大黃素在人肝腸微粒體的葡萄糖醛酸化反應(yīng)

劉 薇， 王一飛△， 劉中秋

(1廣州暨南生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地有限公司，廣州 廣東 510632； 2南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，廣州 廣東 510515)

1000-4718(2012)09-1681-05

2012-04-10

2012-07-11

△通訊作者 Tel: 020-85220908 ; E-mail: twangyf@jnu.edu.cn

大黃素在人肝腸微粒體的葡萄糖醛酸化反應(yīng)

劉 薇1， 王一飛1△， 劉中秋2

(1廣州暨南生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地有限公司，廣州 廣東 510632；2南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，廣州 廣東 510515)

目的研究體外人肝腸微粒體孵育體系中大黃素的葡萄糖醛酸化代謝情況，并找出參與大黃素葡萄糖醛酸化代謝的人尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)亞型。方法用超高效液相色譜法(UPLC)，檢測(cè)大黃素的葡萄糖醛酸化代謝情況，將代謝產(chǎn)物進(jìn)行純化后，用質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)法進(jìn)一步鑒定其結(jié)構(gòu)。用人的重組化表達(dá)的UGT單酶，鑒定可能參與大黃素葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)的UGT亞型。結(jié)果大黃素葡萄糖醛酸代謝僅產(chǎn)生大黃素- 氧- 單葡萄糖醛酸這一個(gè)代謝產(chǎn)物。大黃素在人的肝、腸微粒體中的代謝屬經(jīng)典的米氏方程動(dòng)力學(xué)行為，除 UGT1A4和UGT2B17外，其它10種UGT亞型均參與了大黃素的葡萄糖醛酸化反應(yīng)。結(jié)論大黃素在人肝腸微粒體孵育體系中會(huì)被代謝成為一個(gè)單葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。大黃素的主要代謝部位是腸道。

大黃素; 葡萄糖醛酸化反應(yīng); 微粒體

大黃為蓼科多年生草本植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根及根莖，味苦性寒，具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的功用[1]。蒽醌類衍生物是大黃中主要的活性成分，主要有大黃素(emodin)、大黃酸(rhein)等，其中以大黃素的含量最高[2]。大黃及其含有蒽醌類成分的其它中藥如決明子、何首烏和蘆薈等也因其瀉下作用而被廣泛應(yīng)用于具有減肥功能和清毒解熱的保健食品中[3-4]。我們研究發(fā)現(xiàn)，口服大黃素后血漿中的血藥濃度極低，而被葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶所代謝的大黃素葡萄糖醛酸苷的血藥濃度很高，Cmax是大黃素的30倍；靜注時(shí)大黃素亦可轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸化產(chǎn)物[5]。 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferases, UGTs)是藥物在機(jī)體中發(fā)生II相代謝反應(yīng)時(shí)最重要的代謝酶[6]，將體內(nèi)的葡萄糖醛酸與許多具有藥理活性的化合物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。多酚類化合物或結(jié)構(gòu)中有醇、硫醇、胺等基團(tuán)的藥物能較易被UGT酶所代謝[7]。蒽醌類化合物大黃素是典型的多酚類化合物。葡萄糖醛酸化反應(yīng)在蒽醌類化合物的代謝過程中發(fā)揮著重要的作用[8]。且大黃素的葡萄糖醛酸化產(chǎn)物的活性有可能比原型化合物更強(qiáng)，也有可能截然不同?？疾齑簏S素在體外人肝、腸微粒體孵育體系中葡萄糖醛酸化代謝反應(yīng)以及大黃素在人不同的UGT亞型中的代謝情況，為進(jìn)一步理解大黃素在人體中的代謝行為以及大黃素的藥效學(xué)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論支持。

材 料 和 方 法

1藥品、試劑與儀器

大黃素對(duì)照品(純度>98%)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(uridine 5’-diphospho-glucuronic acid，UDPGA)、丙甲菌素, D-葡萄糖二酸-1，4-內(nèi)酯等均購于Sigma; 人肝微粒體、人腸微粒體和12種人源重組UGTs(UGT1A1、UGT1A3、 UGT1A4、 UGT1A6、 UGT1A7、 UGT1A8、UGT1A9、UGT1A10、UGT2B4、UGT2B7、UGT2B15和UGT2B17)均購于BD Gentest。乙腈, 色譜純; MgCl2、NaCl、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、二甲基亞砜、醋酸銨以及其它試劑, 均為AR 級(jí), 廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Waters產(chǎn)品; 恒溫水浴箱, MS3 digital渦旋儀, IKA產(chǎn)品; 5424離心機(jī), Eppendorf產(chǎn)品; NI-2RC 渦旋儀, 美國熱電儀器公司產(chǎn)品; 純水蒸餾器, Milipore產(chǎn)品。

2主要方法

2.1各種溶液的制備 (1)大黃素貯備液：精密稱取大黃素1.35 mg,以50%甲醇和50%乙醇的混合溶液配成1.35 g/L，即5 mmol/L的貯備液。實(shí)驗(yàn)時(shí), 用磷酸緩沖液稀釋成各種濃度。(2)溶液A(solution A)：二磷酸尿苷葡萄糖醛酸25 mmol/L即807.75 mg溶于50 mL雙蒸水中，混勻至完全溶解。每管分裝1 mL，標(biāo)記好，放置4 ℃冰箱備用。(3)溶液B(solution B)：MgCl219.042 mg溶于40mL 雙蒸水中，至溶解；5 mg丙甲菌素溶于100 μL甲醇中，全部移至40 mL MgCl2中，超聲10～20 min。210 mg D-葡萄糖二酸1，4-內(nèi)酯溶于40.1 mL的混合溶液中，渦旋至溶解即可。每管分裝1 mL，標(biāo)記好，放置4 ℃冰箱備用。(4)KPI溶液(磷酸緩沖溶液)：取磷酸氫二鈉68.9 g和磷酸二氫鈉78.9 g, 加蒸餾水至1 000 mL, 用NaOH 調(diào)pH為7.2。

2.2大黃素葡萄糖醛酸化反應(yīng)(微粒體酶反應(yīng)) 從-20 ℃冰箱取出溶液A、溶液B、微粒體(或UGT酶)和磷酸緩沖液放置37 ℃水浴上解凍，大黃素貯備液用磷酸緩沖液稀釋至4 mmol/L、3 mmol/L、2 mmol/L、1.5 mmol/L、1 mmol/L、0.75 mmol/L、0.5 mmol/L、0.25 mmol/L、0.125 mmol/L等從高到低9個(gè)濃度。向EP管中分別依次加入磷酸緩沖液421.2 μL、溶液B、微粒體或UGT酶、不同濃度的藥物和溶液A，關(guān)上蓋子，用力渦旋30 s，再將每個(gè)管中的混合溶液分裝成另外3個(gè)管，每管200 μL，迅速放入37 ℃水浴鍋孵育10 min，取出，重新放置冰浴上，往每管加入100 μL含睪丸酮(50 μmol/L)的乙腈溶液，終止反應(yīng)。13 000 r/ min 離心 15 min，取上清液10 μL進(jìn)樣UPLC。

2.3分析條件 色譜條件：色譜柱：BEH C18，1.7 μm, 2.1×50 mm。流動(dòng)相：乙腈(B)與2.5 mmol/L醋酸銨水溶液，pH 7.4 (A)；梯度洗脫：0 ～ 0.1 min， 85%A，0.1～1.8 min，85%～60%A，1.8 ～ 2.2 min，60%～40%A，2.2～2.8 min，40%～85%A，2.8～3.2 min，85%A；流速：0.4 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣體積10 μL。色譜系統(tǒng)：Waters ACQUITY UPLC with Photodiode Array Detector and Empower software。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)，采用負(fù)離子檢測(cè)方式，毛細(xì)管電壓4.5 kV，離子源溫度350 ℃，離子源噴射電壓4.5 kV，去溶劑溫度 108 ℃，霧化氣流(氣流1)為氮?dú)猓?0 psi，離子源氣流(氣流2)為氬氣，20 psi。采用一級(jí)全掃描質(zhì)譜及選擇離子全掃描二級(jí)質(zhì)譜(full scan MS2)兩種方式同時(shí)測(cè)定。核磁條件：Bruker 400 MHz。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1UPLC法鑒別大黃素及其二相代謝結(jié)合物

大黃素在人的肝、腸微粒體以及UGT酶的孵育體系下反應(yīng)后，均產(chǎn)生了同一個(gè)新的化合物，在1.92 min時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)新的峰，見圖1A，大黃素和內(nèi)標(biāo)液的保留時(shí)間分別為2.77 min和2.42 min。利用紫外檢測(cè)器對(duì)此峰進(jìn)行PDA掃描，可見此物質(zhì)有2個(gè)最大吸收波長(zhǎng)，分別是225.2 nm和262.9 nm。與原形藥物的紫外PDA圖譜相對(duì)比，大黃素有3個(gè)吸收波長(zhǎng)：230.5 nm、253.5 nm和291.3 nm。兩者的吸收波長(zhǎng)相似，可以初步判定，這個(gè)新的產(chǎn)物是大黃素的衍生物,見圖1B。

Figure 1. UPLC chromatogram (A) and UV spectrum (B) of emodin and its metabolite after incubated with various microsomes. M: metabolite; IS: internal standard.

圖1經(jīng)微粒體孵育后大黃素及其代謝產(chǎn)物的UPLC色譜圖和紫外圖譜

2LC/MS/MS鑒別大黃素的二相代謝結(jié)合物

大黃素經(jīng)人肝、腸微粒體以及UGTs酶孵育后，其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜分析見圖2，此物質(zhì)的質(zhì)譜圖顯示樣品產(chǎn)生的分子離子質(zhì)荷比m/z為445.0780，計(jì)算推導(dǎo)所得的分子式為C21H17O11分子量445.0776)，與大黃素的分子量與葡萄糖醛酸分子量之和相吻合，可推斷為(大黃素-葡萄糖醛酸結(jié)合物-H)-，另一主要的分子離子峰在質(zhì)荷比269.0462，可推斷為(大黃素葡萄糖醛酸結(jié)合物-葡萄糖醛酸)-，與大黃素分子量-H相吻合。

Figure 2. Mass spectrum of emodin glucuronide.

圖2大黃素二相代謝產(chǎn)物(大黃素葡萄糖醛酸結(jié)合物)質(zhì)譜圖

31H-NMR法確定大黃素葡萄糖醛酸結(jié)合物結(jié)構(gòu)式

大黃素與其葡萄糖醛酸結(jié)合物的一維核磁共振氫譜(1H-NMR)圖表明，兩者氫譜上的信號(hào)十分相似，但后者發(fā)現(xiàn)了糖基的化學(xué)位移值(δ)變化，如H-1’ 上δ5.14 (1H, d,J=8 Hz) 和 H-5’ 上的δ4.21 (1H, d,J=8 Hz)，可以判定葡萄糖醛酸上的這兩個(gè)H的位置與大黃素結(jié)合位置有關(guān)。從大黃素的葡萄糖醛酸結(jié)合物的二維ROSEY(見圖3)氫譜中可以看出，在化學(xué)位移值H-4 (δ7.45) 和H-2 (δ6.96) 都與糖基上的H1’ (δ5.14) 有關(guān)，可以確定，葡萄糖醛酸結(jié)合在大黃素的3位羥基上(3-OH)。因此大黃素經(jīng)UGTs代謝途徑得到的II相代謝產(chǎn)物為大黃素-3-O-葡萄糖醛酸(emodin 3-O-β-D-glucuronide)，見圖3B。

Figure 3. NOESY spectrum (A) and structure formula (B) of emodin glucuronide. The nuclear Overhauser effect (NOE) was related to anomeric proton, H-2 and H-4.

圖3大黃素葡萄糖醛酸結(jié)合物的二維NOESY氫譜圖和結(jié)構(gòu)式

4大黃素在人的肝、腸微粒體中代謝的酶動(dòng)力學(xué)考察

我們考察并計(jì)算了大黃素在人的肝、腸微粒體的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并繪制出Eadie-Hofstee 圖以確定藥物代謝的種類。大黃素與葡萄糖醛酸結(jié)合的結(jié)合速率與大黃素濃度的酶促動(dòng)力學(xué)曲線見圖4，結(jié)果顯示大黃素的代謝在其高濃度的時(shí)候呈現(xiàn)飽和現(xiàn)象，Eadie-Hofstee圖見圖4中的插圖，從圖上可以看出大黃素?zé)o論在人肝微粒體還是腸微粒體中的代謝符合典型的米氏方程。

圖4大黃素在人肝微粒體和腸微粒體中葡萄糖醛酸化反應(yīng)的酶促動(dòng)力學(xué)曲線

5人的12種UGT同工酶對(duì)大黃素的葡萄糖醛酸化的影響

我們選取了高、中、低3個(gè)濃度的大黃素(2.5、10、40 μmol/L)，分別考察它們?cè)诓煌说腢GT同工酶中的代謝速率的差異。大黃素濃度在2.5 μmol/L時(shí)不同的UGT同工酶對(duì)其催化反應(yīng)速率，快慢的排列順序依次為：UGT1A10[(4.30±0.98) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A9[(1.74±0.23) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A8[(1.47±0.08) μmol·(g protein)-1·min-1]≈UGT1A1[(1.28±0.03) μmol·(g protein)-1·min-1]≈UGT2B7[(1.19±0.04) μmol·(g protein)-1·min-1] >UGT1A7[(0.58±0.03) μmol·(g protein)-1·min-1]；大黃素濃度在10 μmol/L時(shí)不同的UGT同工酶對(duì)其催化反應(yīng)速率，快慢的排列順序依次為：UGT1A10[(8.35±1.40) μmol·(g protein)-1·min-1] >UGT1A9[(4.00±0.29) μmol·(g protein)-1·min-1]≈UGT1A8[(3.98±0.70) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT2B7[(2.50±0.15) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A1[(2.15±0.79) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A7[(1.31±0.25) μmol·(g protein)-1·min-1]；大黃素濃度在40 μmol/L時(shí)不同的UGT同工酶對(duì)其催化反應(yīng)速率，快慢的排列順序與10 μmol/L大黃素相同，依次為：UGT1A10[(10.96±0.80) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A9[(5.40±0.60) μmol·(g protein)-1·min-1]≈UGT1A8[(4.87±0.31) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT2B7[(3.17±0.13) μmol·(g protein)-1·min-1]≈UGT1A1[(2.81±0.49) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A7[(2.13±0.20) μmol·(g protein)-1·min-1](P<0.05)。因此無論大黃素的濃度如何， UGT1A10、1A9、1A8、2B7和1A1始終是最重要的代謝大黃素的幾個(gè)同工酶。

討 論

大黃素(1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌)是有著3個(gè)酚羥基的蒽醌類化合物，因此其羥基位置極易與葡萄糖醛酸結(jié)合，我們先后使用了人的肝微粒體、人的腸微粒體和人的重組化UGTs酶等對(duì)大黃素進(jìn)行孵育實(shí)驗(yàn)，色譜和質(zhì)譜結(jié)果證明大黃素極易被代謝成大黃素-葡萄糖醛酸化物，而且不同的肝腸微粒體酶代謝反應(yīng)產(chǎn)生的新化合物均在同一時(shí)間出峰，證明生成的代謝產(chǎn)物為同一化合物，經(jīng)核磁氫譜的結(jié)果判定此化合物為大黃素-3-O-葡萄糖醛酸。而大黃素的幾種相似物如大黃酸等，我們前期實(shí)驗(yàn)也進(jìn)行了肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)，但都未見有新的化合物產(chǎn)生，究其原因，它們的蒽醌母核在3位上均無酚羥基，這也可能是這幾類藥物無法產(chǎn)生葡萄糖醛酸化反應(yīng)的原因。

近年來，人們對(duì)大黃蒽醌類化合物的代謝過程越來越重視，大黃的安全性亦日益倍受關(guān)注。美國NIH對(duì)大黃素和大黃蒽醌進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)2年多的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加一定量大黃素，對(duì)F344/N雌性大鼠有誘發(fā)腺癌的可能[9]。因此，了解大黃蒽醌類化合物的代謝特點(diǎn)能夠使我們更清楚地了解該類化合物發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，將極大地促進(jìn)大黃素等化合物的藥用開發(fā)。葡萄糖醛酸化結(jié)合反應(yīng)是單羥基和多羥基蒽醌類藥物的主要代謝通路[10]。在我們前期對(duì)大黃素的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明其大黃素口服給藥大鼠后，主要以葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物的形式進(jìn)入體循環(huán)[5, 11]。Teng等[12]研究了大黃素在人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)中的代謝情況發(fā)現(xiàn)，主要代謝途徑為葡萄糖醛酸化代謝，其次是磺酸化代謝。而我們?cè)谥暗难芯恳舶l(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450 介導(dǎo)的氧化代謝很弱，說明葡萄糖醛酸化代謝是大黃素體內(nèi)主要代謝途徑。

目前鮮有報(bào)道大黃素在UGT1A或UGT2B亞家族中代謝研究。本實(shí)驗(yàn)填補(bǔ)了這一空白，我們將這兩大家族聯(lián)系在一起進(jìn)行系統(tǒng)的研究，能進(jìn)一步地促進(jìn)我們對(duì)大黃素代謝過程的了解。從結(jié)果中可以看出UGT1A 家族對(duì)大黃素的葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)起著主要作用，特別是UGT1A10、UGT1A9、UGT1A8和UGT1A1。而這些UGT的亞型與兩個(gè)最重要的代謝場(chǎng)所有關(guān)，UGT1A1在肝腸中都有分布，UGT1A9只在肝中表達(dá)，而UGT1A10、UGT1A8只在腸中表達(dá)。而UGT1A10對(duì)大黃素的代謝最快，和我們之前推斷的腸道是大黃素的主要代謝場(chǎng)所相吻合。

可以非?？隙ǖ氖牵簏S素的極低生物利用度與其溶解度低、在體內(nèi)易與葡萄糖醛酸結(jié)合而極性增強(qiáng)排出體外有直接的關(guān)系。

[1] 葉 青. 日本漢醫(yī)應(yīng)用大黃經(jīng)驗(yàn)探析 [J]. 中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育, 2005, 3(7): 19-21.

[2] 馮 琳，孫炳文，田香蘭. 大黃的臨床應(yīng)用 [J]. 四川中醫(yī)， 2011, 29(2): 52-53.

[3] 周明學(xué)，徐 浩，陳可冀，等. 幾種活血解毒中藥有效部位對(duì)ApoE基因敲除小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(11): 2097-2102.

[4] 曲曉義，陳 愉，金惠銘，等. 復(fù)方大黃制劑預(yù)防大鼠肥胖的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國病理生理雜志，2001,17(7):673-675.

[5] Liu W, Zheng Z, Liu X, et al. Sensitive and robust UPLC-MS/MS method to determine the gender-dependent pharmacokinetics in rats of emodin and its glucuronide [J]. J Pharm Biomed Anal, 2011, 54 (5): 1157-1162.

[6] Bosch TM. Pharmacogenomics of drug-metabolizing enzymes and drug transporters in chemotherapy [J]. Methods Mol Biol, 2008, 448: 63-76.

[7] Wu B, Basu S, Meng S, et al. Regioselective sulfation and glucuronidation of phenolics: insights into the structural basis [J]. Curr Drug Metab, 2011, 12 (9): 900-916.

[8] Liu W, Tang L, Ye L, et al. Species and gender differences affect the metabolism of emodin via glucuronidation [J]. AAPS J, 2010, 12 (3): 424-436.

[9] National Toxicology Program.NTP Toxicology and Carcinogenesis Studies of EMODIN (CAS NO. 518-82-1) Feed Studies in F344/N Rats and B6C3F1 Mice [J]. Natl Toxicol Program Tech Rep Ser, 2001, 493: 1-278.

[10]Shia CS, Juang SH, Tsai SY, et al. Metabolism and pharmacokinetics of anthraquinones inRheumpalmatumin rats andexvivoantioxidant activity [J]. Planta Med, 2009, 75 (13): 1386-1392.

[11]Shia CS, Hou YC, Tsai SY, et al. Differences in pharmacokinetics andexvivoantioxidant activity following intravenous and oral administrations of emodin to rats [J]. J Pharm Sci, 2010, 99(4): 2185-2195.

[12]Teng Z, Yuan C, Zhang F, et al. Intestinal absorption and first-pass metabolism of polyphenol compounds in rat and their transport dynamics in Caco-2 cells [J]. PLoS One, 2012, 7 (1): e29647.

Glucuronidationofemodininhumanliverandintestinalmicrosomes

LIU Wei1, WANG Yi-fei1, LIU Zhong-qiu2

(1GuangzhouJinanBiomedicineResearchandDevelopmentCenter,Guangzhou510632,China;2DepartmentofPharmaceutics,SchoolofPharmacy,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:twangyf@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the glucuronidation of emodin in human liver and intestinal microsomes, and to elucidate the UDP-glucuronosyltransferase (UGT) isoforms involved in emodin glucuronidation.METHODSAfter incubation of emodin usinginvitrohuman liver or intestinal microsomal system,ultra-performance liquid chromatography (UPLC) was utilized to determine the glucuronides of emodin. Mass spectrum(MS) and nuclear magnetic resonance(NMR) were employed to elucidate the structures of metabolite. Screening assays with recombinant human UGTs were used to identify the UGT isoforms involved in the glucuronidation of emodin.RESULTSOnly one metabolite was identified and elucidated to be emodin-O-monoglucuronide. The metabolic behavior of emodin was followed typical monophasic Michaelis-Menten kinetics. Except UGT1A4 and UGT2B17, the other 10 UGTs were determined to participate in the glucuronidation of emodin.CONCLUSIONEmodin-O-monoglucuronide is the only metabolite of emodin in the incubation system of human liver and intestinal microsome. Different microsomes are responsible for the metabolism of emodin in different organs/regions of the digestive system. The glucuronidation of emodin in the intestine contributes significantly to that of emodin in the liver.

Emodin; Glucuronidation; Microsomes

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.025