PNU282987對(duì)異丙腎上腺素所致小鼠心臟重塑的保護(hù)作用

方歡樂(lè)，張颯樂(lè)，馬懷芬，鄧文丹，韓寧娟，楊永華

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PNU282987對(duì)異丙腎上腺素所致小鼠心臟重塑的保護(hù)作用

方歡樂(lè)1，張颯樂(lè)1，馬懷芬1，鄧文丹1，韓寧娟1，楊永華2*

目的 通過(guò)建立異丙腎上腺素所致小鼠心臟重塑模型，觀(guān)察PNU282987保護(hù)心臟的作用。方法 連續(xù)7 d皮下注射異丙腎上腺素(ISO)，誘導(dǎo)小鼠心臟重塑模型，同時(shí)腹腔給予PNU282987，檢測(cè)小鼠心臟重量指數(shù)、血清乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的活性，觀(guān)察心肌病理形態(tài)學(xué)的改變；檢測(cè)心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量，通過(guò)Western blot測(cè)定誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，異丙腎上腺素組心臟重量指數(shù)增加，血清LDH和CK水平顯著升高，心肌SOD活性下降，MDA含量增加，心肌組織中iNOS蛋白表達(dá)增加；與模型組比較，PNU282987可顯著降低心臟重量指數(shù)、血清LDH和CK水平，增加心肌SOD活性，降低心肌MDA含量，下調(diào)iNOS表達(dá)。結(jié)論 PNU282987可能通過(guò)清除氧自由基，降低iNOS的表達(dá)，保護(hù)異丙腎上腺素導(dǎo)致的小鼠心臟重塑。

PNU282987；異丙腎上腺素；心臟重塑；抗氧化；iNOS

0 引言

心臟重塑是多種心血管系統(tǒng)疾病(如高血壓、冠心病、心臟瓣膜病、先天性心臟病、心肌炎癥等)的常見(jiàn)并發(fā)癥和病理基礎(chǔ)[1]。盡管早期重塑是一種代償反應(yīng)，但持續(xù)存在就會(huì)逐漸發(fā)展為失代償，導(dǎo)致嚴(yán)重的心律失常、心力衰竭[2]。因此，防治心臟重塑的研究具有重要的臨床意義。

研究證實(shí)，心室重塑的發(fā)生與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[3-4]。氧化應(yīng)激的發(fā)生使得體內(nèi)氧化與抗氧化作用失去平衡，產(chǎn)生了大量氧化中間產(chǎn)物，直接影響心臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損傷[5]。目前，抗氧化應(yīng)激改善心臟功能有其臨床意義。一氧化氮(NO)是體內(nèi)一種重要的生理功能調(diào)節(jié)物質(zhì)，是由一氧化氮合酶(NOS)催化產(chǎn)生。NOS有2種類(lèi)型，原生型一氧化氮合酶(eNOS)在低水平調(diào)控NO，參與體內(nèi)多種生理功能調(diào)節(jié)；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在各種致病因素誘導(dǎo)下，催化高水平NO的產(chǎn)生，參與多種疾病的病理過(guò)程[6]，在多種原因的心臟損傷過(guò)程中起重要作用[7]。所以抑制iNOS可以減輕心肌的病理改變，保護(hù)心臟。

近年研究發(fā)現(xiàn)，提高迷走神經(jīng)張力對(duì)心臟具有保護(hù)作用，其釋放遞質(zhì)ACh是心臟重塑的重要調(diào)節(jié)因子[8]。PNU282987是特異性的α7nAChR激動(dòng)劑，研究主要集中在興奮膽堿能抗炎通路中。但PNU282987是否可以通過(guò)抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)iNOS蛋白活性改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟重塑未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在觀(guān)察PNU282987對(duì)異丙腎上腺素所致小鼠心臟重塑損傷的影響，為藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 昆明種雄性小鼠，體重(25±2)g，清潔級(jí)，購(gòu)于西安交通大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物的質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(陜)2010-001。

1.2 藥品和試劑 PNU282987、異丙腎上腺素(美國(guó)Sigma公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；多克隆第一抗體iNOS購(gòu)自abcm公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 iMark全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Red公司)；CKX4熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；DYY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠(chǎng))；UVmini-1240紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；JA10003B大量程電子精密天平(上海精密儀器公司)。

2 方法

2.1 異丙腎上腺素致小鼠心室重塑模型 采用異丙腎上腺素皮下注射，建立心室重塑的小鼠模型，給藥劑量：30 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥7 d。

2.2 分組及給藥 小鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只。①對(duì)照組：小鼠每天給生理鹽水，連續(xù)7 d；②異丙腎上腺素模型組(ISO組)：ISO 30 mg/(kg·d)溶解在生理鹽水中，小鼠皮下注射ISO，連續(xù)7 d；③PNU282987藥物組(PNU282987組)：小鼠腹腔注射PNU 3 mg/(kg·d)，30 min后皮下注射ISO，連續(xù)給藥10 d。

2.3 小鼠心臟標(biāo)本形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取左室近心尖一半處心肌組織(先用15%甲醛溶液固定組織，再經(jīng)過(guò)石蠟包埋、切片)進(jìn)行HE染色。觀(guān)察心肌組織病理學(xué)改變。

2.4 小鼠血清LDH、CK活性測(cè)定 小鼠經(jīng)過(guò)眼球取血，收集血液1 mL，放置離心機(jī)中，3 600 r/min離心10 min，分離血清，按廠(chǎng)家提供的試劑盒使用說(shuō)明，測(cè)定LDH、CK的活性。

2.5 小鼠心肌SOD活性和MDA含量測(cè)定 取出心臟，切約80 mg，把心肌組織放入盛PBS溶液的燒杯中，在冰下將其制備成5%的勻漿液，放置于離心機(jī)中，3 600 r/min離心15 min，取上清液，采用黃嘌呤氧化酶法在550 nm測(cè)定SOD含量，用硫代巴比妥酸法在532 nm處測(cè)定MDA含量。

2.6 Western blot分析檢測(cè)iNOS表達(dá) 取各組心臟組織加入RIPA(碧云天，中國(guó)江蘇)裂解液裂解，然后用離心機(jī)4 ℃離心12 000 r/min。上清蛋白濃度用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(碧云天)檢測(cè)。等量蛋白用品(20 μg)用8%SDS-多聚酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至聚偏乙烯二氟化物膜上(PVDF；Millipore，Billerica，MA)。膜用5%、8%脫脂牛奶或3% BSA TBST(25 mM Tris-HCl，150 mM NaCl+0.2% Tween-20)溶液室溫封閉1～3 h后，加入特異性抗體室溫孵育1～2 h，4 ℃過(guò)夜。抗體一抗?jié)舛染鶠?∶1 000。在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合二抗(抗小鼠1∶5 000)室溫孵育30～40 min前后，膜用TBST洗滌5次。條帶用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑(Millipore)發(fā)光獲得，并用Gel-Pro Analyzer 4.0 software(Media Cybernetics，Bethesda，MD)分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 PNU282987對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟重塑小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)的影響 小鼠連續(xù)皮下注射異丙腎上腺素7 d后，與對(duì)照組相比，ISO組心臟質(zhì)量指數(shù)升高；給予PNU282987可抑制小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)的增加，與ISO組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明PNU282987可抑制異丙腎上腺素引起的心室重塑，見(jiàn)表1。

表1 三組小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)比較

注：與ISO組比較，**P<0.01

3.2 PNU282987對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟重塑小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響 心肌HE染色顯示，正常組心肌細(xì)胞排列致密，間質(zhì)細(xì)胞無(wú)增生；模型組心肌細(xì)胞肥厚改變，心肌細(xì)胞體積增大，呈圓形或類(lèi)圓形；PNU282987組細(xì)胞排列較整齊，間質(zhì)未見(jiàn)明顯增生，顯示心肌損害的情況較模型組減輕。見(jiàn)圖1。

3.3 PNU282987對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)心臟重塑小鼠血清CK、LDH的影響 由表2所示，ISO組血清CK、LDH高于對(duì)照組、PNU282987組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明PNU282987能顯著降低小鼠血清CK 的含量，抑制LDH的含量。

3.4 PNU282987對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)心室重塑小鼠心肌中SOD、MDA含量的影響 與對(duì)照組比較，ISO組小鼠心臟組織中SOD含量下降(P<0.05)、MDA含量明顯增加(P<0.05)；而PNU282987組較ISO組小鼠心肌組織中的SOD含量升高、MDA含量降低，與ISO組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

組別只數(shù)CKLDH對(duì)照組10742.22±104.39**655.00±151.99*ISO組10888.81±79.37794.45±93.89PNU282987組10694.88±137.09**639.00±186.73*

注：與ISO組比較，*P<0.05，**P<0.01

表3 三組小鼠心肌組織中SOD、MDA比較

注：與ISO組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.5 PNU282987對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)心室重塑小鼠心肌組織中iNOS的表達(dá) 用Western blot法檢測(cè)小鼠心肌組織中iNOS的表達(dá)，結(jié)果顯示，ISO組iNOS的表達(dá)顯著增加，而PNU282987組iNOS含量的表達(dá)明顯低于ISO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，PNU282987可以有效抑制異丙腎上腺素所導(dǎo)致的心肌組織中iNOS的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

4 結(jié)論

心臟重塑是多種心血管疾病發(fā)展的一個(gè)重要階段[9-11]。ISO為β受體激動(dòng)劑，其對(duì)心肌的作用可使心率加快、心肌收縮力增強(qiáng)、心肌細(xì)胞肥大、膠原纖維增生，形成心室重塑[12]。本研究顯示，異丙腎上腺素連續(xù)皮下注射7 d后，小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)增加，心肌細(xì)胞體積增大，血液中CK和LDH升高。PNU282987可抑制ISO導(dǎo)致的小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)和心肌細(xì)胞體積的增加，降低血液中CK、LDH，保護(hù)損傷的心臟。

圖2 PNU對(duì)心肌組織中iNOS蛋白表達(dá)

在以往對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心室重構(gòu)模型研究中，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激部分參與了異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心室重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展[13]。心肌的損傷導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生，使得機(jī)體內(nèi)ROS產(chǎn)生過(guò)多或發(fā)生代謝障礙，超過(guò)了體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)作用，誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，使得脂質(zhì)過(guò)氧化的主要終產(chǎn)物MDA增加，而心肌組織內(nèi)重要的抗氧化物酶SOD活性降低。測(cè)定SOD活性和MDA含量可間接反映氧化應(yīng)激的程度[14]。本研究顯示，ISO誘導(dǎo)的心臟重塑模型中，MDA含量明顯增加，SOD含量降低。用PNU282987治療后，心肌中SOD活性增加，MDA含量降低。表明PNU282987用藥后可改善心肌中氧自由基水平及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，具有抗氧化的生物學(xué)效應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)，iNOS在細(xì)胞受到刺激而被激活后，可以持續(xù)合成高水平的NO，參與多種病理生理過(guò)程，減弱心肌收縮力而損傷心臟[15]。本研究結(jié)果表明，ISO所致小鼠心臟重塑模型中iNOS活性顯著增強(qiáng)，而PNU282987可以降低iNOS的表達(dá)。表明PNU282987對(duì)于ISO誘導(dǎo)的小鼠心臟重塑的抑制作用可能與下調(diào)iNOS表達(dá)相關(guān)，而其具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心室重塑破壞了氧自由基水平的平衡，提高了iNOS的活性。而PNU282987可以提高SOD含量，降低MDA含量，下調(diào)iNOS的表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心臟重塑。

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Protective effect of PNU282987 on isoproterenol-induced cardiac remodeling in mice

FANG Huan-le1,ZHANG Sa-le1,MA Huai-fen1,DENG Wen-dan1,HAN Ning-juan1,YANG Yong-hua2*(1.Xi′an Peihua University,Xi′an 710025,China;2.the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University,Xi′an 712000,China)

Objective To establish the mice cardiac remodeling model in mice and observe the protective effect of PNU282987.Methods Cardic remodeling model of mice was induced by subcutaneous injection of isoproterenol for 7 d,then the mices were intraperitoneally injected PNU282987.The heart weight index,serum lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) activity were measured and the myocardical tissue morphology changes were observed.The content of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in myocardial tissue was measured,and the expression of induced nitric oxide synthase (iNOS) was detected by using Western blot method.Results Compared with control group,the heart weight index,levels of serum LDH and CK,the content of MDA and the iNOS protein expression in myocardial tissue in ISO group were increased,and the activity of SOD was reduced.Compared with model group,PNU282987 could significantly decrease the cardiac weight index,serum LDH and CK levels and the content of myocardial MDA,and increase myocardial SOD activity,while the expression of iNOS was down-regulated.Conclusion PNU282987 can down-regulate the expression of iNOS by clearing the oxidative stress,and protect the cardiac remodeling induced by isoprenaline in mice.

PNU282987;Isoproterenol;Cardiac remodeling;Antioxidant;iNOS

2016-03-18

1.西安培華學(xué)院，西安 710025；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 712000

西安培華學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目(PHKT2015-0704)

10.14053/j.cnki.ppcr.201610004

*通信作者