丙戊酸和2-己基-4-戊炔酸對乳腺癌易感基因2失活的成纖維細(xì)胞放射增敏作用及其機(jī)制

韓永濤，蔡祖超，鳳志慧

（山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院 1.齊魯醫(yī)院藥劑科，2.公共衛(wèi)生學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學(xué)系，山東 濟(jì)南 250000；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，浙江 杭州 310000）

放射治療作為目前常用的腫瘤臨床治療手段，常出現(xiàn)放射抗性和全身性不良反應(yīng)，極大地降低放射治療功效。放射增敏劑既能增加放射治療的敏感性，還可有效避免放射治療過程中產(chǎn)生的全身性不良反應(yīng)。因此，尋找安全有效的放射增敏劑已成為目前腫瘤放射治療領(lǐng)域的一項(xiàng)重大課題。

丙戊酸（valproate，VPA）是臨床上常用的抗癲癇病藥物，2-己基-4-戊炔酸（2-hexyl-4-pentynoic acid，HPTA）為其衍生物之一。VPA 和HPTA 均為組蛋白去乙?；敢种苿?，HPTA 的IC50比VPA（348～448 μmol·L-1）低，僅為11～15 μmol·L-1［1-2］，提示HPTA 可能是更加高效的VPA 替代物。本課題組在動物和細(xì)胞水平研究表明，VPA 和HPTA 對腫瘤組織或細(xì)胞具有放射增敏作用［2-10］，兩者作為DNA 損傷修復(fù)抑制劑，可靶向泛素連接酶RFWD3促進(jìn)重組酶Rad51泛素化，降低Rad51蛋白表達(dá)，抑制DNA雙鏈斷裂（DNA double strand breaks，DSB）損傷修復(fù)的同源重組（homologous recombination，HR）。HR是一種準(zhǔn)確無誤的DNA損傷修復(fù)形式，乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene1，BRCA1）和重組酶Rad51 是HR 修復(fù)的關(guān)鍵酶，其功能狀態(tài)直接影響DNA損傷修復(fù)及基因組的穩(wěn)定性。BRCA2 也可通過與Rad51 特異性結(jié)合募集Rad51 到DNA DSB 區(qū) 域，調(diào)控Rad51 參與HR 修復(fù)［11-12］。BRCA1 和BRCA2 可共存于一個蛋白復(fù)合物，提示BRCA1 可能調(diào)控BRCA2 和Rad51參與HR 的修復(fù)［13-14］。雖然BRCA2 在HR 調(diào)控中具有重要的作用，但在BRCA2失活的EUFA423 成纖維細(xì)胞中也檢測到IR所誘導(dǎo)的Rad51焦點(diǎn)形成，表明Rad51 亦參與HR 修復(fù)［15］。由此推測，VPA 和HPTA 作為DNA 損傷修復(fù)抑制劑，也可能影響B(tài)RCA2失活的EUFA423 細(xì)胞對放射的敏感性。為此，本研究應(yīng)用BRCA2雙等位基因失活的EUFA423細(xì)胞，探討VPA和HPTA對其放射敏感性的影響，為其應(yīng)用于臨床腫瘤放射治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

EUFA423 細(xì)胞（Dana-Fabar Cancer Institute Alan D D′Andrea 博士饋贈）。彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒（美國Invitrogen 公司）；DAPI 染液（美國Genecopoeia 公司）；VPA、HPTA、結(jié)晶紫和小鼠抗兔磷酸化組蛋白（phosphorylated histone，γH2AX）抗體（一抗）（美國Sigma公司）；小鼠抗兔BRCA1抗體和兔抗小鼠Rad51 抗體（一抗）（美國Santa Cruz 公司）；兔抗小鼠53BP1抗體（一抗）（美國GeneTex公司）；GAPDH 抗體（一抗）（中國中杉金橋公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體（二抗）（美國Thermo Fisher公司）；Alex-arFlour488熒光標(biāo)記雞抗兔IgG抗體和ALex-arFlour594 熒光標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 抗體（二抗）（美國Molecular Probe 公司）。X-RAD225 OptiMAX 型X 射線輻照儀（美國PXi 公司）；IX71型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

取生長狀態(tài)良好的EUFA423 細(xì)胞，按每皿細(xì)胞總數(shù)2×103接種于p60培養(yǎng)皿中。實(shí)驗(yàn)分為電離輻射（ionizing radiation，IR）0（細(xì)胞對照），2，4 和6 Gy組，VPA+IR 0，2，4 和6 Gy 組（VPA 預(yù)處理24 h 后進(jìn)行IR）和HPTA+IR 0，2，4 和6 Gy 組（HPTA 預(yù)處理24 h 后進(jìn)行IR），每組3 平行樣。VPA 和HPTA濃度分別為500和15 μmol·L-1，選擇依據(jù)為本課題組前期研究結(jié)果［1-4，8-9］。X射線劑量率為2.25 Gy·min-1，2，4和6 Gy照射時間分別為0.89，1.78和2.67 min。IR 處理結(jié)束后30 min 各組進(jìn)行細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)［8］，14 d后觀察到明顯的細(xì)胞克隆形成，計數(shù)各組細(xì)胞克隆形成數(shù)目，并計算細(xì)胞克隆形成率。細(xì)胞克隆形成率（%）=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 中性和堿性彗星實(shí)驗(yàn)檢測DNA雙鏈斷裂損傷

取生長狀態(tài)良好的EUFA423 細(xì)胞，按每皿細(xì)胞總數(shù)3×104接種于p35 培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞對照、VPA、HPTA、IR 對照、VPA+IR 和HPTA+IR組，每組3 平行樣。IR 劑量為8 Gy，照射時間為3.56 min。VPA 和HPTA 濃度及處理同1.2。照射后0，30 和60 min，各組進(jìn)行中性和堿性彗星實(shí)驗(yàn)［8］。Cometscore 軟件分析細(xì)胞核拖尾長度和DNA DSB 百分率。DNA DSB 百分率（%）=實(shí)驗(yàn)組彗星拖尾長度/細(xì)胞對照組彗星拖尾長度×100%。

1.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測EUFA423 細(xì)胞中γH2AX，53BP1，BRCA1和Rad51蛋白焦點(diǎn)形成

取生長狀態(tài)良好EUFA423 細(xì)胞，按每孔細(xì)胞總數(shù)2×104接種于8 孔載玻片小室內(nèi)，分組和處理同1.3。IR 處理結(jié)束后恢復(fù)6 和24 h，免疫熒光法檢測EUFA423 細(xì)胞中γH2AX，53BP1，BRCA1 和Rad51 蛋 白 焦 點(diǎn) 形 成［2，8］，小 鼠 抗 兔γH2AX 和BRCA1 抗體稀釋倍數(shù)分別為1∶500 和1∶100，兔抗小鼠Rad51 和53BP1 抗體稀釋倍數(shù)為1∶100 和1∶1000。免疫熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)500 個細(xì)胞中γH2AX，53BP1，BRCA1 和Rad51 蛋白焦點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)。每細(xì)胞內(nèi)焦點(diǎn)數(shù)＞20的細(xì)胞為目的蛋白陽性細(xì)胞。

1.5 Western印跡法檢測EUFA423 細(xì)胞中γH2AX，53BP1，BRCA1和Rad51蛋白表達(dá)水平

取生長狀態(tài)良好的EUFA423 細(xì)胞，按1.3 分組處理。IR 處理結(jié)束后6 h，RIPA 裂解各組細(xì)胞，離心取上清液；BCA 法檢測蛋白質(zhì)濃度。每組上樣量為60 μg，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳；轉(zhuǎn)印至PVDF膜，BSA 封閉后加入對應(yīng)的一抗（稀釋倍數(shù)為γH2AX：1∶500，53BP1：1∶1000，BRCA1：1∶200，Rad51：1∶500，GAPDH：1∶2000），4 ℃孵育過夜；TBST 洗3 次后加入相應(yīng)二抗（1∶2000），室溫孵育1 h；TBST再次洗3次后進(jìn)行ECL顯影。用Image J軟件分析蛋白條帶積分吸光度，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度比值表示目標(biāo)蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS23.0 軟件進(jìn)行多樣本比較，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）或多因素方差分析（two-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VPA和HPTA增加EUFA423細(xì)胞放射敏感性

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，與細(xì)胞對照組比較，VPA 和HPTA 對未照射EUFA423 細(xì)胞生長均無明顯影響；給予EUFA423 細(xì)胞IR 4 和6 Gy 處理后，與同劑量IR 對照組比較，VPA+IR 和HPTA+IR 組細(xì)胞克隆形成率均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），但VPA+IR 和HPTA+IR 兩組之間無明顯差異。由此表明，VPA 500 μmol·L-1及其衍生物HPTA 15 μmol·L-1對EUFA423 細(xì)胞具有相似的放射增敏作用，也表明較低濃度的HPTA 即能顯示顯著的放射增敏作用。

Fig.1 Effect of valproate（VPA）and 2-hexyl-4-pentynoic acid（HPTA）on radiosensitivity in EUFA423 cells by clone formation assay. The cells were divided into ionizing radiation（IR）0（cell control），2，4 and 6 Gy groups，VPA+IR 0，2，4 and 6 Gy groups（cultured with VPA 500 μmol·L-1 for 24 h before IR），and HPTA+IR 0，2，4 and 6 Gy groups（cultured with HPTA 15 μmol·L-1 for 24 h before IR）. B was the quantitative analysis result of A. Colony-forming efficiency（%）=number of clone formation/number of inoculated cells×100%.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding dose of IR control group.

2.2 VPA和HPTA增加EUFA423細(xì)胞中l(wèi)R誘導(dǎo)的DNA損傷蓄積

堿性彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2A1）提示，與相應(yīng)未照射組相比，IR 各組（IR 后0，30 和60 min）胞核拖尾長度顯著增加，但隨時間延長增加的胞核拖尾長度逐漸縮短，表明IR 可誘導(dǎo)EUFA423 細(xì)胞產(chǎn)生明顯的DNA DSB 損傷。圖2A2 結(jié)果顯示，與同時間IR對照組相比，照射后0，30 和60 min，VPA+IR 組DNA DSB 百分率均顯著增加到IR 對照組的1.41，1.52和1.83倍（P＜0.01），HPTA+IR 組增加到1.41，1.54 和1.87 倍（P＜0.01）。中性彗星實(shí)驗(yàn)也觀察到相似的結(jié)果（圖2B）。

Fig.2 Effect of VPA and HPTA on DNA double strand breaks（DSB）in response to radiation in EUFA423 cells by alkaline comet assay（A），neutral comet assay（B），immunofluorescence assay（C）and Western blotting（D）.See Fig.1 for the cell treatment.IR control，VPA+IR and HPTA+IR groups were treated with IR 8 Gy.Percentage of DNA DSB（%）=Comet tailing length in the experimental group/comet tailing length in the cell control group×100%. γH2AX：phosphorylated histone；IA：integrated absorbance. A2 and B2 were the quantitative analysis results of A1（×200）and B1（×200），respectively；C2 and C3 were the quantitative analysis results of C1（×1000）；D2 and D3 were the semi-quantitative analysis results of D1.±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with corresponding no IR group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with corresponding IR control group.

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2C）顯示，與相應(yīng)未照射組相比，IR 各組IR 后6 和24 h EUFA423 細(xì)胞γH2AX 和53BP1 焦點(diǎn)陽性細(xì)胞百分率均顯著升高（P＜0.01）。IR 處理后6 h，VPA+IR 組γH2AX 和53BP1 焦點(diǎn)陽性細(xì)胞百分率較IR 對照組增加了32.5% 和25.5%（P＜0.01），HPTA+IR 組增加了33.2%和27.2%（P＜0.01）。IR 處理后24 h，VPA+IR 和HPTA+IR 組γH2AX 和53BP1 焦點(diǎn)陽性細(xì)胞百分率仍顯著高于IR對照組（P＜0.01）。

Western 印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2D）顯示，IR 結(jié)束后6 h，與相應(yīng)未照射組相比，IR 各組EUFA423 細(xì)胞γH2AX 和53BP1 蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.01）。VPA+IR 和HPTA+IR 組EUFA423 細(xì)胞γH2AX 蛋白表達(dá)水平較IR 對照組分別增加了74.3%（P＜0.01）和34.2%（P＜0.05），53BP1 蛋白表達(dá)水平增加了108.8%和52.7%（P＜0.01）。

以上結(jié) 果表明，VPA 500 μmol·L-1和HPTA 15 μmol·L-1可增加EUFA423 細(xì)胞中IR誘導(dǎo)的DNA損傷蓄積。

2.3 VPA 和HPTA 抑 制EUFA423 細(xì)胞Rad51和BRCA1蛋白表達(dá)

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3A）表明，與相應(yīng)未照射組相比，IR 各組EUFA423 細(xì)胞Rad51 焦點(diǎn)陽性細(xì)胞百分率明顯增加（P＜0.01）。與IR 對照組相比，IR處理后6 h，VPA+IR 和HPTA+IR 組EUFA423 細(xì)胞Rad51 焦點(diǎn)陽性細(xì)胞百分率分別顯著降低了33.1%和35.8%（P＜0.01）；IR處理后24 h，VPA+IR 和HPTA+IR 組Rad51 焦點(diǎn)陽性細(xì)胞百分率亦明顯降低（P＜0.01）。另一個HR 相關(guān)蛋白BRCA1 焦點(diǎn)陽性細(xì)胞百分率變化趨勢與Rad51相似。

Fig.3 Effect of VPA and HPTA on DNA repair proteins in response to lR-induced DNA DSB in EUFA423 cells by immunofluorescence assay（A）and Western blotting（B）. See Fig.2 for the cell treatment. BRCA1：breast cancer susceptibility gene 1. A2 and A3 were the quantitative analysis results of A1（×1000）；B2 and B3 were the semi-quantitative analysis results of B1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding no IR group；##P＜0.01，compared with corresponding IR control group.

Western 印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3B）顯示，IR 結(jié)束后6 h，與相應(yīng)未照射組相比，BRCA1蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），Rad51 蛋白水平無明顯變化；與IR 對照組相比，VPA+IR 和HPTA+IR 組EUFA423細(xì)胞Rad51 和BRCA1 蛋白表達(dá)水平被顯著抑制（P＜0.01）。

上述結(jié)果提示，VPA 和HPTA 對EUFA423 細(xì)胞的放射增敏作用與其抑制DNA 修復(fù)蛋白Rad51和BRCA1表達(dá)有關(guān)。

3 討論

本課題組前期應(yīng)用多種腫瘤細(xì)胞（如乳腺癌MCF7 和骨肉瘤U2OS 細(xì)胞）以及乳腺癌大鼠模型研究表明，VPA及其衍生物HPTA作為DNA損傷修復(fù)抑制劑，在細(xì)胞和動物水平上可通過抑制HR 機(jī)制中關(guān)鍵蛋白BRCA1 和Rad51 活性，對腫瘤組織或細(xì)胞發(fā)揮放射增敏作用［2-4，8，10］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，VPA 和HPTA 還可顯著增強(qiáng)BRCA2雙等位基因失活EUFA423 成纖維細(xì)胞對放射的敏感性，其機(jī)制亦與靶向抑制BRCA1 介導(dǎo)的HR 修復(fù)通路有關(guān)。由此提示，VPA 和HPTA 可下調(diào)HR 通路增強(qiáng)BRCA2 功能失活EUFA423 細(xì)胞對放射的敏感性。

EUFA423 細(xì)胞由Alan D D′Andrea 研究小組首次報道和建立［16］，來源于范氏貧血（Fanconi anemia，F(xiàn)A）患者的成纖維細(xì)胞。該細(xì)胞中BRCA2基因（也稱為FANCD1，F(xiàn)anconi anemia complementation group D1，F(xiàn)A 互補(bǔ)組基因D1）發(fā)生雙等位基因突變（7691 insAT 和9900 insA）引起移碼突變，從而編碼C 端截短的BRCA2 蛋白。因此，EUFA423 細(xì)胞所攜帶的BRCA2雙等位基因失活，該基因失活可能導(dǎo)致類似于在BRCA1或BRCA2突變家族中觀察到的癌癥風(fēng)險。EUFA423 細(xì)胞是目前被普遍認(rèn)可的BRCA2缺失細(xì)胞，常用于BRCA2相關(guān)功能研究［15-17］。

BRCA2 是HR 修復(fù)過程中的關(guān)鍵蛋白，可直接調(diào)控Rad51 活性，在DNA DSB 修復(fù)中發(fā)揮重要作用［11］。研究報道，BRCA2缺失的EUFA423 細(xì)胞對放射敏感性增強(qiáng)［17］。本研究結(jié)果表明，VPA 和HPTA 可進(jìn)一步增強(qiáng)其放射敏感性。由此推測，在BRCA2失活的EUFA423 細(xì)胞中還存在著不依賴于BRCA2 調(diào)控的HR 修復(fù)通路，BRCA1 和Rad51可能參與其調(diào)控。①本課題組既往研究表明，在哺乳動物細(xì)胞中有2條獨(dú)立的調(diào)控Rad51-HR 修復(fù)通路，它們分別由BRCA2 和Rad52 所介導(dǎo)［15］；換言之，在BRCA2缺失細(xì)胞中還存在著Rad52/Rad51調(diào)控的HR修復(fù)通路，它不依賴于BRCA2［15］，提示靶向抑制Rad52 介導(dǎo)HR 修復(fù)通路可進(jìn)一步增強(qiáng)BRCA2缺失細(xì)胞對放射的敏感性，導(dǎo)致細(xì)胞合成致死性。②本研究結(jié)果表明，在應(yīng)答DNA 損傷反應(yīng)中，BRCA1 和Rad51 表達(dá)增加；VPA 和HPTA 可顯著抑制IR 導(dǎo)致增加的BRCA1 和Rad51 表達(dá)，提示在BRCA2失活的EUFA423 細(xì)胞中BRCA1 和Rad51 還可發(fā)揮DNA 損傷修復(fù)作用。由上述結(jié)果推測，VPA 和HPTA 作為DNA 損傷修復(fù)抑制劑，有可能通過BRCA1 抑制Rad52/Rad51 通路，對EUFA423 細(xì)胞發(fā)揮放射增敏作用，但兩者的細(xì)胞放射增敏作用是否與其抑制Rad52 功能有關(guān)還需深入探討。此外，本研究結(jié)果還需應(yīng)用另一種BRCA2失活Capan-1 細(xì)胞對VPA 和HPTA 放射增敏作用進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究選擇的VPA 濃度500 μmol·L-1為臨床上治療癲癇病的血藥濃度；同時基于VPA 和HPTA抑制組蛋白去乙?；富钚?，推算HPTA 用于臨床治療的血藥濃度可能為15 μmol·L-1［1-2］。本研究選用VPA 和HPTA 的臨床使用劑量，研究結(jié)果更具有實(shí)際臨床意義。同時，在HPTA 濃度遠(yuǎn)低于VPA 濃度時，即顯示出與高濃度VPA 相似的放射增敏作用，提示HPTA 可能是更加高效的VPA 替代物。本研究結(jié)果可為VPA 及其衍生物應(yīng)用于腫瘤患者放射增敏治療提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。