酶聯(lián)免疫吸附實驗中全自動立式洗板法應(yīng)用效果評價

何 露，劉 麗，孔凡虹，曹敬麗，賈子琪，劉文松，許 震，王雅杰，3

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究實驗室，北京100050；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗科，北京100050）

酶聯(lián)免疫吸附實驗中全自動立式洗板法應(yīng)用效果評價

何 露1，劉 麗2，孔凡虹1，曹敬麗2，賈子琪1，劉文松1，許 震1，王雅杰2，3

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京100050；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究實驗室，北京100050；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院檢驗科，北京100050）

目的 與傳統(tǒng)手工洗板法、水平注液式洗板法相比較，評價酶聯(lián)免疫吸附實驗中全自動立式洗板法的應(yīng)用效果。方法評價全自動立式洗板法洗板機的性能，包括微孔中液體殘留量測定、針頭堵孔可能性檢測、交叉污染可能性檢測。收集乙型肝炎病毒表面抗原化學(xué)發(fā)光法定量檢測結(jié)果分別為陰性、弱陽性、陽性、強陽性的四組樣本各30例，使用酶聯(lián)免疫吸附實驗原理乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒檢測，其中洗板步驟分別使用手工洗板法、水平注液式洗板法、全自動立式洗板法三種方法，由酶標儀讀取結(jié)果，記錄洗板時間，數(shù)據(jù)利用χ2檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 本研究中全自動立式洗板法酶標板微孔中液體殘留量均值為0.0087±0.0002μL，＜0.01μL；全自動立式洗板機使用6個月（每周至少使用2次），96個針頭未出現(xiàn)堵孔現(xiàn)象，洗板機6個月前后的直線水柱長度分別為6.53±0.27cm、6.58±0.31cm，兩組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品交叉檢測，及陽性混合血清和陰性混合血清交叉檢測未出現(xiàn)交叉污染現(xiàn)象。120例臨床樣本利用三種洗板法的定性檢測結(jié)果一致，其中30例弱陽性樣本，均有1例假陰性且來源于同一樣本；三種洗板法檢測陰性、弱陽性、陽性、強陽性樣本的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。手工洗板法、水平注液式洗板法、全自動立式洗板法的洗板時間分別為8min、5min、20s。結(jié)論 全自動立式洗板法可滿足酶聯(lián)免疫吸附實驗臨床檢測中洗板要求。

全自動立式洗板法； 手工洗板法； 水平注液式洗板法； 酶聯(lián)免疫吸附實驗； 乙型肝炎病毒表面抗原

酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）具有較高的特異性和靈敏度，同時可應(yīng)用于大量樣本的檢測［1］，在臨床檢測中被廣泛應(yīng)用［2］。影響ELISA結(jié)果準確性的因素有很多，洗板是其中一個重要的因素。為節(jié)省時間、避免交叉污染、保證洗板效果，洗板機已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院檢驗科、血站、衛(wèi)生防疫站、科研機構(gòu) ELISA實驗洗滌過程中。傳統(tǒng)水平注液式洗板法由清洗液瓶、電磁閥、泵、注液針構(gòu)成洗板機的分配（注液）路徑，用泵吸液，電磁閥控制分配量。清洗液首先從清洗液瓶抽出，再排向分配頭，經(jīng)分配頭的分配針（8針或12針或96針）注入酶標板的微孔中；吸液針、廢液瓶、真空泵構(gòu)成了洗板機的吸液路徑，清洗后的液體在大氣壓的作用下進入廢液瓶。洗板機洗板可以進行批量操作，提高了工作效率。但傳統(tǒng)水平注液式洗板法也存在一定的缺點，如洗板后殘液量較大，常需人工拍板；分配頭的針頭常因血清中的纖維蛋白等物質(zhì)導(dǎo)致堵孔。近年來為了克服以上缺點，出現(xiàn)了全自動立式洗板法。全自動立式洗板法只有注液針，沒有吸液針，利用單針反沖和回轉(zhuǎn)離心的工作原理完成微孔的清洗與殘留液體的清除工作。本文通過對全自動立式洗板法微孔中液體殘留量、針頭堵孔可能性、交叉污染可能性等性能進行測定，并對臨床樣本進行乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）檢測，比較利用手工洗板法、水平注液式洗板法、全自動立式洗板法對檢測結(jié)果的影響，探討全自動立式洗板法在ELISA中應(yīng)用的可能性。

材料與方法

1 一般資料

120例標本來源于本院門診及住院患者，化學(xué)發(fā)光法定量檢測HBsAg結(jié)果陰性（0 IU/mL）、弱陽性（＞0～100 IU/mL）、陽性（＞100～250IU/mL）、強陽性（＞250IU/mL）四組樣本各 30例，標本均無脂血和溶血，患者平均年齡為46±13歲。標本3000r/min離心10min，分離血清，離心管分裝，-80℃保存待用。陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品來自乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）診斷試劑盒。

2 儀器和試劑

北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司DEM-3型自動洗板機（水平注液式洗板機），深圳市盛信康科技有限公司SK962型甩干式快速自動酶標洗板機（全自動立式洗板機），瑞士METTLER TOLEDO公司XS105DU電子分析天平，深圳市盛信康科技有限公司SK201型酶標分析儀，美國雅培公司Architect i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，北京萬泰生物藥業(yè)有限公司酶聯(lián)免疫法乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒。

3 方法

3.1儀器性能評價

3.1.1微孔中液體殘留量測定 室溫控制在25℃。①清潔干燥酶標板10塊，分別用電子天平稱取每塊酶標板的重量，精確至0.01mg。每塊酶標板重復(fù)稱量3次，取平均值并記錄。②向酶標板每個微孔中各加入250μL蒸餾水，然后用全自動立式洗板機離心甩干。離心速度2500r/min，離心時間15s。③取出酶標板，用吸水紙吸去酶標板上微孔外液體，稱取各酶標板重量，精確至0.01mg。每塊酶標板重復(fù)稱量3次，取平均值并記錄。④用洗板后酶標板重量減去洗板前酶標板重量，除以25℃時水的密度值0.99704mg/μL，再除以96（孔），可得到酶標板微孔中液體的殘留量，單位μL。

3.1.2針頭堵孔可能性檢測 ①6臺全自動立式洗板機裝機安裝調(diào)試后，使用程序檢查有無堵孔現(xiàn)象，無堵孔現(xiàn)象后測量壓力為0.07 MPa時通過針頭噴出的直線水柱長度，記錄數(shù)據(jù)；②正常使用全自動立式洗板機6個月（每周至少使用2次）后，使用立式洗板機程序檢查有無堵孔現(xiàn)象，測量壓力為0.07 MPa時通過針頭噴出的各條直線水柱長度，記錄數(shù)據(jù)。

3.1.3交叉污染可能性檢測 ①樣本分組檢測陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品交叉檢測組（A組）、陽性混合血清和陰性混合血清交叉檢測組（B組），每組檢測5塊酶標板。②加樣次序A組將酶標板上第1、3、5、7、9、11列微孔中（即A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1、H1、A3、B3、C3、……G11、H11）全部加陽性質(zhì)控品，向第12列C12、D12中加入試劑盒陰性對照，E12、F12、G12加入試劑盒陽性對照，H12為空白，剩余各孔加入陰性質(zhì)控品。B組酶標板上第1、3、5、7、9、11列微孔中（即A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1、H1、A3、B3、C3、……G11、H11）全部加陽性混合血清，向第12列C12、D12中加入試劑盒陰性對照，E12、F12、G12加入試劑盒陽性對照，H12為空白，剩余各孔加入陰性混合血清。③HBsAg檢測按照試劑盒操作要求步驟及條件進行檢測。洗板時將酶標板標有“ABC……”字母端向上（即陽性樣本在上，陰性樣本在下），豎直放入全自動立式洗板機進行洗板。④反應(yīng)終止后，酶標儀讀取結(jié)果并記錄。

3.2不同洗板方法臨床樣本檢測結(jié)果比較

按照試劑盒操作要求步驟及條件分別用三種洗板方法洗板檢測120例樣本，記錄檢測結(jié)果。手工洗板法的具體操作步驟：甩掉孔內(nèi)液體，加入洗液浸泡30s，棄之，如此重復(fù)5次，拍干。水平注液式洗板機洗板法的具體操作步驟：應(yīng)用12針分配頭，設(shè)定水平式注液式洗板機上參數(shù)為“平底板式底部兩點吸5次8條浸泡：0秒每孔350μL吸液0.5秒”，由儀器直接自動洗板，拍干。全自動立式洗板法的具體操作步驟：設(shè)定全自動立式洗板機上參數(shù)為“洗液選擇A，洗板孔數(shù)96，洗板次數(shù)1，壓力設(shè)置7，浸泡時間0，清洗時間5秒，脫水時間7秒”，由儀器直接自動洗板。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析處理，計量資料描述采用均數(shù)±標準差，組間差異進行t檢驗；計數(shù)資料組間差異進行χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 儀器性能評價

1.1微孔中液體殘留量測定 酶標板微孔中液體殘留量為0.0087±0.0002μL，均小于0.01μL。見表1。

表110　個酶標板實驗前后的重量及實驗后微孔中殘留量

1.2針頭堵孔可能性檢測 使用全自動立式洗板機6個月后，96個針頭未出現(xiàn)堵孔現(xiàn)象。洗板機使用前與使用6個月后的直線水柱長度分別為：6.53±0.27cm和6.58±0.31 cm。t檢驗顯示，測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.3交叉污染可能性檢測A組檢測中，陽性質(zhì)控品OD值為2.2362±0.0325，陰性質(zhì)控品為0.1008±0.0421，未見交叉污染。B組檢測中，陽性混合血清OD值為1.9362±0.0417，陰性混合血清為0.1093±0.0286，未見交叉污染。

2 不同洗板方法對臨床樣本檢測結(jié)果比較

20例樣本，用三種洗板方法測定的結(jié)果完全一致，假陰性樣本均為1例，且均為同一例樣本，該例樣本利用化學(xué)發(fā)光法檢測值為1.49IU/mL（為臨界值樣本）。χ2檢驗顯示，測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2，3，4。三種洗板法洗一塊板的時間分別為8min、5min、20s。

表2　立式洗板法與手工洗板法與對ELISA法檢測HBsAg結(jié)果比較

表3　立式洗板法與注液式洗板法與對ELISA法檢測HBsAg結(jié)果比較

表4　手工洗板法與注液式洗板法與對ELISA法檢測HBsAg結(jié)果比較

討論

ELISA為非均相免疫測定技術(shù)，需經(jīng)洗板將特異結(jié)合于固相上的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成分分開。因此，洗板是保證ELISA檢測獲得準確結(jié)果的重要環(huán)節(jié)［3］。洗滌不徹底，殘留非特異性物質(zhì)，顯色后易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)；過度洗滌，抗原抗體結(jié)合物被洗脫，易引起假陰性反應(yīng)。

常用的ELISA洗板方法包括手工洗板法和洗板機洗板法。手工洗板法受人為影響因素比較大，實驗人員需經(jīng)驗豐富，洗滌次數(shù)需足夠，沖擊力不能太大，加入的洗液量以剛滿反應(yīng)孔為限，防止孔內(nèi)有游離酶未能洗凈，還需防止孔與孔之間液體交叉污染［4］。同時手工洗板時液體噴濺污染、拍板時產(chǎn)生的氣溶膠會帶來生物安全隱患。洗板機洗板法的洗板時間、清洗次數(shù)、浸泡時間嚴格按照設(shè)定的程序進行，可較好地避免人為因素干擾，穩(wěn)定性強。此外洗板機洗板對實驗室污染小，工作量小，速度快［5］。很多臨床實驗室在ELISA實驗中使用洗板機洗板法。

洗板機洗板后酶標板微孔中液體殘留量是評估洗板機洗板效果的基本標準。本次實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用全自動立式洗板機洗板后酶標板每孔液體殘留量均＜0.01μL，提示其每孔洗液殘留量已達到臨床檢測性能需求。

傳統(tǒng)注液式洗板機有兩組針頭，注液針分配洗液到酶標孔板中，吸液針抽吸廢液到廢液瓶，在清洗過程中，以逐行或逐列的方式對酶標板進行清洗。在洗針從一行或一列移到下一行或一列的過程中，可能產(chǎn)生交叉污染，影響ELISA分析結(jié)果的準確性［6］。另外，當血清標本析出不完全，有纖維蛋白的纏繞或因鹽類沉積時，注液式洗板機清洗頭易堵塞，使之清洗不到位、吸液不徹底或使清洗液溢出，造成交叉污染。特別是遇到滴度高的標本，往往因為針頭堵孔使相鄰的幾個孔同時出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。全自動立式洗板機分配頭只含注液針，無吸液針，應(yīng)用離心脫水原理對微孔板進行脫水，解決了微孔板內(nèi)液體殘留問題，且酶標板以75度傾斜放入，避免了孔內(nèi)液體外流導(dǎo)致交叉污染；分配頭與微孔板有一定距離，可保護微孔板和孔內(nèi)包被，并避免因為纖維蛋白等的纏繞造成堵針現(xiàn)象。

ELISA是一種有效的免疫學(xué)檢測方法，可用于大量樣本的分析；但ELISA法也易受實驗條件的影響［7］。本次實驗由相同檢驗人員對相同樣本在同一實驗環(huán)境條件下進行檢測，以減少系統(tǒng)誤差和隨機誤差對檢測結(jié)果的影響。本次實驗中通過應(yīng)用手工洗板法、水平注液式洗板法、全自動立式洗板法對120例血清樣品進行HBsAg檢測，三種洗板法的定性檢測結(jié)果一致，其中30例弱陽性樣本中，假陰性樣本均為1例，且來源于同一臨界值樣本；三種洗板法檢測陰性、弱陽性、陽性、強陽性樣本的測定結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。實驗過程中，我們觀察到注液式洗板法洗板5遍后酶標板微孔中殘留量較大，需人工拍板才能保證洗板效果，即此種條件下多次洗板后應(yīng)注意殘液量的監(jiān)測，以免影響檢測結(jié)果。本實驗中手工洗板法、水平注液式洗板法、全自動立式洗板法每塊酶標板洗板時間分別為8min、5min、20s，且全自動立式洗板機可同時洗兩塊酶標板，利用全自動立式洗板法可節(jié)省工作時間，提供工作效率。

優(yōu)質(zhì)的試劑、良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準確、可靠的必要條件［8］。本實驗中采用的三種洗板方法均能滿足臨床需求，從工作效率角度出發(fā)，全自動立式洗板法可節(jié)省時間、無交叉污染，可服務(wù)臨床。

［1］Abdelwahab M，Loa C C，Wu C C，et al.Recombinant nucleocapsid protein-based enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibody to turkey coronavirus.J Virol Methods，2015，217：36-41.

［2］Thiha A，Ibrahim F.A Colorimetric enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）detection platform for a point-of-care dengue detection system on a Lab-on-Compact-Disc.Sensors（Basel），2015，15（5）：11431-11441.

［3］顧友祥.酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測乙型肝炎病毒表面抗原的全面質(zhì)量控制前后對比分析.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2010，7（20）：2194-2195.

［4］王靜.ELISA快速法檢測HBsAg時手工洗板和洗板機洗板的結(jié)果比較.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，7（9）：69，73.

［5］王紅.酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測丙型肝炎病毒抗體在酶標儀應(yīng)用中的探討.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2012，9（10）：1234-1235.

［6］武利慶，楊彬，丁峰元，等.基于吸光度測定的洗板機校準方法及其不確定度評定.計量技術(shù)，2012，（5）：46-48.

［7］Le T，Yu H，Niu X.Detecting quinoxaline-2-carboxylic acid in animal tissues by using sensitive rapid enzyme-linked immunosorbent assay and time-resolved fluoroimmunoassay.Food Chem，2015，175：85-91.

［8］張桂芳，張永峰，張向峰，等.EDTA-K2對雙抗原夾心ELISA檢測HIV抗體的影響.檢驗醫(yī)學(xué)，2012，27（8）：676-678.

（張增武編輯）

The Application Evaluation of Automatic Vertical Plate Washer Method in the Enzyme-linked Immunosorbent Assay

HE Lu，LIU Li，KONG Fan-hong，CAO Jing-li，JIA Zi-qi，LIU Wen-song，XU Zhen，WANG Ya-jie
（Beijing Tiantan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China）

Objective To evaluate the application effect of automatic vertical plate washer method compared with traditional manual plate washer method and horizontal injection liquid type plate washer method in the enzyme-linked immunosorbent assay.Methods Evaluating the performance of the instrument which use the automatic vertical plate washer method，including the measurement of liquid residue in microporous，needle blocking probability detection and cross contamination possibility.A total of 120 serum samples with the quantitative test results of the hepatitis B surface antigen bychemiluminescence methodwere collected.The samples were divided into four groups equally，which were negative，weak positive，positive，strong positive.Each group had 30 cases.The hepatitis B virus surface antigen diagnostic kits based on enzyme-linked immunosorbent assayprinciple were used，the plates were washed by manual plate washer method，horizontal injection liquid type plate washer method，automatic vertical plate washer methodrespectively.The results were read by enzyme reader and the plate washing time was recorded.The data were analyzed by χ2test.Results this study，the average of liquid residue in microporous was 0.0087±0.0002μL，less than 0.01μL.After using automatic vertical plate washer for six months（at least twice a week），96 needles haven't been blocked.The linear water column length of the washer was 6.53±0.27 cm，it was 6.58±0.31 cm six months later.The data of two groups had no statistical difference.The cross test of positive quality product and negative quality product did not have cross contamination.So did the cross test of positive mixed samples and negative mixedsamples.The qualitative test results of 120 clinical samples by using three kinds of plate washer method were consistent.In the 30 cases of weakly positive samples，all three method could detect one false negative result respectivelyand the serum came from the same sample，the detection of negative，weak positive，positive，strong positive samples had no statistical difference by using three plate washer method（P＞0.05）.The time of washing a plate by using three kinds of plate washer method was 8min，5min，20s respectively.Conclusion The automatic vertical plate washer method can meet the clinical requirement of washing plates in the enzyme-linked immunosorbent assay.

Automaticvertical plate washer method； Manual plate washer method； Horizontal injection liquid type plate washer method； Enzyme-linked immunosorbentassay； Hepatitis B virus surface antigen

10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.09.027

2016-02-16；

2016-03-28

國家自然科學(xué)基金（81572474）；北京市中醫(yī)藥科技發(fā)展資金項目（JJ2015-14）；首都醫(yī)科大學(xué)校長基金（2015JYY80）

王雅杰。E-mail：tiantanwyj@aliyun.com