焦化廢水中苯酚降解菌篩選及其降解特性

鄧冬梅，何勍，孫宇飛，梁秀芬，萬美玲，吳桂珍，韋烽，陳業(yè)祖

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣西科技大學(xué)），廣西柳州545006）

焦化廢水中苯酚降解菌篩選及其降解特性

鄧冬梅1，2，何勍1，2，孫宇飛1，2，梁秀芬1，2，萬美玲1，2，吳桂珍1，2，韋烽1，2，陳業(yè)祖1，2

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣西科技大學(xué)），廣西柳州545006）

苯酚是焦化廢水中含量最多的難降解有毒有機(jī)物，篩選高效苯酚降解菌可為通過生物強(qiáng)化提高焦化廢水中苯酚的生物降解效率提供合適菌源.本研究以苯酚作為唯一碳源，通過富集馴化方法從柳鋼焦化廢水缺氧／好氧（A／O）生物處理系統(tǒng)的好氧池活性污泥中篩選分離出一株苯酚降解菌B2.根據(jù)16S rDNA序列分析，B2菌株和Staphylococcussciuri的16S rDNA序列相似性達(dá)100％，初步表明B2菌株為S．sciuri.進(jìn)一步通過單因素法考察pH、溫度和初始苯酚濃度對B2降解苯酚的影響，并通過響應(yīng)面法確定B2降解苯酚的最優(yōu)環(huán)境條件.結(jié)果表明：pH和濃度的交叉組合對B2菌株的苯酚降解能力影響最大，B2菌株在pH＝7．5，溫度為30℃，初始苯酚濃度為2．0 g／L對苯酚的降解能力最高，降解率達(dá)到85％.

焦化廢水；苯酚；降解菌；篩選；降解特性

0　引言

焦化廢水是由煤氣凈化、原煤高溫干餾和化工產(chǎn)品精制過程中產(chǎn)生的廢水，成分復(fù)雜且難降解，是最難處理的工業(yè)廢水之一［1－2］.苯酚是焦化廢水中最主要的難降解有機(jī)物，占焦化廢水有機(jī)物的60％以上［3］，而且苯酚毒性大會抑制其中氨氮、COD的降解，所以苯酚的降解對焦化廢水的達(dá)標(biāo)排放尤其重要.

生物處理是目前焦化廢水的主要處理方式，也是苯酚降解的主要途徑［4］.生物強(qiáng)化，是為了提高廢水生物處理系統(tǒng)的處理能力，而向該系統(tǒng)中投加從自然界中篩選的優(yōu)勢菌種或通過基因重組技術(shù)產(chǎn)生的高效菌種，以去除某一種或某一類有害物質(zhì)的方法［5］，在提高焦化廢水中苯酚降解效率方面有很大應(yīng)用前景.為將生物強(qiáng)化應(yīng)用于焦化廢水中苯酚降解，苯酚降解菌的篩選十分關(guān)鍵.目前，國內(nèi)外已篩選獲得大量的苯酚降解菌，其中假單細(xì)胞菌屬微生物最多（Pseudomoma sp．）［6］,其他微生物如洋蔥伯克霍爾德菌（BurkholderiacepaciaPW3）［7］，A cinetobacter calcoacetic［8］，Gulosibacter sp．YZ4［9］，絲孢酵母菌屬（Trichosporon sp．）［10］，糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis）［11］等微生物菌株也均可以降解苯酚.

為達(dá)到穩(wěn)定高效的去除效果，篩選來自工作環(huán)境中降解菌及菌株間的復(fù)配已成為共識，為此需要更多苯酚降解菌提供復(fù)配菌源；環(huán)境因素也是實(shí)際處理工程中影響去除效果的主要因素.因此本研究希望通過篩選苯酚降解菌，考察環(huán)境因素對菌株降解苯酚特性的影響，為生物強(qiáng)化提高焦化廢水中苯酚降解效率提供菌源.

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1菌株

菌株篩選自柳鋼焦化廢水A／O生物處理系統(tǒng)O池中活性污泥.

1.1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基含蛋白胨0.5 g，K2HPO40.1 g，MgSO40.05 g，苯酚（根據(jù)需要加入），pH 7.2～pH 7.4，細(xì)菌富集馴化使用.

分離培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基含K2HPO40.2 g，MgSO40.05 g，（NH4）2SO41.0 g，苯酚1.0 g，pH值在7.2～7.4之間，細(xì)菌分離使用［12］.

固體培養(yǎng)基為在液體培養(yǎng)基中投加15 g／L瓊脂.

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種的馴化和分離

取10mL新鮮活性污泥至裝有90mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，手搖振蕩20min，將細(xì)胞分散.取5mL菌懸液于苯酚濃度為0 g／L的富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h.按同樣方法，每次取5mL連續(xù)轉(zhuǎn)接7次，苯酚濃度依次為0.5 g／L，0.7 g／L，0.8 g／L，1.0 g／L，1.2g／L，1.5 g／L和1.8 g／L，以對苯酚降解菌進(jìn)行富集和馴化.馴化后菌液經(jīng)在LB培養(yǎng)基上涂布稀釋分離及平板劃線純化后得到純菌株.將分離得到的純菌株接種于含有1.0 g／L苯酚的液體分離培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)24 h，計(jì)算菌株對苯酚的降解率，得到一株可以在分離培養(yǎng)基中生長的苯酚降解菌株，編號為B2.將B2菌株保存在15％的甘油中，存于-60℃冰箱中待用.

1.2.216SrDNA鑒定

利用細(xì)菌鑒定通用引物27F和1 492R［13］對菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海生工有限公司合成，反應(yīng)體系和PCR程序如表1和表2所示，4℃保存PCR產(chǎn)物.1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，割膠純化PCR產(chǎn)物.將純化后的DNA送往上海立菲生物技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行序列測定；將序列在NCBI網(wǎng)頁上進(jìn)行BLAST同源性比對.

表1　菌液PCR反應(yīng)體系Tab.1 The am plification system of bacteria PCR μL

表2　菌液PCR反應(yīng)程序Tab.2 T he problem of bacteria PCR

1.2.3菌株降解條件及降解特性研究

利用液體分離培養(yǎng)基對B2菌株搖床培養(yǎng)，以苯酚降解率為指標(biāo)，利用單因素實(shí)驗(yàn)研究pH、溫度和初始苯酚濃度對菌株生長及降解苯酚的影響.

表3　響應(yīng)面分析因素與水平Tab.3 Factors and levels of response surface analysis

根據(jù)環(huán)境單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用Design-Expert軟件生成3水平3因素組合條件（如表3所示），根據(jù)所生成的各組合條件，利用液體分離培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)B2菌株，測定培養(yǎng)2 d后苯酚濃度，計(jì)算降解率，所得結(jié)果輸入Design-Expert軟件，生成分析.將B2菌在響應(yīng)面法所確定的最優(yōu)條件下進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每隔2 h測定苯酚濃度和菌液濃度，繪制生長曲線和苯酚降解曲線.

1.2.4分析方法

菌種濃度的測定采用比濁法，使用分光光度計(jì)于波長600 nm處測定其OD值［14］.苯酚含量采用4-氨基安替比林分光光度法［15］，使用分光光度計(jì)于波長510 nm處測定其OD值.

2　結(jié)果與討論

2．1苯酚降解菌篩選與鑒定

富集馴化培養(yǎng)時(shí)，在0.28 g／L～1.8 g／L的苯酚環(huán)境下，培養(yǎng)液均變混濁，培養(yǎng)后測定培養(yǎng)液里的苯酚濃度也有不同下降，初步說明搖瓶中的菌也具有苯酚降解特性.經(jīng)平板劃線分離，得到一株苯酚降解菌，命名為B2菌株，B2菌株在不含碳源的分離培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)48 h后，菌液變混濁，苯酚降解率達(dá)86％，說明B2菌株可以以苯酚為唯一碳源進(jìn)行生長.B2的16S rRNA序列與數(shù)據(jù)庫Genbank中的Staphylococcus sciuri序列相似性達(dá)100％，初步鑒定B2菌株為Staphylococcus sciuri.研究表明Staphylococcus sciuri是一種致病菌，常致尿路感染，對青霉素及頭孢類藥物有耐藥作用，屬于Staphylococcus屬，是最常見的化膿性菌球，是醫(yī)院交叉感染的重要來源［16］.Mrozik［17］等發(fā)現(xiàn)Staphylococcus sciuri具備苯酚降解能力，但環(huán)境條件對其降解能力的影響探討較少.

2．2 B2菌株降解苯酚單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1pH對菌株苯酚降解率的影響

如圖1所示，在30℃，初始苯酚濃度為2 000mg／L條件下，pH值在6.5～8.0間，B2對苯酚的降解率均保持在80％以上，其中pH值7.5時(shí)，B2對苯酚的降解率最高.此外，在苯酚降解過程中培養(yǎng)液呈酸性（見圖2），這可能是因?yàn)锽2菌在降解苯酚過程中，需要將苯酚開環(huán)成為有機(jī)酸才能被利用.

圖1　不同pH下B2菌株的苯酚降解率Fig．1 Degradation ratios of phenol of B2 at different pH

圖2　降酚過程中B2菌液的pH變化Fig．2 Variation of pH in culture when phenol degraded by B2

圖3　不同初始苯酚濃度下B2菌株的苯酚降解率Fig．3 Phenol degradation rate of B2 at different phenol concentrations

2.2.2初始苯酚濃度對菌株苯酚降解率的影響

由圖3可知，在30℃，pH值在7.5條件下，苯酚初始濃度由500mg／L增加到2 000mg／L，B2菌株對苯酚的降解率逐漸增大，苯酚濃度增加至2 500mg／L，B2菌株對苯酚的降解率略有下降.其中，苯酚濃度在2 000mg／L左右時(shí)，B2菌株在48 h內(nèi)對苯酚降解率最高，達(dá)84.1％.

2.2.3溫度對菌株苯酚降解率的影響

由圖4可知，在初始苯酚濃度2 000mg／L，pH值在7.5條件下，在20℃～30℃之間，B2菌株的苯酚降解率隨溫度的增加而增加，大于30℃時(shí)，降解率隨溫度的增加而降低，其中在溫度30℃，起始苯酚濃度為1 000mg／L時(shí)，B2菌株的苯酚降解率最高達(dá)89％.

2．2．4響應(yīng)面法優(yōu)化菌株苯酚降解條件

17組試驗(yàn)的苯酚降解率結(jié)果列于表4中，可以看出：在設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件下，苯酚最大降解率達(dá)到82％，最小降解率為33％，表明不同的溫度、pH和初始苯酚濃度下，苯酚降解率有著很大差別.將表4中的結(jié)果導(dǎo)入Design－Expert軟件，固定一個(gè)環(huán)境因素的情況下，以另外2個(gè)環(huán)境因素為X和Y軸，以降解率為Z軸作圖，得到在不同降解條件下的苯酚降解率響應(yīng)曲面.如圖5所示，只有pH和濃度的關(guān)系凸面較為突出，說明pH和濃度的交叉組合對降解率較為顯著，而其余2個(gè)相互因素組合對降解率的影響不太明顯.由圖5還可知，B2菌株降解苯酚的最優(yōu)條件為：溫度30℃，pH值7．5，底物質(zhì)量濃度2．5 g／L.

圖4　不同溫度下B2菌株的苯酚降解率Fig．4 Phenol degradation rate of B2 at different temperature

表4　組合條件及對應(yīng)苯酚降解率Tab.4 Phenol degradation rate of B2 and corresponding environmental conditions

2．2．5菌種生長曲線及降解特性

如圖6所示，B2的生長與苯酚的降解幾乎是同步的.菌株處于對數(shù)生長期時(shí)，細(xì)胞濃度快速增長，底物降解較快.在12 h左右開始進(jìn)入對數(shù)期，到26 h開始進(jìn)入穩(wěn)定期.降解62 h后，苯酚濃度從2 000mg／L降解到340mg／L，降解率達(dá)85％.而苯酚降解菌Rhodococcussp．在苯酚濃度為1 160mg／L時(shí)，生長受到抑制，24 h才達(dá)到生長對數(shù)期［18］.已報(bào)道的耐高濃度苯酚的苯酚降解菌Gulosibacter sp．YZ4［9］，初始苯酚濃度為2 000mg／L時(shí)，降解48 h后，僅有不到30％的苯酚得到降解，但所有的苯酚在76 h內(nèi)全部降解，和B2菌株的降解特性有很大差異.結(jié)果說明B2具有耐受高濃度苯酚的能力和高效苯酚降解能力，在生物強(qiáng)化處理焦化廢水等高濃度苯酚廢水處理中有一定應(yīng)用前景，為此，需進(jìn)一步優(yōu)化生物強(qiáng)化條件和考察其對實(shí)際廢水的處理效果.此外，B2菌株的特殊降解特性說明B2菌株的降解機(jī)理也有進(jìn)一步研究價(jià)值.

圖5　苯酚降解對環(huán)境因素的響應(yīng)圖Fig.5 Phenol degradation for responsesurface optimization versus different environmental factors

圖6　菌株B2生長過程與苯酚降解過程的關(guān)系Fig.6 Growth curve and phenol degradation of strain B2

3　結(jié)論

1）經(jīng)過以苯酚為唯一碳源，從柳鋼焦化廢水中篩選出了一株具有降解苯酚能力的菌株B2，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為Staphylococcus sciuri；

2）通過環(huán)境單因素對B2降解效率的影響以及響應(yīng)面法優(yōu)化條件研究，確定B2降解苯酚的最優(yōu)條件為：溫度30℃，pH值為7．5，苯酚初始濃度2．0 g／L，該條件下?lián)u床培養(yǎng)62 h后，苯酚降解率達(dá)85％.

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（學(xué)科編輯：黎婭）

Screening and characterization of phenol degrading bacteria from the coking wastewater

DENG Dong-mei1,2,HE Qing1,2,SUN Yu-fei1,2,LIANG Xiu-fen1,2, WAN Mei-ling1,2,WU Gui-zhen1,2,WEI Feng1,2,CHEN Ye-zu1,2
(1.School of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006,China;2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources（Guangxi University of Science and Technology），Liuzhou 545006,China)

Phenol was the highest content of toxic and biorefractory organics in coking wastewater.Screening of high efficient phenol-degrading bacteria could provide suitable bacteria for the treatment of coking wastewater by bioaugmenting.In this study,a phenol degrading strain B2 which took phenol as only carbon source was separated and screened by enrichment culture from activated sludge of coking effluent A/O biological treatment system of Liuzhou Iron and Steel.By colony morphology,gram stain,normal physiological and biochemical reactions and 16S rDN A sequencing,the strain B2 was identified as Staphylococcus sciuri.Single factor experiment was then used to investigate the influence of environmental conditions such as pH,temperature and the initial concentration of phenol on phenol degradation ability of B2.Response surface analysis was used further to optimize these environmental conditions.The results showed that cross-over of pH and phenol concentration had the most important effect on the degradation of phenol of B2 and the best condition for phenol-degrading ability of B2was30℃,pH 7.5 and 2.5 g/L for initial concentration of phenol.In the optimum conditions,the degradation rate of phenol was85％when the culture time was62 h.

coking effluent;phenol;degrading strain;screen;degradation

X172；Q939.97

A

2095-7335（2016）04-0093-06

10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2016.04.017

2016－07－15

廣西自然科學(xué)基金（2014GXNSFBA118249）；2016年廣西國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（201610594042）；廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)及卓越學(xué)者計(jì)劃資助（桂教人（2014）7號）；廣西高等科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（YB2014201）資助.

鄧冬梅，博士，副教授，研究方向：水污染處理，E-mail：deng-dongmei@163.com.