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    土壤微生物16S rDNA的T-RFLP法醫(yī)學(xué)應(yīng)用分析

    2016-11-21 00:47:53陳尚坤王旭東張曉嘉王佳琦張更謙
    關(guān)鍵詞:電泳吉林多態(tài)性

    陳尚坤王旭東張曉嘉王佳琦張更謙

    (1 吉林警察學(xué)院 吉林 長春 130117;2 西南政法大學(xué) 重慶 401120;3 山西醫(yī)科大學(xué) 山西 太原 030001)

    土壤微生物16S rDNA的T-RFLP法醫(yī)學(xué)應(yīng)用分析

    陳尚坤1王旭東2張曉嘉3王佳琦3張更謙3

    (1吉林警察學(xué)院吉林長春130117;2西南政法大學(xué)重慶401120;3山西醫(yī)科大學(xué)山西太原030001)

    用T-RFLP法觀察不同地域土壤微生物的多態(tài)性,為法醫(yī)學(xué)土壤分析提供適當(dāng)?shù)难芯糠椒ā2杉约趾椭貞c兩地的土壤樣本,用PowerSoil?試劑盒提取土壤細(xì)菌DNA。PCR擴(kuò)增16S rDNA基因的多態(tài)性區(qū)域,引物的5’端采用FAM標(biāo)記。擴(kuò)增產(chǎn)物分別用HaeⅢ,AluⅠ內(nèi)切酶消化后,在3130 Genetic Analyzer電泳分離。采用主成分分析(PCA) 法和主效可加護(hù)作用可乘模型(AMMI)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過采用HaeⅢ酶切后,T-RFLP法可以明確分離重慶和吉林兩地的土壤樣本;AluⅠ酶切后分離效果稍差。得出T-RFLP法可以區(qū)分來自不同地域的土壤樣本,為法醫(yī)學(xué)土壤多樣性分析提供了可靠的分析方法和結(jié)論。

    土壤細(xì)菌16S rDNA末端-限制性長度多態(tài)性主效可加護(hù)作用可乘模型

    土壤中含有豐富的細(xì)菌、真菌、病毒等微生物,其多態(tài)性組成深度影響著土壤的性質(zhì)和環(huán)境。土壤微生物在農(nóng)業(yè),環(huán)境分析等領(lǐng)域得到充分的重視和研究。土壤微生物的多態(tài)性表現(xiàn)為地域、時(shí)間、土壤性質(zhì)、環(huán)境影響等方面。土壤中的眾多微生物至今未在實(shí)驗(yàn)室成功培養(yǎng),例如土壤中的細(xì)菌有95%~98%未能在實(shí)驗(yàn)室成功培養(yǎng)。因此,通過其多態(tài)性集中的DNA區(qū)域如16S rRNA、18S rRNA基因等去分析土壤的宏基因組。近年來,法醫(yī)也越來越重視土壤微生物分析[1]。相關(guān)的探索領(lǐng)域包括微生物的個(gè)體識(shí)別,土壤細(xì)菌的改變與死亡時(shí)間的關(guān)系等[2]。

    末端-限制性長度多態(tài)性(Terminal-Ristriction Fragment Length Polymorphism,T-RFLP) 是研究土壤宏基因組的方法之一。本文采用T-RFLP結(jié)合主成分分析的方法(PCA)和主效可加護(hù)作用可乘模型(AMMI)研究不同地域土壤的細(xì)菌DNA多態(tài)性,觀察其變異程度,探討用不同的酶切和分析方法來區(qū)分不同地域土壤的可行性,為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用該類多態(tài)性和方法進(jìn)行技術(shù)探討[3-4]。

    1 材料

    1.1土壤收集

    土壤樣本共24個(gè),分別來自吉林省和重慶市,具體見下表。

    1.2實(shí)驗(yàn)材料

    PowerSoil?土壤微生物DNA提取試劑盒(MO BIO,美國);內(nèi)切酶HaeⅢ和AluⅠ(New England Biolabs,英國);rTaq和dNTP(Takara,日本);引物序列為8F:5'FAM-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,785R:5'-ACTACCTGGGTATCTAATCC,擴(kuò)增產(chǎn)物總長度約777bp[5];引物合成和標(biāo)記由生工生物工程(上海)股份公司完成。

    2 方法

    2.1土壤DNA提取與擴(kuò)增

    采用MO BIO PowerSoil?土壤微生物DNA提取試劑盒,取250mg的樣品加入power Bead管中,加入C1溶液混勻10min,10000g離心10min,轉(zhuǎn)移上清液,分別加入C2、C3、C4液,每次10000g離心1min。每次取600μL加入過濾柱中,10000g離心1min,重復(fù)3次,C5、C6液分別洗滌一次。收集離心管中的DNA。將樣本跑瓊脂糖電泳確認(rèn)DNA分離結(jié)果,并測(cè)定樣本OD值,計(jì)算其濃度。

    用ABI PCR 9700擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下:緩沖液(PCR Buffer)5μL、dNTP4μL、上游引物(8F)2μL、下游引物(785R)2μL、rTaq 0.6μL、樣本DNA 100ng、加超純水至總體積50μL。PCR反應(yīng)條件:95℃5min預(yù)變性;95℃10s,55℃1min,72℃30s,共36個(gè)循環(huán);72℃10min,4℃保存。

    表 土壤樣本

    2.2酶切

    擴(kuò)增結(jié)束后,將擴(kuò)增產(chǎn)物分別用HaeⅢ,AluⅠ酶切。酶切體系為25μL體系:buffer2.5μL、內(nèi)切酶(HaeⅢ,AluⅠ) 1μL,超純水11.5μL、擴(kuò)增產(chǎn)物10μL。放置于37℃水浴條件下過夜后煮沸滅活內(nèi)切酶。

    2.3電泳和自動(dòng)分析

    電泳在ABI公司Genetic Analyzer 3130分析儀上進(jìn)行。具體步驟如下:取去離子甲酰胺9.5μL、0.2μL內(nèi)標(biāo)(LIZ 500)、1.5μL酶切產(chǎn)物混合后95℃3min,立即冰浴。然后在3130機(jī)器中上樣電泳。用GeneMapper3.2分析電泳結(jié)果。顯示每個(gè)實(shí)際位置,BIN設(shè)置為±0.5bp,大于此值的被認(rèn)為是不同的峰,即不同的OTU(Operational Taxonomic Units)。

    2.4統(tǒng)計(jì)分析

    選取90~500bp之間的所有峰高大于50的峰。記錄峰的大小、峰高和峰面積,作為原始數(shù)據(jù)。將其用T-REX軟件進(jìn)行在線匹配(http://trex.biohpc.org/),并生成矩陣。對(duì)于該矩陣分別采用IMMA分析和PCA分析。IMMA分析由T-REX在線完成,PCA分析由IBM SPSS23.0完成。樣本分析采用兩種指標(biāo):①峰的有無;②峰面積。

    3 結(jié)果

    3.1T-RFLP圖譜在不同地域的土壤的差別

    T-RFLP結(jié)果顯示用HaeⅢ酶切后來自同一地區(qū)的土壤有著更多的形態(tài)相同的峰:樣本4、樣本9、樣本10取自重慶市,樣本15、樣本16、樣本17取自吉林??;而來自不同地區(qū)的土壤峰形差別較大,其特征峰(箭頭所示)的片段大小和高度及峰度都相差較大,一些峰為某些地域所特有的,而在其他地區(qū)沒有,能夠區(qū)別來自不同地區(qū)的土壤,如圖1所示。用AluⅠ酶切后,同一地區(qū)的土壤樣本仍有相同特征峰,但不同地區(qū)土壤峰形差別較小,沒有顯著差別,效果不及HaeⅢ酶,如圖2所示。

    圖1 用HaeⅢ酶切不同地域土壤樣本的T-RFLP圖譜

    3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

    所得T-RFLP圖有一定的相似性,土壤樣本距離越近,T-RFLP圖譜越相似,其特征峰的片段大小高度相近,即采自于同一片區(qū)域的樣本重復(fù)性較好。樣本4、樣本9均為在登山道右側(cè)菜地2m內(nèi)所采集的土壤,樣本10為與樣本4、9距離50m,樣本4和樣本9更為接近,T-RFLP圖譜更相似。如圖1所示。

    圖2 用AluⅠ酶不同地域的土壤樣本切的T-RFLP圖譜

    3.3PCA分析

    用HaeⅢ酶切后,分別用T-RFLP的峰的有無和峰面積進(jìn)行PCA分析,得到散點(diǎn)圖。兩地區(qū)土壤樣本集中,不能將地域分開,如圖3所示。用AluⅠ酶切后,進(jìn)行PCA分析后,較HaeⅢ酶切離散,也不能區(qū)分地域,如圖4所示。

    圖3 HaeⅢ酶切后的PCA分析圖

    圖4 AluⅠ酶切后的PCA分析圖

    3.4AMMI分析

    分別以峰高、取樣位置、取樣高度作為環(huán)境因素和峰面積、取樣位置、取樣高度作為環(huán)境因素,對(duì)兩種酶切后的樣本的T-RFLP進(jìn)行分析。HaeⅢ酶切后在設(shè)定兩種環(huán)境因素條件下的AMMI圖分布一致,并且能夠區(qū)分兩地區(qū)的土壤。吉林土壤樣本集中,重慶的土壤樣本較為離散,取樣的環(huán)境對(duì)土壤的性質(zhì)有影響,主要是取樣位置不同,如不同高度位置(13號(hào)樣本山頂,7號(hào)樣本山腳),不同濕度(2號(hào)樣本水塘,10號(hào)樣本路邊干燥處)顯示出了較大的差異性,如圖5所示。AluⅠ酶切后AMMI分析,不能區(qū)分兩地區(qū)土壤樣本,如圖6所示。

    圖5 HaeⅢ酶切的AMMI分析數(shù)據(jù)圖

    圖6 AluⅠ酶切后的AMMI分析數(shù)據(jù)圖

    4 討論

    影響土壤環(huán)境的因素眾多,造成微生物群落組成的差別,這種差別是T-RFLP法區(qū)分不同土壤的理論基礎(chǔ)——即用內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生不同大小的DNA片段,通過末端標(biāo)記的熒光PCR產(chǎn)物的電泳差異顯示出來。每一份不同的土壤應(yīng)該顯示不同的DNA圖譜和特征峰,即OUT[6]。法醫(yī)學(xué)者最關(guān)心的是如何用適當(dāng)?shù)姆椒ㄈピu(píng)估區(qū)分這種差別。

    本文用T-RFLP分析不同地域土壤細(xì)菌16S rRNA基因的多態(tài)性。結(jié)果表明,采用該方法可以成功提取大部分不同地域土壤的DNA并成功擴(kuò)增和分析。不同地域的土壤微生物采用適當(dāng)?shù)姆治龇椒ê?,可以得到有效的分離。采用適當(dāng)引物和內(nèi)切酶的T-RFLP分析方法可成功分析不同地域和不同環(huán)境的土壤。

    本文中采自吉林的9份土壤樣本中,8份樣本可成功擴(kuò)增分析;采自重慶的32份土壤樣本中,有16份樣本可成功擴(kuò)增分析。即使在瓊脂糖電泳后清晰觀測(cè)到土壤微生物的DNA條帶,仍無法獲得PCR產(chǎn)物,我們?cè)枚喾N純化方法,均無法擴(kuò)增出來。分析可能與該地區(qū)土壤腐殖酸等抑制擴(kuò)增的物質(zhì)含量過多,抑制PCR擴(kuò)增。分析土壤時(shí)必須注意:土壤環(huán)境多樣,因土壤樣品中成分復(fù)雜,土壤中常含有抑制擴(kuò)增的物質(zhì),如腐植酸等,如不能有效地去除,對(duì)后續(xù)PCR的擴(kuò)增影響較大[7]。

    用T-RFLP的方法區(qū)別不同地區(qū)的土壤,本實(shí)驗(yàn)兩種酶對(duì)土壤鑒別能力是不同的。一方面是由于HaeⅢ和AluⅠ不同,HaeⅢ的識(shí)別序列:5’…GG∧CC…,Alu的識(shí)別序列:5’…AG∧CT。另一方面不同地區(qū)土壤中細(xì)菌的種類不同,擴(kuò)增出片段其序列并不相同,所以酶切后片段大小及峰度不同。用引物+HaeⅢ酶要優(yōu)于引物+AluⅠ酶的方法。

    在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí),我們依據(jù)峰的有無和峰面積通過AMMI和PCA兩種方法分析。同一種酶切后,峰的有無和峰面積分析后顯示分布趨勢(shì)一致。但AMMI較PCA能較好的分離不同地區(qū)的土壤。AMMI模型將主成分分析和方差分析結(jié)合,將乘積形式的交互作用加入常規(guī)的基因型與環(huán)境的加性模型中,對(duì)細(xì)菌群落及環(huán)境因素相互作用進(jìn)行分析[8]。

    土壤的性質(zhì)不僅受地域不同的影響,同時(shí)還受環(huán)境的影響如濕度、高度、氣溫等因素影響[9]。吉林地區(qū)的土壤樣本主要來自同一高度及相似環(huán)境的土壤,AMMI分析時(shí)發(fā)現(xiàn)分布非常集中;來自重慶的土壤樣本離散度較高,主要是取樣位置不同,如不同高度位置(13號(hào)樣本山頂,7號(hào)樣本山腳),不同濕度(2號(hào)樣本水塘,10號(hào)樣本路邊干燥處)顯示出了較大的差異性。

    本文探討了用不同內(nèi)切酶結(jié)合不同的分析手段進(jìn)行土壤T-RFLP分析的可行性。結(jié)果顯示采用合適的方法可以有效分離來自不同地區(qū)的土壤,并且重復(fù)性好、結(jié)果可靠[10,11]。根據(jù)結(jié)果的一致性看,我們更傾向于AMMI分析。

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    (責(zé)任編輯:孟凡騫)

    D919.1

    A

    2095-7939(2016)03-0070-04

    10.3969/j.issn.2095-7939.2016.03.016

    2016-06-06

    吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):20110424)。

    陳尚坤(1969-),女,吉林長春人,吉林警察學(xué)院學(xué)報(bào)編輯部編審,主要從事DNA分析技術(shù)研究。

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