SAMHD1抗腫瘤的作用機(jī)制

劉盼盼 翟辰洋 高文英 王少華 于曉方

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

SAMHD1抗腫瘤的作用機(jī)制

劉盼盼 翟辰洋 高文英 王少華 于曉方

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 通過測(cè)定結(jié)腸癌中SAMHD1 (109aa-626aa)相關(guān)突變體的表達(dá)情況探索其在抗腫瘤方面的作用。方法 選擇SAMHD1 (109aa-626aa)在結(jié)腸癌中的5個(gè)典型突變體檢測(cè)它們的表達(dá)量、活力大小及被Vpx降解的情況。結(jié)果 所選擇的SAMHD1 (109aa-626aa)的5種突變體在結(jié)腸癌中的表達(dá)量、活力大小均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 與野生型相比SAMHD1(109aa-626aa)在結(jié)腸癌中的表達(dá)量下調(diào)、活力降低，更有利于腫瘤的發(fā)生。

SAMHD1；dNTP；結(jié)腸癌；酶活

SAMHD1是一種由626 個(gè)氨基酸組成的核蛋白，其主要包含有N-端核定位信號(hào)區(qū)(NLS)、不育α基序(SAM)結(jié)構(gòu)域、組氨酸 /天冬氨酸殘基(HD)結(jié)構(gòu)域、T592磷酸化位點(diǎn)〔1～3〕以及C-端可變區(qū)(Vpx結(jié)區(qū))〔4，5〕。HD區(qū)域是由組氨酸和天冬氨酸交替排列而成(H…DH…D)的基序〔6〕，它不僅可以參與核苷酸代謝〔7〕，同時(shí)其還具有 dNTPase 及 RNase 活性。C端的多變區(qū)能與病毒蛋白X(Vpx)〔8〕的α螺旋結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合，誘導(dǎo)Vpx〔9〕蛋白對(duì)自身的降解。過去研究人員只注意到了SAMHD1的抗病毒作用，但目前SAMHD1(109aa-626aa)的突變體在人類的幾種癌癥中已經(jīng)得到證實(shí)〔10～18〕，主要包括慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)〔10，12，15〕、骨髓瘤〔17〕、乳腺癌〔16〕、肺癌〔13〕、結(jié)腸癌和直腸癌〔16，18，19〕、胰腺癌〔11〕、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤〔14〕和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)。CLCL主要發(fā)生于老年人群中，表現(xiàn)出臨床和生物異質(zhì)性。本文主要對(duì)結(jié)腸癌中SAMHD1(109aa-626aa)的突變體進(jìn)行相關(guān)的研究。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 從結(jié)腸癌的活性中心和變構(gòu)中心選擇5個(gè)突變體，分別是V133I、K288T、A338T、R366H、D497Y，同時(shí)選擇它們的野生型SAMHD1(109aa-626aa)(WT)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 從吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院獲得WT質(zhì)粒，以此為模板構(gòu)建5個(gè)突變體并用考馬斯亮藍(lán)(BB)染色。

1.2.2 原核表達(dá) 將構(gòu)建完成的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到原核細(xì)胞大腸桿菌中，誘導(dǎo)表達(dá)后收獲細(xì)胞，將收獲的細(xì)胞破碎并純化所獲得的蛋白，經(jīng)SDS電泳后比較它們表達(dá)量的差異。將純化的蛋白加上一定量的底物，反應(yīng)一段時(shí)間后用高效液相色譜層析測(cè)量它們酶活力的差異。

1.2.3 真核表達(dá) 將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中。其中實(shí)驗(yàn)組除了轉(zhuǎn)染與SAMHD1(109aa-626aa)相關(guān)的質(zhì)粒還需轉(zhuǎn)染Vpx。一段時(shí)間后收獲細(xì)胞，用Western印跡檢測(cè)sam以及相關(guān)的突變體，觀察其是否能被Vpx降解。

2 結(jié) 果

圖1 SAMHD1及其突變體在原核生物中的預(yù)表達(dá)情況

2.1 原核細(xì)胞中預(yù)表達(dá)結(jié)果 WT以及5個(gè)突變體在5 ml試管中用IPTG誘導(dǎo)后的表達(dá)情況如圖1所示。R366H在原核細(xì)胞中的可溶性最高，比WT略高，而V133I、K288T、A388T的可溶性比WT有不同程度的降低，其中可溶性最低的是D497Y，蛋白幾乎全部以包涵體的形式存在。說明所選擇的結(jié)腸癌中SAMHD1(109aa-626aa)5個(gè)突變體在原核細(xì)胞中都可以表達(dá)，只是所表達(dá)蛋白質(zhì)的可溶性有所差異。

2.2 原核細(xì)胞中大量表達(dá)及純化結(jié)果 預(yù)表達(dá)的結(jié)果說明質(zhì)粒構(gòu)建正確并能在所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)，但還會(huì)有一些雜蛋白，因此需要擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)菌并對(duì)所獲得的蛋白進(jìn)行純化，盡可能的去除里面的雜蛋白，所得的電泳結(jié)果如圖2所示。預(yù)表達(dá)結(jié)果提示R366H可溶性最好，在純化表達(dá)中也提示，R366H的可溶性要高于其他突變體。V133I的可溶性比WT略低，而K288T、A338T、D497Y的純化結(jié)果表明它們的可溶性比較差，大部分蛋白以包涵體的形式表達(dá)在菌體中。這說明SAMHD1發(fā)生突變后，它的表達(dá)量會(huì)降低，即在結(jié)腸癌中由于SAMHD1發(fā)生了突變它的表達(dá)量與正常細(xì)胞相比較會(huì)有所降低。

2.3 WT及其突變體dNTPase活力的檢測(cè) SAMHD1具有dNTPase活性，可以降解底物dNTP，用高效液相色譜檢測(cè)不同突變體不同時(shí)間降解產(chǎn)物的酶活力差異，突變體的酶活力在任一時(shí)間段基本都低于WT〔20〕。A338T和D497Y從一開始幾乎就完全喪失了酶活性，而K288T和R366H在3～12 h這一時(shí)間段還殘留一些酶活力，但在12 h以后，K288T的酶活力幾乎完全喪失，R366H則還有一些酶活力。V133I比較特殊，它的酶活力值與WT比只是稍微降低，表現(xiàn)出了非常高的酶活力。見圖3。

圖2 SAMHD1及其突變體在原核生物中的表達(dá)情況

圖3 SAMHD1及其突變體的酶活力變化情況

2.4 結(jié)腸癌相關(guān)SAMHD1(109aa-626aa)突變對(duì)Vpx對(duì)其降解的影響 我們轉(zhuǎn)染Vpx的實(shí)驗(yàn)組和沒有轉(zhuǎn)染Vpx的對(duì)照組在轉(zhuǎn)染后48 h收獲菌液，經(jīng)過Western印跡檢測(cè)。在Vpx存在的情況下，突變體和WT均發(fā)生了一定程度的降解。見圖4。

圖4 Vpx對(duì)SAMHD1及其突變體的降解情況

3 討 論

Clifford等〔10〕比較了在CLL中SAMHD1 mRNA表達(dá)量與正常B細(xì)胞中的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體中SAMHD1 mRNA的表達(dá)量明顯低于正常B細(xì)胞。 Wang等〔20〕研究了SAMHD1在肺癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)肺癌中SAMHD1的蛋白表達(dá)水平和mRNA的表達(dá)水平都會(huì)降低。de Silva等〔21〕比較了健康人和CTCL患者外周血單核細(xì)胞中SAMHD1 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTCL患者外周血單核細(xì)胞中SAMHD1的表達(dá)量明顯降低。SAMHD1在其他癌癥中的表達(dá)也明顯降低，如淋巴瘤、乳腺癌和各種腫瘤細(xì)胞系〔10〕。本研究說明不只是在中其表達(dá)量下調(diào)，在其他的各種癌細(xì)胞中SAMHD1的表達(dá)量基本都會(huì)有所下調(diào)，這可能是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的共同現(xiàn)象。SAMHD1在很多腫瘤中表達(dá)下調(diào)可能與SAMHD1啟動(dòng)子的甲基化有關(guān)，但是具體的機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

細(xì)胞內(nèi)dNTP水平的平衡是維護(hù)細(xì)胞基因組完整性的關(guān)鍵，而dNTP的減少或不平衡會(huì)導(dǎo)致基因毒性并且增加突變，dNTP的增加通常導(dǎo)致不受控制的DNA復(fù)制，保真度降低并可以促進(jìn)癌癥的發(fā)展〔15，16〕。SAMHD1是一種具有核酸酶和脫氧核糖核苷三磷酸水解酶(dNTPase)活性的雙功能酶〔3，22〕。因此它能夠水解dNTP，并以此來控制細(xì)胞內(nèi)dNTP的水平，進(jìn)而影響細(xì)胞周期進(jìn)程和DNA的復(fù)制。

本研究中，結(jié)腸癌中SAMHD1的酶活性基本上均有所降低，而且除V133I外，其余的活性都非常低，基本上沒有多少活力。腫瘤細(xì)胞中dNTP的濃度相對(duì)而言非常高，SAMHD1 dNTPase活性的降低使結(jié)腸癌中dNTP水解量減少，有利于腫瘤細(xì)胞的快速復(fù)制。也有可能是由于SAMHD1的突變使得細(xì)胞中dNTP大量增加，進(jìn)而引發(fā)癌變。本研究結(jié)果表明在結(jié)腸癌中SAMHD1發(fā)生突變后確實(shí)會(huì)影響它的dNTPase活性，而且一般情況是負(fù)面影響其酶活性。在腫瘤細(xì)胞中dNTP的含量相對(duì)比較高，由于SAMHD1發(fā)生了突變，使其酶活力降低，從而降解dNTP的能力會(huì)下降，這樣就使得細(xì)胞中一直維持高濃度的dNTP，有利于癌細(xì)胞的快速增殖。在酶活力的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，除V133I外，其余4種突變體的酶活力幾乎全部喪失，這可能是由于V133I這一突變點(diǎn)的突變并沒有引起SAMHD1構(gòu)象的變化，因此，其酶活力并沒有受到多大影響。但其余4種突變體，可能都在催化中心或其他區(qū)域，在催化中心某個(gè)氨基酸的改變都有可能造成SAMHD1某些功能的喪失，因此它們的突變導(dǎo)致了其酶活性的大幅度降低。

有研究結(jié)果證明，Vpx可以引發(fā)SAMHD1泛素化并且能夠使其發(fā)生蛋白酶體的降解。本研究結(jié)果說明與結(jié)腸癌相關(guān)的所有的SAMHD1突變體依然可以被Vpx降解，這與之前的研究一致〔23，24〕。Vpx對(duì)SAMHD1的降解主要依賴于其C端(595aa-626aa)及催化區(qū)域(HD結(jié)構(gòu)域)，我們所選擇的這些突變體的突變位點(diǎn)并不在Vpx降解的關(guān)鍵區(qū)域。

SAMHD1具有的dNTPase功能是dNTP穩(wěn)態(tài)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑〔25，26〕，其可以水解細(xì)胞內(nèi)的dNTP，使細(xì)胞內(nèi)的dNTP維持較低的水平，能夠減少細(xì)胞增殖，而且SAMHD1的dNTPase活性對(duì)于預(yù)防先天性和自身免疫病非常重要〔4〕。SAMHD1 在幾種癌癥中的突變或下調(diào)暗示它是一種潛力腫瘤抑制基因〔27〕。因此，通過一定的方式恢復(fù)SAMHD1在癌細(xì)胞中的表達(dá)，也可以成為癌癥治療的一個(gè)手段。盡管SAMHD1結(jié)構(gòu)和功能的研究快速進(jìn)展，但是它調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的準(zhǔn)確的作用和機(jī)制仍需要我們進(jìn)一步去研究。

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〔2017-03-09修回〕

(編輯 郭 菁)

于曉方(19-)，男，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事分子病毒學(xué)研究。

劉盼盼(1989-)，男，在讀碩士，主要從事分子病毒學(xué)研究。

R73

A

1005-9202(2017)11-2656-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.024