃下厭氧培養(yǎng)24 h，然后按1.0%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL的TPY液體培養(yǎng)基中在厭氧條件下進行增殖培養(yǎng)，12 h后，將菌懸液在4℃、8 000 r/min的條件下離心10 min，去上清，菌泥用無菌的NaCl溶液（8.5 g/L）洗滌兩次后，重懸于10 mL的無菌水中得到濃縮菌液，最后利用平板計數(shù)法對該濃縮菌液進行精確計數(shù)［9-11］。

1.3.2微膠囊的制備

稱取一定量的多孔淀粉于微膠囊造粒儀配備的耐壓玻璃瓶中，加入50 mL菌懸液（2×109cfu/mL），用0.1 mol/L NaOH、HCl溶液調(diào)pH值，在不同水浴作用溫度下振蕩吸附一定時間后和海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻后，用微膠囊造粒儀（300 μm噴嘴）經(jīng)高頻振蕩滴加到一定濃度的無菌CaCl2溶液中，固化30 min成膜。用3.5%CaCl2溶液浸泡10 min進行硬化［12-13］。過濾得到樣品，用去離子水漂去樣品表面的CaCl2殘液，再用0.85%的無菌生理鹽水洗滌微膠囊表面菌體。將收集到的微膠囊在攪拌速度為600 r/min的情況下加入到殼聚糖溶液中覆膜40 min［14］后洗滌2次，4℃保存。最后，將微膠囊經(jīng)冷凍干燥后制得微膠囊凍干品。

1.3.3青春雙歧桿菌微膠囊包埋產(chǎn)率的測定

將制備得到的濕微膠囊加入到100 mL預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液中（37℃，0.1 mol/L NaH2PO4，pH 7.4），通過高速均質(zhì)機破碎微膠囊（10 000 r/min，20 s），緩慢搖晃此破碎液30 min，使包埋的青春雙歧桿菌完全釋放出來，取一定量的液體，經(jīng)稀釋后，采用稀釋平板計數(shù)法，將液體涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基上，然后在37℃、厭氧條件下培養(yǎng)48 h后，計算菌落總數(shù)［15］。

包埋率（Encapsulation Yield，EY）計算公式如下所示：EY/%＝N/N0×100

式中：N是指包埋于微膠囊中的活細胞總數(shù)；N0是菌懸液中活細胞總數(shù)。

2　結(jié)果與分析

海藻酸鈉分子中含有的自由羧基和羥基，可以和二價陽離子（Ca2+、Zn2+）結(jié)合形成凝膠，4個古洛糖醛酸殘基和Ca2+連接形成一種三維結(jié)構(gòu)―“雞蛋箱”結(jié)構(gòu)。海藻酸鈉和二價陽離子形成的這一結(jié)構(gòu)是一種pH敏感型凝膠，在低pH條件下較為穩(wěn)定，這種特性有利于減少胃酸對菌株活性的損傷，從而增強包埋的雙歧桿菌對胃酸的耐受能力。

殼聚糖是一種由葡萄糖胺組成的線性高分子化合物。在陰離子和聚陰離子存在的條件下，葡萄糖胺通過交叉連接的方式聚合。用海藻酸鈉和殼聚糖來包埋雙歧桿菌可以使雙歧桿菌在一定程度上增強抗逆環(huán)境的能力。

2.1多孔淀粉用量對微膠囊包埋率的影響

多孔淀粉是指具有生淀粉酶活力的酶在低于淀粉糊化溫度下作用于生淀粉后而形成一種蜂窩狀多孔性淀粉載體，是一種具有良好安全性的有機吸附劑［16］。在溫度25℃、pH值5.5、振蕩時間30 min、海藻酸鈉濃度1.2%、殼聚糖濃度0.5%、CaCl2濃度1.0%條件下，多孔淀粉用量分別為0.04、0.06、0.08、0.1、0.12 g/mL菌懸液時的微膠囊包埋率如圖1所示。

圖1　多孔淀粉用量對微膠囊包埋率的影響Fig.1　Effect of porous starch dosage on EY of Bifidobacterium adolescentis microcapsules

由圖1可知，包埋率隨著多孔淀粉用量的增加呈先升高后降低而逐漸趨于穩(wěn)定的變化趨勢。多孔淀粉用量在0.08 g/mL菌懸液時，包埋率最大達到66.57%，此時濕膠囊中活菌數(shù)為2.35×108cfu/mL，與多孔淀粉用量為0.04、0.06、0.1 g/mL菌懸液時呈顯著性差異（P＜0.05）。這主要是因為多孔淀粉顆粒的孔洞對青春雙歧桿菌有一定的容納數(shù)量（飽和度），當(dāng)多孔淀粉添加量足以將菌懸液內(nèi)的青春雙歧桿菌吸附后，再添加多孔淀粉也不會增加微膠囊的包埋率。此外，增加多孔淀粉用量會造成微膠囊的團聚，使制備的微膠囊樣品難以分離。馬嫄等［12］的研究結(jié)果表明，包埋嗜酸乳桿菌所需要的多孔淀粉用量為0.10 g/mL菌懸液，該結(jié)果與本試驗基本吻合。

2.2多孔淀粉作用溫度對微膠囊包埋率的影響

在淀粉用量0.08 g/mL菌懸液、pH值5.5、振蕩時間30 min、海藻酸鈉濃度1.2%、殼聚糖濃度0.5%、CaCl2濃度1.0%條件下，多孔淀粉作用溫度對微膠囊包埋率的影響見圖2。

圖2　多孔淀粉作用溫度對微膠囊包埋率的影響Fig.2　Effect of porous starch temperature on EY of microcapsules

由圖2可知，從20℃開始，隨著溫度的增加，微膠囊的包埋率先增加后減小。在25℃到35℃之間趨于穩(wěn)定，包埋率分別是67.28%、68.35%、67.80%，此時濕膠囊中的活菌數(shù)分別是2.54×108、2.58×108、2.56× 108cfu/mL，相互之間差異不顯著（P>0.05）。當(dāng)溫度升高到40℃時，包埋率會降低，這可能是青春雙歧桿菌部分失活，從而能導(dǎo)致測定的包埋率下降［17］。

2.3多孔淀粉作用pH值對微膠囊包埋率的影響

在淀粉用量0.08 g/mL菌懸液、溫度35℃、振蕩時間30 min、海藻酸鈉濃度1.2%、殼聚糖濃度0.5%、CaCl2濃度1.0%條件下，pH對微膠囊包埋率的影響見圖3。

圖3　多孔淀粉作用pH值對微膠囊包埋率的影響Fig.3　Effect of porous starch pH on EY of Bifidobacterium adolescentis microcapsules

由圖3可知，微膠囊的包埋率隨著pH值的增加呈先增加后減小的變化趨勢。在pH6.0時包埋率最大達到71.79%，活菌數(shù)達到2.55×108cfu/mL，并與其它pH時包埋率均具有顯著性差異（P＜0.05）。這可能是pH值過低或過高都會使青春雙歧桿菌失活，從而導(dǎo)致測定的青春雙歧桿菌微膠囊的包埋率下降［18］。

2.4多孔淀粉振蕩時間對微膠囊包埋率的影響

在淀粉用量0.08 g/mL菌懸液、溫度35℃、pH值6.0、海藻酸鈉濃度1.2%、殼聚糖濃度0.5%、CaCl2濃度1.0%條件下，多孔淀粉振蕩吸附時間對微膠囊包埋率的影響見圖4。

圖4　多孔淀粉振蕩時間對微膠囊包埋率的影響Fig.4　Effect of porous starch shaking time on EY of Bifidobacterium adolescentis microcapsules

由圖4所示，微膠囊包埋率隨著振蕩時間的延長呈先增加后減小變化趨勢。在振蕩時間為40 min時，包埋率達到最大75.85%，此時濕膠囊中的活菌數(shù)為2.59×108cfu/mL，與其它振蕩時間的包埋率具有顯著性差異（P＜0.05）。主要原因可能是多孔淀粉包埋青春雙歧桿菌主要是靠吸附力，適當(dāng)延長振蕩時間增加了菌種與多孔淀粉充分接觸的幾率［12］，從而提高了青春雙歧桿菌的包埋率；40 min之后多孔淀粉開始崩解，且青春雙歧桿菌逐漸失活，從而導(dǎo)致微膠囊的包埋效率開始減小。

2.5正交試驗

多孔淀粉正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

表1　多孔淀粉正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1　Orthogonal array design matrix and results of porous starch

由表1可知，多孔淀粉各因素對微膠囊包埋率影響的主次順序依次為多孔淀粉用量A>pH值C>振蕩時間D>包埋溫度B，根據(jù)正交試驗結(jié)果可知，多孔淀粉的最佳包埋條件為：A1B2C2D2，即多孔淀粉用量0.08 g/mL菌懸液，包埋溫度為30℃，pH值為6.0，振蕩時間40 min，按此工藝測得的微膠囊包埋率為75.31%，菌懸液活菌數(shù)1.29×108cfu/mL，經(jīng)包埋之后的微膠囊內(nèi)的活菌數(shù)為2.45×108cfu/mL。

2.6海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋率的影響

海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋率的影響見圖5。

由圖5可知，隨海藻酸鈉濃度的增加，微膠囊的包埋率先增加后減小。在海藻酸鈉濃度為1.6%時，微膠囊的包埋率最大達到85.96%，并與其它濃度時的包埋率均呈顯著性差異（P＜0.05）。此時當(dāng)菌懸液活菌濃度為1.27×109cfu/mL時，濕微膠囊包埋的活菌數(shù)為2.84×108cfu/mL。主要的原因是不同濃度的海藻酸鈉與Ca2+和殼聚糖的絡(luò)合程度不一樣，形成的微膠囊囊壁緊密程度不同，導(dǎo)致微膠囊的透氧程度也不同，從而使青春雙歧桿菌微膠囊的包埋率不同［19］。

2.7殼聚糖濃度對微膠囊包埋率的影響

殼聚糖濃度對微膠囊包埋率的影響見圖6。

圖6　殼聚糖濃度對微膠囊包埋率的影響Fig.6　Effect of chitosan concentration on EY of Bifidobacterium adolescentis microcapsules

由圖6可知，在0.25%～1.25%之間，隨著殼聚糖濃度的增加，微膠囊的包埋率先增加，在0.75%時達到最大91.48%，此時濕微膠囊中包埋的活菌數(shù)為2.87×108cfu/mL；繼續(xù)增加殼聚糖濃度，包埋率趨于穩(wěn)定稍有減小，殼聚糖濃度1.25%時，包埋率為91.15%，活菌數(shù)2.81×108cfu/mL。主要原因是：殼聚糖溶液濃度會影響到殼聚糖分子擴散的快慢，進而影響成膜效果，對微膠囊的性能產(chǎn)生影響。殼聚糖濃度增加，殼聚糖分子的擴散推動力增大，NH3+的位點數(shù)增加，殼聚糖與海藻酸鈉的交聯(lián)程度也越強，微膠囊膜通透性降低，減少了外環(huán)境對微膠囊內(nèi)菌體的傷害［20］。殼聚糖溶液濃度增加其黏度也會變大，當(dāng)溶液濃度達到一定程度時其流變性能也會發(fā)生改變，殼聚糖分子擴散緩慢，殼聚糖與海藻酸鈉的交聯(lián)作用也相應(yīng)變?nèi)酰⒛z囊透氧性增加，從而導(dǎo)致包埋效率稍有減小。殼聚糖濃度0.75%、1.0%、1.25%之間的微膠囊包埋率差異不顯著（P>0.05），考慮經(jīng)濟節(jié)約因素，選擇殼聚糖濃度為0.75%。

2.8CaCl2濃度對微膠囊包埋率的影響

CaCl2濃度對微膠囊包埋率的影響見圖7。

圖7　CaCl2濃度對微膠囊包埋率的影響Fig.7　Effect of CaCl2concentration on EY of Bifidobacterium adolescentis microcapsules

由圖7可知，在CaCl2濃度為0.5%～2.5%之間，隨著CaCl2濃度的增加，微膠囊的包埋率呈現(xiàn)先增加后降低然后趨于穩(wěn)定的變化趨勢。在CaCl2濃度為1.0%時包埋率達到最大值94.62%，此時濕膠囊中的活菌數(shù)為3.1×108cfu/mL。CaCl2濃度為1.0%和其它濃度之間的微膠囊包埋效率存在顯著性差異（P＜0.05）。主要原因是：海藻酸鈉中的Na+被適量的Ca2+取代形成“egg-box”結(jié)構(gòu)，但是當(dāng)CaCl2濃度較低或過高時導(dǎo)致微膠囊內(nèi)部的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分布不均［21］，從而表現(xiàn)為微膠囊中所含菌數(shù)的差異，故選擇最佳的CaCl2濃度為1.0%。

2.9青春雙歧桿菌微膠囊表面特征

青春雙歧桿菌微膠囊粒徑分布均勻。濕膠囊的粒徑分布情況如圖8所示。

圖8　青春雙歧桿菌濕微膠囊粒徑分布Fig.8　Size distribution of wet Bifidobacterium adolescentis microcapsules

粒徑主要分布在418.6 μm～704.0 μm之間，粒徑為497.8 μm的濕膠囊占56.26%，粒徑為592.0 μm的濕膠囊則占樣品的31.08%，704.0 μm的濕膠囊占樣品數(shù)的5.86%，出現(xiàn)這種情況的主要原因是：在制備過程中，為了保證液滴的分散性，需要適當(dāng)調(diào)節(jié)微膠囊造粒儀的振蕩頻率及進樣口的壓力，從而導(dǎo)致了粒徑會有所不同。

圖9是單反相機拍攝的青春雙歧桿菌微膠囊濕膠囊的的形態(tài)特征照片，粒徑分布均勻，成白色顆粒。

圖10是濕微膠囊在普通顯微鏡下的外部形態(tài)，海藻酸鈉和殼聚糖在外部形成一層囊壁，將吸附有雙歧桿菌的多空淀粉顆粒包埋在微膠囊內(nèi)部。

圖9　青春雙歧桿菌微膠囊濕膠囊Fig.9　Wet Bifidobacterium adolescentis microcapsules

圖10　普通顯微鏡下濕青春雙歧桿菌微膠囊Fig.10　Optical microphotograph of wet Bifidobacterium adolescentis microcapsules

3　結(jié)論

本文研究了利用微膠囊造粒儀制備青春雙歧桿菌微膠囊的工藝條件，以青春雙歧桿菌微膠囊的包埋效率為研究指標(biāo)，考察了多孔淀粉用量、作用溫度、pH值、振蕩時間，海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、CaCl2濃度、菌懸液/海藻酸鈉體積比等因素對微膠囊的影響，并對其影響機理做了初步分析，同時觀察了微膠囊的外部形態(tài)。

用微膠囊造粒儀制備青春雙歧桿菌微膠囊的最佳工藝條件為：多孔淀粉用量為0.08 g/mL菌懸液，包埋溫度為30℃，pH值為6.0，振蕩時間40 min，海藻酸鈉濃1.6%，殼聚糖濃度0.75%，CaCl2濃度1.0%，按此工藝參數(shù)制備的微膠囊，濕膠囊中青春雙歧桿菌的包埋率為94.62%，此時濕膠囊中的活菌數(shù)為3.1× 108cfu/mL制備的青春雙歧桿菌微膠囊粒徑均勻，粒徑主要分布在418.6μm～704.0μm之間，粒徑為497.8 μm的濕膠囊占56.26%，粒徑為592.0 μm的濕膠囊則占樣品的31.08%。

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Studies on Preparation of Bifidobacterium adolescentis Microcapsules Using Encapsulator B-395 Pro

WANG Huan1，XIAO Jun-xia2，HUANG Guo-qing2，YANG Jian2，*
（1.School of Applied Chemistry and Biological Technology，Shenzhen Polytechnic，Shenzhen 518055，Guangdong，China；2.College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

In this research，Bifidobacterium adolescentis microcapsules based on porous starch，sodium alginate and chitosan had been prepared by Encapsulator B-395.The microcapsules EY was considered as the standard.The porous starch concentration，temperature，pH，shaking time and the sodium alginate concentration，chitosan concentration，CaCl2concentration，bacterium culture/sodium alginate were searched.The results were：porous starch concentration was 0.08 g/mL bacterium culture，temperature was 30℃，pH was 6.0，shaking time was 40 min，sodium alginate was 1.6%，chitosan concentration was 0.75%，CaCl2concentration was 1.0%.The maximum EY was 94.62%，3.1×108cfu/mL.The color of capsules was white.The rate of 497.8 μm wet microcapsules was 56.26%.

Bifidobacterium adolescentis；microcapsule；preparation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.021

深圳市科技研發(fā)資金基礎(chǔ)研究計劃（JCYJ2013033115120 4151）

王歡（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：功能性食品。

楊劍（1965—），男，教授。

2012--