黔山蒼子揮發(fā)性化學(xué)成分分析及指紋圖譜研究

趙歐 班大明 杜瑩

摘要：為了構(gòu)建黔山蒼子（Litsea cubeba）揮發(fā)油的指紋圖譜，利用水蒸氣蒸餾法提取山蒼子果實揮發(fā)油，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）鑒定其化學(xué)成分及相對百分含量。以β-檸檬醛為對照，通過對10批貴州不同產(chǎn)地山蒼子樣品的測定，標(biāo)定了16個共有峰，并通過浙江大學(xué)中藥指紋圖譜相似度計算軟件計算相似度等有關(guān)參數(shù)，表明指紋圖譜與定性分析相結(jié)合是黔山蒼子質(zhì)量控制的一種簡單可靠的方法。

關(guān)鍵詞：山蒼子（Litsea cubeba）；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）；指紋圖譜

中圖分類號：S573+.8；O657.7+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-1005-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.047

Study on Chemical Composition and Chromatographic

Fingerprints of Volatile Oil from Litsea cubeba in Guizhou

ZHAO Ou，BAN Da-ming，DU Yin

（School of Chemistry and Marerial Science， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China）

Abstract： To establish the chromatographic fingerprints of the oil samples from Litsea cubeba Pers by GC/MS. With steam distillation extraction method， Litsea cubeba essential oil was extracted from the fruits. The qualitative and quantitative analyses of Litsea cubeba essential oil were carried out with GC-MS. Taking neral as the reference peak， 16 common-peaks were selected as the fingerprint peaks. The similarities among samples of Litsea cubeba Pers among 10 approved samples and their standard chromatographic fingerprints were calculated with software-“the traditional medicine fingerprint similarity calculation software of Zhejiang University”. The common model of chromatographic fingerprints established on the ten samples can provide theoretical basis for appraisal and quality control of commercial volatile oil from Litsea cubeba Pers.

Key words： Litsea cubeba； GC-MS； fingerprint

山蒼子（Litsea cubeba）別名有山雞椒（浙江）、山蒼樹（廣東）、賽樟樹（福建）、香葉（湖南）、木姜子（廣西）等，為樟科木姜子屬的落葉灌木或小喬木[1]。山蒼子有250余種，中國約有70多種，廣布于廣西、江西、浙江、湖南、云南、貴州、四川等地，是中國特有的香料植物資源之一，中國山蒼子油年產(chǎn)量達(dá)20 000余t，為世界上最大的生產(chǎn)國和出口國，年出口量達(dá)3 500 t左右[2]。山蒼子根、莖、葉和果實均含有芳香油，均可入藥，山蒼子油中含檸檬醛、高級醇、有機(jī)酸[2，3]。眾多研究表明，山蒼子中提取的揮發(fā)油及其成分具有多方面的生物活性和治療保健功效[4]，如治療風(fēng)寒感冒、勞倦乏力、久行腳腫、急性乳腺類疾病、虛寒型胃痛、外傷出血、毒蛇咬傷、痧脹腹痛腹脹和風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等疾病，能治療血吸蟲病，有抗血栓、抗哮喘病和抗過敏功效以及在農(nóng)作物的殺蟲防霉等方面的應(yīng)用[2-5]。

色譜指紋圖譜可以標(biāo)識中藥的化學(xué)特征，最大限度展示中藥的整體內(nèi)在品質(zhì)，通過比較色譜指紋圖譜的相似程度，判斷中藥材或制劑真?zhèn)?、考察其穩(wěn)定性和一致性[6-14]。為了對貴州產(chǎn)山蒼子資源建立客觀、整體和多指標(biāo)的綜合評價體系，本試驗對貴州銅仁、遵義等不同產(chǎn)地的10批山蒼子樣品進(jìn)行了分析測定，建立了山蒼子果實揮發(fā)油的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，從整體上反映藥品內(nèi)在成分，易于對中藥山蒼子進(jìn)行質(zhì)量控制，同時也為該植物資源的開發(fā)利用和深入研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

山蒼子的產(chǎn)地及批次見表1。

1.2 儀器與試劑

GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS-QP2010，日本島津公司）；揮發(fā)油提取器；浙江大學(xué)中藥指紋圖譜處理軟件；正己烷等均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液的制備 分別取100 g山蒼子的果實，用揮發(fā)油提取器進(jìn)行提取，收集揮發(fā)油并稱重，揮發(fā)油為淡黃色，具有特殊漿果香味，10批山蒼子油的含量在1.6%～2.8%。分別移取各揮發(fā)油0.2 mL置于2 mL專用試劑瓶中，加正己烷定容，作為供試液，備用。

1.3.2 GC-MS測定條件[8] 載氣：He；石英毛細(xì)管柱SE-54MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；升溫程序：60 ℃保持4 min，以5 ℃/min升至185 ℃保持1 min，以6 ℃/min升至190 ℃，保持1 min。柱前壓：80 kPa；柱流量：1 mL/min；進(jìn)樣量：0.4 μL；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；分流比：10∶1。離子源為EI；電離電壓：70 eV；離子源溫度：270 ℃；質(zhì)量范圍：m/z 30～400；掃描周期：1 s。

1.3.3 方法學(xué)考察 精密吸取供試品溶液0.6 μL，注入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析測定，以基線分離度良好的9號峰（β-檸檬醛）為自身內(nèi)標(biāo)，指定各樣品中β-檸檬醛參照峰（S）的相對保留時間和峰面積值為1，計算10批樣品中特征性成分相對保留時間（RTR） 和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差[9]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 指紋圖譜數(shù)據(jù)分析所采用程序為浙江大學(xué)中藥指紋圖譜相似度計算軟件。氣質(zhì)聯(lián)用工作站的質(zhì)譜為NIST27和NIST147標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫，再結(jié)合人工與質(zhì)譜庫對照定性?；瘜W(xué)成分百分含量采用峰面積歸一化法確定各成分的相對含量[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的制備方法

按“1.3.1”方法制備10批樣品的供試液，按“1.3.2”條件取供試液0.6 μL進(jìn)樣測定，分別記錄其色譜圖（40 min），使用GCMS-QP2010工作站疊加10批樣品的總離子流見圖1。

2.2 共有特征性成分指紋峰的確定

10批山蒼子揮發(fā)油樣品中分別分離出29～38種化學(xué)成分。比較各樣品的GC-MS分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)10 批樣品中存在26個共有化學(xué)成分，其中有16個特征峰面積較大（表2），使用GCMS-QP2010工作站對16個特征峰進(jìn)行計算機(jī)質(zhì)譜庫檢索，結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行人工比對，并采用峰面積歸一法計算其相對百分含量[12]。10個揮發(fā)油樣品中的16個組分占各揮發(fā)油樣品總量的86.8%～92.3%，在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫中檢索的化合物相似度都高于90%；而剩余10個峰面積則較小，相對百分含量共占7.7%～13.2%，且小部分化合物在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫中檢索的化合物相似度低于85%以致難以準(zhǔn)確鑒定。故確定了16個特征峰構(gòu)成黔山蒼子揮發(fā)油的指紋圖譜，其中9號峰β-檸檬醛為參照物峰，以其保留時間和峰面積為1，樣品中其他各峰的相對保留時間和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2、表3、表4。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 分析時間考察 吸取4號供試品溶液0.6 μL，注入氣質(zhì)聯(lián)用儀，運(yùn)行60 min，記錄色譜圖，發(fā)現(xiàn)33 min以后已無明顯色譜峰，因此分析時間定為40 min。

2.3.2 精密度測定 精密吸取同一樣品（4號）供試液各0.6 μL，分別連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果表明，16個峰面積較大的共有峰相對保留時間RSD為0.00%～0.06%，相對峰面積的RSD為0.99%～2.03%，說明該方法的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一樣品（4號）供試液各0.6 μL，分別于0、2、4、8、24 h進(jìn)樣。結(jié)果表明，16個峰面積較大的共有峰相對保留時間RSD為0.01%～0.35%，相對峰面積的RSD為0.15%～3.02%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)測定指紋圖譜是穩(wěn)定的。

2.3.4 重復(fù)性試驗 分別取同一樣品（4號）制備5 份供試液，進(jìn)樣測定。16個共有峰相對保留時間的RSD為0.01%～1.18%，面積百分比基本一致，RSD小于1%，說明該方法重復(fù)性良好[10]。

3 小結(jié)與討論

本試驗以其所含揮發(fā)性成分為控制指標(biāo)對安順、湄潭、息烽、凱里、銅仁、花溪等不同產(chǎn)地的10批山蒼子樣品進(jìn)行了測定，以β-檸檬醛為參照峰，得到16個比較穩(wěn)定的共有指紋峰，建立了山蒼子果實揮發(fā)油的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。該試驗所采用的GC-MS分析山蒼子油特征成分及指紋圖譜的方法精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好，所建立的GC-MS特征成分指紋圖譜可作為山蒼子油質(zhì)量控制和鑒定的依據(jù)。經(jīng)比較可知（表4），3號樣品的相似度為最小（0.65），其他9個樣品均為0.93～0.98，說明3號樣品為離群樣本。根據(jù)國家藥典委員會頒布的要求，相似度為0.9～1.0時符合要求。除3號樣品外其他均與共有模式之間的相似度在0.93以上，符合標(biāo)準(zhǔn)，可以建立黔山蒼子揮發(fā)油指紋圖譜。

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