單因素和正交試驗法優(yōu)選大葉蘚(Rhodobryumroseum)傅里葉紅外光譜處理條件

曹 珍,王振杰，趙建成

(1.河北工業(yè)職業(yè)技術學院，河北 石家莊 050091； 2.河北師范大學，河北 石家莊 050016)

?

單因素和正交試驗法優(yōu)選大葉蘚(Rhodobryumroseum)傅里葉紅外光譜處理條件

曹 珍1,2,王振杰1，趙建成2

(1.河北工業(yè)職業(yè)技術學院，河北 石家莊 050091； 2.河北師范大學，河北 石家莊 050016)

目的： 優(yōu)選大葉蘚(Rhodobryumroseum(Hedw.) Limpr.)紅外光譜處理條件。方法：運用單因素考察和正交試驗相結合的形式，采用L16(45) 正交設計法以樣品的粉碎粒度(A)、樣品與KBr混合比例(B)、樣品壓片質(zhì)量(C)、壓片壓力(D)、壓片時間(E) 5個因素，每個因素選取4個水平進行試驗。結果：樣品的粉碎粒度和樣品與KBr混合比例兩個因素對紅外光譜共有峰的吸收率影響最顯著。結論：大葉蘚紅外光譜最佳處理條件為：樣品粉碎后過200目(75μm ) 篩，樣品與KBr混合比例為4∶100、樣品壓片質(zhì)量30mg、壓片壓力10MPa、壓片時間30S。

正交試驗；單因素試驗；大葉蘚；FTIR檢測

大葉蘚(Rhodobryumroseum(Hedw.) Limpr.)隸屬于真蘚科(Bryaceae)大葉蘚屬(Rhodobryum)的一種藥用植物，又名回心草、太陽草、巖谷傘。主要分布于我國東北、華北、西南等地區(qū)，多生于林下濕潤地表腐殖質(zhì)或陰濕巖面薄土上[1]。民間很早就開始作為藥用植物。現(xiàn)代臨床研究表明，該種植物具有較顯著的抗心肌缺血、抗缺氧、擴張冠脈、改善微循環(huán)及抗動脈粥樣硬化、減少內(nèi)皮細胞受損等作用[2,3]。由于蘚類植物體型較小，在野外采集過程中常有不同程度的摻雜現(xiàn)象，從而影響到了藥效和療效。因此，通過化學方法對其進行快速無損鑒別是非常必要的一種嘗試。本研究的主要目的是探索傅里葉紅外光譜檢測技術在優(yōu)先大葉蘚處理條件中的應用。

傅里葉紅外光譜技術現(xiàn)被廣泛地應用于中藥材[4-8]、農(nóng)作物[9-11]、病原菌[12]以及少數(shù)蘚類植物[13]的種類識別與鑒別方面，其優(yōu)點在于不需要對待測樣品進行復雜的化學處理，所需樣品用量較少而獲得的信息量較大，所得結果指紋性強且對樣品無污染，無破壞[14]。正交實驗設計法被廣泛應用于一些中藥材成分提取[15-17]和部分藥品的紅外壓片技術條件探索中[18,19]。但對于蘚類藥用植物紅外光譜條件的研究未見報道，本試驗以大葉蘚(R.roseum)的傅里葉紅外光譜吸收率為指標，采用單因素試驗和正交試驗相結合的方法對大葉蘚紅外光譜測定過程中的樣品粉碎粒度、待測樣品與KBr混合比例、壓片質(zhì)量、壓片壓力和壓片時間進行了優(yōu)選，以尋求最佳的大葉蘚傅里葉紅外光譜測定條件。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

VERTEX 70，DigiTectTM檢測器，傅里葉變換紅外光譜儀(德國BRUKER公司) ，測量譜區(qū)為25 000-20 cm-1，光譜分辨率4 cm-1；FW-4A型壓片機(天津光學儀器廠) ，BP210S型分析天平(德國sartorius)讀數(shù)精度0.1 mg，稱重范圍210 g；DHG9240A型鼓風干燥箱(上海精密儀器儀表有限公司) 。

1.2 材料與試劑

溴化鉀(KBr，光譜純，天津市光復精細化工研究所) 。所試材料為大葉蘚(Rhodobryumroseum(Hedw.) Limpr.)。樣品采自河北駝梁國家級自然保護區(qū)境內(nèi)，憑證標本存于河北師范大學植物標本館(HBNU) 。

2 實驗方法

2.1 供試品的制備及傅里葉紅外測試方法

取樣品的全株作為分析對象，經(jīng)蒸餾水沖洗干凈，45℃烘干2 d。先放入粉碎機中粉碎，然后置于瑪瑙研缽上研磨成細小均勻的粉末，過200目篩(75 μm) ，各樣品取8 mg與80 mg的溴化鉀(KBr)混合并研磨均勻，然后壓片測試紅外光譜。每個樣品重復測試3次。試驗中通過差減空白溴化鉀窗口的光譜扣除背景噪聲，記錄不同波段的吸光度。

2.2 單因素實驗

按“2.1”樣品處理方法，分別調(diào)整大葉蘚樣品的粉碎粒度為100目(150μm) 、150目(106μm) 、200目(75μm) 、250目(58μm)，與KBr混合比例分別為1∶100、2∶100、4∶100、8∶100、10∶100、20∶100、40∶100、80∶100及100%并研磨均勻，壓片質(zhì)量為75 mg、60 mg、45 mg、30 mg，壓片壓力分別設定為6 MPa、8 MPa、10 MPa、12 MPa，壓片時間分別設定為10 S、20 S、30 S、40 S。

2.2.1 樣品粉碎粒度對紅外圖譜的影響

從表1及圖1可以看出將待測樣品按照8∶100的比例與KBr混合并研磨均勻，準確稱取40 mg進行壓片，壓片壓力為10 MPa，壓片時間為20 S測定紅外圖譜，樣品粒度為100目(150μm)時，測得的紅外圖譜的共有吸收峰最低，其中最高吸收峰峰值為0.6509，隨著樣品的粉末粒度減小，紅外圖譜共有峰的峰高呈逐漸增大的趨勢，吸收峰峰值逐漸增大，證明樣品研磨越細透過率越高，因此樣品研磨應當采用不低于200目(75μm)的標準。

表1 樣品粉碎粒度對最高吸收峰峰值的影響

圖1 樣品的粉碎粒度對紅外圖譜的影響

2.2.2 樣品與KBr混合比例對紅外圖譜的影響

從表2及圖2可以看出將待測樣品分別以1∶100、2∶100、4∶100、8∶100、10∶100、20∶100、40∶100、80∶100及100%的比例與KBr混合并研磨均勻，過200目(75μm)篩，準確稱取40mg進行壓片，壓片壓力為10MPa，壓片時間為20S測定紅外圖譜，混合比例為4∶100時，測得的紅外圖譜的峰高最高，最高吸收峰峰值為0.5960，混合比例在4∶100以下時隨著混合比例減小最高吸收峰峰值逐漸降低，混合比例在8∶100以上隨著混合比例增加樣品的最高吸收峰峰值逐漸降低，因此應設置樣品與KBr混合比例在4∶100-8∶100之間較為適宜。

表2 樣品與KBr混合比例對最高吸收峰峰值的影響

圖2 樣品與KBr混合比例對紅外光譜的影響

2.2.3 壓片質(zhì)量對紅外圖譜的影響

從表3及圖3可以看出將大葉蘚樣品的粉碎過200目篩，按照8∶100的比例與KBr混合并研磨均勻，壓片壓力為10MPa，壓片時間為20S測定紅外圖譜。壓片的質(zhì)量分別設定為30mg、45mg、60mg、75mg時，最高峰吸收值隨質(zhì)量增加而減小，但壓片粉末的質(zhì)量也不能低于30mg否則不能壓制成型，影響壓片的效果，因此可以選擇30-35mg作為最適壓片質(zhì)量。

表3 壓片質(zhì)量對最高吸收峰峰值的影響的影響

圖3 壓片質(zhì)量對紅外光譜的影響

2.2.4 壓片壓力對紅外圖譜的影響

由表4和圖4可以看出，將大葉蘚樣品粉碎過200目(75μm)篩，按照8∶100的比例與KBr混合并研磨均勻，精確稱取40mg進行壓片，壓片時間為20S，壓片壓力分別設定為6MPa、8MPa、10MPa、12MPa測定紅外圖譜，所測得的結果顯示在壓力為6MPa以上時最高峰的吸收值相距較近，壓力為8MPa和10MPa時最高峰吸收值較高，相差僅為0.01，因此可以將壓片壓力設定在8-10MPa之間。

表4 壓片壓力對最高吸收峰峰值的影響

圖4 壓片壓力對紅外光譜的影響

2.2.5 壓片時間對紅外圖譜的影響

由表5和圖5可以看出將大葉蘚樣品的粉碎過200目(75μm)篩，按照8∶100的比例與KBr混合并研磨均勻，精確稱取40mg進行壓片，壓片壓力設定為10MPa，壓片時間分別設定為10S、20S、30S、40S時測定的紅外圖譜結果顯示，壓片時間越長最高峰吸收值越高，但壓片時間超過30S后最高峰吸收值相差不大，因此可以選擇30S作為壓片的最適時長。

表5 壓片時間的對最高吸收峰峰值影響

圖5 壓片時間對紅外光譜的影響

2.3 正交試驗優(yōu)選大葉蘚紅外光譜的最佳試驗條件

2.3.1 正交試驗設計

在單因素實驗的基礎上進行了正交試驗設計，分別選取樣品的粉末粒度、樣品與KBr的混合比例、壓片質(zhì)量、壓片壓力以及壓片時間5個因素紅外光譜圖吸收率為指標，選用L16(45)正交表進行正交試驗，水平因素見表6。

表6 L16(45)正交因素水平表

2.3.2 正交試驗結果與分析

由表7正交試驗分析結果可知，各因素對結果的影響為B>A>C>E>D，即與KBr混合比例>樣品的粉碎粒度>樣品質(zhì)量>壓片時間>壓片壓力，條件A3B1C4D3E4為紅外光譜最高吸收峰值方案，即粉末粒度為200目(75μm)、樣品與KBr混合比例為4∶100、壓片質(zhì)量30mg、壓片壓力10MPa、壓片時間40S。

表7 紅外光譜測試正交實驗結果

從表8方差分析可知：大葉蘚與KBr混合比例和樣品的粉碎粒度兩個條件在試驗中為顯著性影響因素，樣品的質(zhì)量影響次之，因壓片時間與壓片壓力對結果的影響在5個因素中均較低，為提高實驗效率可以將壓片時間控制在30S。即最終選用A3B1C4D3E3作為大葉蘚紅外測試的最佳條件。

表8 方差分析表

2.4 驗證試驗

根據(jù)正交試驗結果對A3B1C4D3E3(藥材粉碎后過200目篩(75μm) 、樣品與KBr混合比例為4∶100、壓片質(zhì)量30mg、壓片壓力10MPa、壓片時間30S) 測定條件進行驗證，重復試驗3次，以驗證該工藝的合理性和穩(wěn)定性，結果紅外光譜最高吸收峰平均吸收率為0.6757，RSD=1.03%，結果無顯著性差異，證明該工藝穩(wěn)定，可以作為大葉蘚紅外光譜的測試條件。

3 討論

樣品粉碎的粒度對紅外光譜的共有峰吸收率有重要影響，一般來講，樣品顆粒越細紅外光譜吸收率越高，紅外圖譜的共有峰峰高越高，但粉碎過細也會造成樣品在過篩過程中的損失，因此樣品的粉碎粒度設定為200目(75μm ) 。

樣品與KBr混合比例過大，會造成紅外線透射率過低，紅外圖譜的共有峰峰高越低，混合比例過小，大葉蘚材料不足以均勻分布在整個壓片區(qū)域，造成測量誤差，因此樣品與KBr混合比例控制在4∶100。

另外壓片質(zhì)量雖不對結果產(chǎn)生顯著影響，但在試驗過程中，如壓片質(zhì)量過大同樣會使紅外線透過率降低，紅外圖譜的共有峰峰高降低，影響測得的紅外光譜效果，因此壓片質(zhì)量不宜過大，與KBr混合后選取30 mg最為適宜。

[1] 陳邦杰.中國蘚類植物屬志[M].北京：科學出版社,1962,271.

[2] 喬菲,馬雙成,林瑞超.大葉蘚屬植物化學及藥理研究綜述[J].中國藥品標準,2003,4(6):3-5.

[3] 蔡小軍,陳艷,俞云,陸一.回心草對心肌細胞缺氧損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(5):204-206.

[4] 洪慶紅,成則豐,李群力.FTIR聚類分析法應用于菟絲子真?zhèn)蔚蔫b別[J].光譜學與光譜分析，2008,28(8):1803-1805.

[5] 沈亮,黎穎菁,羅苑等.山豆根不同部位化學成分的FTIR表征比較[J].光譜實驗室,2012,29(1):334-337.

[6] 李棟玉,晏翠瓊,時有明.傅里葉變換紅外光譜鑒別紅黃禿馬勃和橙黃硬皮馬勃[J].光譜實驗室,2012,29(3):1494-1497.

[7] 孫素琴,劉軍,周群.傅里葉變換紅外光譜和傅里葉變換拉曼光譜法無損鑒別藥材的真?zhèn)蝃J].分析化學研究報告,2002,30(2):140-143.

[8] 孫煌,許沛虎,徐海星等.不同產(chǎn)地南五味子紅外指紋圖譜鑒別[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2012,32(15):1204-1205.

[9] 易時來,鄧烈,何紹蘭等.FTIR光譜結合系統(tǒng)聚類分析的甜橙樹苗鑒別研究[J].光譜學與光譜分析，2012,32(11):3006-3009.

[10] Li Zhi-yong ,Liu Gang,Li Lun,et al.FTIR Spectroscopic Study of Broad Bean Diseased Leaves[J].Agricultural Science & Technology,2012,13(11):2363-2366,2408.

[11] Michele De-luca,Wafa Terouzi,Giuseppina Ioele,et al.FTIR spectroscopy for cluster analysis and classification of morocco olive oils[J].Food Chemistry,2011,124:1113-1118.

[12] HELM D,LABISCHINSKI H,SCHALLEHN G,et al.Classification and identification of bacteria by Fourier-transform infrared spectroscopy[J].Journal of General Microbiology,1991,137:69-79.

[13] HU Tao,JIN Wen-jing,CHENG Cun-gui.Classification of five kinds of moss plants with the use of Fourier transform infrared spectroscopy and chemometrics[J].Spectroscopy，2011,25:271-285.

[14] CHENG Cun-gui,LIU Jia,CAO Wen-qing,et al.Classification of two species of Bidens based on discrete stationary wavelet transform extraction of FTIR spectra combined with probability neural network [J].Vibrational Spectroscopy，2010,54:50-55.

[15] 吳安國,曾寶,韋楊，等.正交實驗法優(yōu)選黃連-厚樸藥對的提取工藝[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012,27(1):101-104.

[16] 趙華,李會鵬,廖克儉.正交實驗法優(yōu)選微波提取遠志皂苷的工藝[J].化學工業(yè)與工程，2011,28(6):35-38.

[17] TANG Yun,LIU Yan-Ze,HAN Ling,ZHAO Yu-qing.Optimization of Smashing Tissue Extraction Technology of Schisandra chinensis Fruits by Orthogonal Test[J].Chinese Herbal Medicines,2012,4(3):259-262

[18] 謝友亮.正交法優(yōu)選氨茶堿注射液紅外光譜鑒別中壓片條件[J].數(shù)理醫(yī)藥學雜志，2008,21(1):23-25.

[19] 謝友亮.正交法優(yōu)選阿魏酸鈉紅外光譜鑒別中壓片條件[J].海峽藥學，2005,17(5):49-51.

Optimization of FITR spectrometry conditions ofRhodobryumroseumby single-factor test and orthogonal experiment

CAO Zhen1,2,WANG Zhen-jie1,ZHAO Jian-cheng2

(1.HebeiCollegeofIndustryandTechnology,ShijiazhuangHebei050091,China;2.CollegeofLifeScience,HebeiNormalUniversity,ShijiazhuangHebei050016,China)

Objective:To optimize the best experiment conditions ofRhodobryumroseumby Fourier transform infrared(FTIR) spectrometry.Methods:In the method of single-factor and orthogonal test,L16(45) orthogonal experiment was designed with five factors at four levels to investigate the effect of particle size,the mixing proportion of the sample and KBr,the weight of the sample,tabletting pressure and time.Results:The particle size and the mixing proportion of the sample and KBr had significant effect on the absorbance of the common peaks.Conclusion:The optimal FTIR spectrometry conditions for the R.roseum were that the crude sample was powdered and passed 200 mesh sieve(75μm),the mixing proportion of the sample and KBr was 4∶100,the tabletting weight was 30mg,the tabletting pressure was 10 MPa,the tabletting time was 30S.

Orthogonal test; Single-factor test; Rhodobryum roseum; FITR spectrometry

2016-08-17

河北省高等學?？茖W技術研究項目(Z2014001)

曹 珍(1981-)，女，博士研究生，主要從事苔蘚植物學研究.E-mail:caozhen81112@126.com

趙建成，教授，博士生導師.E-mail:zhaojiancheng@mail.hebtu.edu.cn

1001-9383(2016)03-0067-08

TQ461

A