麻類脫膠菌的木糖發(fā)酵性能改造及初步檢驗(yàn)

李智敏 嚴(yán)理 朱作華 等

摘要：通過(guò)引入丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因改造麻類脫膠優(yōu)良菌株Ym68，以使其獲得利用木糖發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的能力。結(jié)果表明，雖然基因工程菌株P(guān)AP16的木糖利用率相對(duì)原始菌株Ym68差別不大，但明顯提高了代謝產(chǎn)物乙醇。在5%木糖發(fā)酵試驗(yàn)中，原始菌株Ym68的木糖發(fā)酵液中乙醇含量低于0.2%，而改造后的菌株P(guān)AP16木糖發(fā)酵液的乙醇含量上升到1.6%。盡管此次基因改造可能影響了菌體表面特性，使得PAP16菌株容易形成凝聚而降低脫膠活性；但該菌株同時(shí)具備了脫膠預(yù)處理和產(chǎn)生目的產(chǎn)物乙醇兩種性能，這對(duì)研究原料預(yù)處理和提高原料利用率較為有利。

關(guān)鍵詞：脫膠菌；木糖發(fā)酵；乙醇

中圖分類號(hào)：S563；S216 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）04-1031-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.054

Genetic Engineering of the Xylose Fermentation Property in Hemp

Degumming Bacteria and Preliminary Testing

LI Zhi-min，YAN Li，ZHU Zuo-hua，XIE Chun-liang，HU Zhen-xiu，PENG Yuan-de

（Institute of Bast Fiber Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410205，China）

Abstract：For the advantage of high cellulose content， bast fiber crops are used as raw materials in the research of cellulosic fuel ethanol. The bacterial degumming technics is the most economical and environmentally friendly pretreatment methods in the bast cellulosic ethanol research. In this study， by constructing an expression plasmid of both pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase genes，the fine degumming bacterial strains Ym68 is genetically engineered to gain a xylose fermentation property to yield ethanol. By comparing the Ym68 and PAP16 fermentations of 5% xylose liquid medium，the results showed that though the xylose utilization of genetically engineered strain PAP16 is little difference to that of original strain Ym68，but the ethanol concentration in the fermentation broth rised from 0.2% to 1.6%. Despite this genetically engineering may change the bacterial cell surface， which led to cell aggregation and thus tempted to reduce the ability of degumming，but PAP16 is favorable for the study of raw materials pretreatment and utilization by having two kinds of properties， which are degumming and ethanol production.

Key words： degumming bacteria； xylose fermentation； ethanol

紅麻、苧麻等麻類作物纖維含量高、糖化效果好，被認(rèn)為是制備纖維質(zhì)燃料乙醇的良好原材料[1，2]。對(duì)紅麻、苧麻等纖維原料糖化之前需先對(duì)其進(jìn)行脫膠處理，使果膠、半纖維素等物質(zhì)降解，有利于后續(xù)纖維素的酶解糖化[3]。而利用微生物進(jìn)行麻類脫膠是一種高效清潔型的脫膠方式[4]，既減少用水量又避免酸堿等化學(xué)物質(zhì)對(duì)后續(xù)酶解糖化的影響，因此微生物脫膠是麻類纖維制備燃料乙醇的理想預(yù)處理方法。微生物脫膠過(guò)程中會(huì)去除麻類果膠、半纖維素等物質(zhì)，約占干物質(zhì)的10%～20%[5]。從酶活和成分測(cè)定等方面分析，脫膠去除的成分當(dāng)中含有大量的木糖、葡萄糖、甘露糖和阿拉伯糖等[6，7]。

本研究以脫膠菌Ym68[8]為研究對(duì)象，通過(guò)雙基因表達(dá)質(zhì)粒載體pACYCDuet-1把丙酮酸脫羧酶（PDC）和乙醇脫氫酶（AdhB）基因轉(zhuǎn)化到脫膠菌Ym68中，以期使其能脫膠并同時(shí)利用脫膠液糖分用于發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株及載體

麻類脫膠菌株Ym68為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所選育的菌株。酮酸脫羧酶基因PDC和乙醇脫氫酶基因AdhB模板來(lái)源于KO11菌株基因組。雙基因表達(dá)質(zhì)粒載體pACYCDuet-1購(gòu)于Voergen公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

利用Primer premier 5.0軟件對(duì)PDC和AdhB基因的開放閱讀框（ORF）序列設(shè)計(jì)引物。以pACYCDuet-1的多克隆位點(diǎn)1（MCS1）中的SalⅠ作為PDC基因的插入點(diǎn)，而多克隆位點(diǎn)2（MCS2）中的XhoⅠ作為AdhB基因的插入位點(diǎn)。PDC和AdhB基因引物加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，并設(shè)計(jì)1對(duì)針對(duì)MCS1和MCS2多克隆位點(diǎn)載體構(gòu)建的檢測(cè)引物，引物序列如表1所示。

1.3 PDC和AdhB基因克隆

以KO11菌液為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：模板菌液1 μL，Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.4 μL，引物A 0.5 μL，引物B 0.5 μL，DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 15.4 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；35個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，Tm退火40 s，72 ℃延伸45 s）；72 ℃延伸10 min。S-PDC-F和S-PDC-R引物退火溫度54 ℃，X-AdhB-F和X-AdhB-R引物退火溫度55 ℃。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒純化。PDC和AdhB兩個(gè)基因的純化產(chǎn)物分別用SalⅠ和XhoⅠ進(jìn)行單酶切，回收產(chǎn)物-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PDC和AdhB雙基因表達(dá)載體構(gòu)建

將含有pACYCDuet-1質(zhì)粒的DH5α菌株經(jīng)37 ℃、170 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并用SalⅠ單酶切后通過(guò)凝膠回收。PDC基因片段的SalⅠ酶切回收產(chǎn)物和pACYCDuet-1質(zhì)粒的SalⅠ酶切回收產(chǎn)物按3∶1的比例，用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞[9]。然后將AdhB基因片段和pACYCDuet-1-PDC質(zhì)粒的XhoⅠ酶切回收產(chǎn)物按濃度3∶1的比例混合連接過(guò)夜。菌液PCR鑒定陽(yáng)性菌，并將陽(yáng)性菌種送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 Ym68陽(yáng)性菌株鑒定

根據(jù)噬夏孢歐文氏菌感受態(tài)的方法[10]制備Ym68菌株感受態(tài)細(xì)胞。從含有pACYCDuet-1-PDC-AdhB質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α菌株中提取質(zhì)粒，參考Sambrook等[11]的轉(zhuǎn)化方法。用含100 μg/mL氯霉素的0.5%葡萄糖肉湯固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。隨機(jī)挑取20個(gè)陽(yáng)性菌落在0.5%葡萄糖肉湯液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL氯霉素）中擴(kuò)繁。以MCS1-F和MCS2-R引物進(jìn)行PCR鑒定陽(yáng)性菌株。

1.6 木糖發(fā)酵及檢測(cè)

將Ym68和PAP16菌株分別接種于肉湯培養(yǎng)基（0.5%葡萄糖、1%牛肉膏和0.5%酵母粉）中，35 ℃、180 r/min培養(yǎng)到OD600 nm為0.8左右時(shí)作為菌種。Ym68和PAP16菌株分別按5%的接種量接種到250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基（5%木糖、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和1% NaCl）中，以不接種的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照，6個(gè)重復(fù)，35 ℃、180 r/min進(jìn)行發(fā)酵，72 h時(shí)進(jìn)行還原糖濃度和乙醇濃度檢測(cè)。每個(gè)處理的6個(gè)重復(fù)樣品中兩兩混合，形成3份混合樣品，隨后取每份樣品進(jìn)行總糖濃度檢測(cè)；以未發(fā)酵過(guò)的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照。按DNS顯色法檢測(cè)還原糖濃度[12]；以濃度為0、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%和1.2%的木糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨后對(duì)樣品進(jìn)行原糖濃度測(cè)定；混合樣品經(jīng)蒸餾后用酒精計(jì)法測(cè)定[13]。

1.7 苧麻脫膠

分別將初始菌株Ym68和工程菌株P(guān)AP16分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min培養(yǎng)菌株過(guò)夜作為菌種（OD600 nm為1.5左右）。以加肉湯培養(yǎng)基為對(duì)照，分別用Ym68和PAP16菌種進(jìn)行脫膠試驗(yàn)，稱取每份15 g的苧麻放于500 mL三角瓶中用于脫膠試驗(yàn)，35 ℃、150 r/min培養(yǎng)8 h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。脫膠效果根據(jù)11分級(jí)[14]，經(jīng)清水洗去可溶性物質(zhì)并烘干后計(jì)算脫膠前后的干物質(zhì)損失率。

1.8 菌液涂片顯微觀察

Ym68轉(zhuǎn)化pACYCDuet-1空質(zhì)粒的菌株命名為Ym68-K。將Ym68、Ym68-K和PAP16菌株分別接種于肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃、180 r/min轉(zhuǎn)速恒溫?fù)u床培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)好的菌液立即用于涂片，用結(jié)晶紫染色后用顯微鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 pACYCDuet-1-PDC-AdhB載體的構(gòu)建

利用XhoⅠ單酶切位點(diǎn)在多克隆位點(diǎn)MCS2上插入的PDC基因長(zhǎng)度為1 707 bp，而在多克隆位點(diǎn)MCS1上插入的AdhB基因?yàn)? 152 bp，如圖1所示。將兩個(gè)基因插入pACYCDuet-1載體質(zhì)粒后，提取質(zhì)粒用XhoⅠ和SalⅠ雙酶切。結(jié)果表明，1 500～2 000 bp間存在一條目的條帶，而約1 000 bp處也存在一條目的條帶，分別與PDC和AdhB基因大小相符，如圖2所示。而在3 000～5 000 bp間有一條較亮的條帶，在約500 bp處還有一條弱帶，這兩條帶與原始質(zhì)粒雙酶切位置大小相符。結(jié)果表明，pACYCDuet-1-PDC-AdhB表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 PAP16具有木糖發(fā)酵能力

對(duì)Ym68轉(zhuǎn)化pACYCDuet-1-PDC-AdhB質(zhì)粒后，隨機(jī)對(duì)5號(hào)、6號(hào)、16號(hào)和20號(hào)陽(yáng)性單菌落進(jìn)行PCR鑒定。單菌落與帶有pACYCDuet-1-PDC-AdhB質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α擴(kuò)增的條帶大小一致，與預(yù)期載體構(gòu)建后MCS1-F 和MCS2-R引物間的產(chǎn)物長(zhǎng)度（約3 300 bp）相符；而原始菌株Ym68則未擴(kuò)增出該條帶，如圖3所示。結(jié)果表明，帶有pACYCDuet-1-PDC-AdhB質(zhì)粒的Ym68工程菌株構(gòu)建成功，16號(hào)菌株命名為PAP16。

用Ym68和PAP16菌株對(duì)含有5%木糖的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。從發(fā)酵后的還原糖濃度看，PAP16和Ym68對(duì)木糖的利用率基本相似。72 h發(fā)酵的Ym68菌株發(fā)酵液中還原糖濃度約為0.56%，而PAP16菌株發(fā)酵液的還原糖濃度約為0.23%；未經(jīng)發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基還原糖濃度為5.22%。從乙醇產(chǎn)量方面看，PAP16菌株發(fā)酵液乙醇濃度約為1.6%，而Ym68菌株的在0.2%以下；未發(fā)酵的培養(yǎng)基則未量出讀數(shù)，如圖4所示。結(jié)果表明， Ym68原始菌被改造成PAP16后雖然對(duì)木糖利用率的影響不明顯，但發(fā)酵生成乙醇的能力提高。

2.3 PAP16苧麻脫膠性能

為檢驗(yàn)PAP16的脫膠能力，通過(guò)苧麻脫膠試驗(yàn)對(duì)比Ym68和PAP16脫膠性能，結(jié)果如圖5所示。只加培養(yǎng)基處理的對(duì)照無(wú)脫膠效果，干物質(zhì)損失率在1%以下；Ym68菌株的脫膠級(jí)數(shù)達(dá)到10級(jí)，干物質(zhì)損失率為12%左右；而PAP16脫膠級(jí)數(shù)為7級(jí)，干物質(zhì)損失率為8%左右。從試驗(yàn)重復(fù)結(jié)果看，PAP16菌株的脫膠能力稍有減弱。在菌株的培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，靜置后的PAP16菌液相比Ym68更容易出現(xiàn)菌體沉淀。因此，對(duì)懸浮后的菌液涂片觀察，PAP16菌液中菌體呈凝聚狀態(tài)，而Ym68和轉(zhuǎn)化有pACYCDuet-1空質(zhì)粒的Ym68-K菌液其菌體則比較分散（圖6），PAP16的菌體凝聚特性可能影響了其脫膠性能。

3 小結(jié)與討論

脫膠菌株Ym68具有優(yōu)良的苧麻脫膠性能，PDC和AdhB基因構(gòu)建進(jìn)去后其獲得了發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的能力。Ym68菌株屬于歐文氏菌屬，而歐文氏菌一般均可利用戊糖和己糖[15，16]，試驗(yàn)結(jié)果也證明Ym68菌株可以利用木糖。其發(fā)酵液乙醇濃度小于0.2%可能是誤差形成的結(jié)果，而并非真正產(chǎn)生乙醇。PAP16發(fā)酵液中乙醇濃度達(dá)到1.6%、糖醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到24%，說(shuō)明將丙酮酸脫羧酶基因PDC和乙醇脫氫酶基因AdhB引入Ym68菌中使其獲得了將木糖轉(zhuǎn)化乙醇的能力。已早有類似研究報(bào)道，整合PDC和AdhB基因的大腸桿菌，其產(chǎn)生乙醇的能力也是從無(wú)到有[17]。這些說(shuō)明Ym68菌株本身具有吸收木糖的能力，但引入PDC和AdhB基因后使得木糖代謝往乙醇產(chǎn)物方向轉(zhuǎn)化。引入PDC和AdhB基因可能改變了Ym68菌體表面特征使得該基因工程菌容易形成凝聚，從而降低了其脫膠性能。通過(guò)改造代謝途徑使得麻類預(yù)處理菌株獲得利用木糖轉(zhuǎn)化成乙醇產(chǎn)物的能力，這對(duì)研究提高麻類原料利用率和推進(jìn)麻類燃料乙醇技術(shù)提供了可借鑒的依據(jù)。

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