番茄防御酶活性與番茄抗白粉病相關(guān)性研究

馬高龍

摘 要：植物在病害或者環(huán)境脅迫條件下會(huì)產(chǎn)生酶促性的保衛(wèi)性生化反應(yīng)，酶活性測(cè)定表明：未接種番茄幼苗中，各品種PAL活性無明顯變化，接種白粉菌后抗病品種和感病品種的PAL活性均有升高；未接種番茄幼苗中各品種間酶活性無明顯變化，接種白粉菌后抗病品種的POD活性迅速升高，表現(xiàn)出對(duì)病菌侵染強(qiáng)烈的應(yīng)激變化，而感病品種升高緩慢；未接種番茄幼苗葉片中，各品種間酶活性無顯著差異，且都變化趨勢(shì)不明顯；接種白粉菌后抗病品種的PPO活性迅速升高，表現(xiàn)出對(duì)病菌侵染強(qiáng)烈的應(yīng)激變化，而感病品種升高趨勢(shì)相對(duì)緩慢。

關(guān)鍵詞：番茄白粉病；番茄防御酶；抗病性；相關(guān)性

一、材料和方法

1.材料

（1）白粉菌來源。2012年10月份，采自湖北省荊州市長(zhǎng)江大學(xué)西校區(qū)日光溫室番茄白粉菌帶回室內(nèi)，接種健康感病番茄品種里格爾87-5植株上擴(kuò)大繁殖，備用。

（2） 供試品種。根據(jù)2007年對(duì)64個(gè)加工番茄品種對(duì)白粉病抗性的田間調(diào)查結(jié)果，挑選高抗品種鉆石、TOM0629D，耐病品種Z00-73、3379，感病品種里格爾87-5和高感品種3144等6個(gè)品種，種子均由甘肅省高臺(tái)中化番茄制品公司提供。

2. 方法

（1） 番茄幼苗的培養(yǎng)和接種方法。選用無病種子，種植在裝有滅菌土的塑料營(yíng)養(yǎng)缽中，每品種種50缽，每缽6粒。放在溫室或培養(yǎng)室培養(yǎng)，于4～6葉期將發(fā)病葉片上的分生孢子掃落或抖落到健康植株葉片上，并保濕48h，每品種接種35缽（其中15缽用于測(cè)定酶活性，20缽用于調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)），15缽噴清水作對(duì)照，并隔離培養(yǎng)。分別在接種前、接種后0.5d、1d、2d、4d、7d和10d檢測(cè)各品種處理和對(duì)照的酶活性，并于病害特征明顯后（高感品種發(fā)病率達(dá)到50%時(shí)），調(diào)查統(tǒng)計(jì)各品種發(fā)病率和病情指數(shù)。

（2）酶液提取及活性測(cè)定

① POD和PPO活性檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)所需化學(xué)試劑：0. 05mol/l磷酸緩沖液（PH為5.5）； 0.05mo1/1愈創(chuàng)木酚溶液；2%的雙氧水溶液；0. lmol/1的兒茶酚溶液；20%三氯乙酸溶液。實(shí)驗(yàn)儀器用：精密數(shù)顯恒溫水浴鍋；精密酸度計(jì)；分光光度計(jì)。

實(shí)驗(yàn)步驟：（1）粗酶液的制備，煎取5g葉片，剪碎后放入早置于冰浴中預(yù)冷過的研缽中，加入適量的磷酸緩沖液后研磨成勻漿，將勻漿完全轉(zhuǎn)入離心管中后在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心l0min，上清液轉(zhuǎn)入25m1容量瓶中，定容后在低溫下保存?zhèn)溆?。?2 ） POD活性的測(cè)定，取3支試管，依次加入2. 9m10. 05mo1/1的磷酸緩沖液；1.0m12%的H2O2；1m10.05mo1/1的愈創(chuàng)木酚溶液，將其中一支試管在沸水中煮5min為對(duì)照。作兩組重復(fù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)體系在加入酶液后立即于37℃水浴中保溫1 Smin，然后迅速轉(zhuǎn)入冰浴中，立即加入2.0m120%三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，然后將反應(yīng)混合溶液在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，適當(dāng)稀釋后在分光光度計(jì)上470nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值。（ 3 ） PPO活性檢測(cè)與POD基本相似，只是反應(yīng)體系為3.9m1磷酸緩沖液；1 ml兒茶酚和0.1 ml酶液，水浴中的反應(yīng)時(shí)間為10min，在525nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值。

酶活力計(jì)算：以每分鐘在該波長(zhǎng)下變化0.01為1個(gè)酶活力單位，計(jì)算公式如下：酶活力（U）=△A×D/0.01×wt單位為：U/gfw

②PAL活性測(cè)定。取供試番茄葉片1 g，加PVP 0.1 g，5 mM巰基乙醇硼酸緩沖液4 mL和少量石英砂于研缽中研磨成勻漿，4℃下8000 r/min離心15 min，取上清液0.1 mL，加底物0. 02 M苯丙氨酸硼酸緩沖液（pH8.8）3 mL，蒸餾水2.9 mL，30℃保溫30 min，對(duì)照以蒸餾水代底物，290 nm比色，以每min在290 nm處吸收變化0.01所需酶量為一單位（相當(dāng)于每毫升反應(yīng)液中形成1μg肉桂酸）。

二、結(jié)果與分析

1.供試品種間PAL（苯丙氨酸解氨酶）活性與白粉病抗性的關(guān)系

（1） PAL活性的在品種間的動(dòng)態(tài)變化。PAL活性測(cè)定結(jié)果表明， 未接種番茄幼苗中，各品種PAL活性無明顯變化，接種白粉菌后抗病品種和感病品種的PAL活性均有升高，并且均出現(xiàn)兩個(gè)峰值，第一個(gè)峰值出現(xiàn)在0.5d～1d，此峰幅度均小，最高為134.70U/g·h FW（高抗品種TOMO629D，0.5d），比其對(duì)照平均值升高24.3%；第二峰均在第7d，此峰幅度較大，高抗品種TOMO629D酶活性最高（186.40 U/g·h FW），比其對(duì)照均值升高72.1%。接種第10d呈下降趨勢(shì)，除兩個(gè)高抗品種外，其余品種PAL活性均接近對(duì)照。

（2） PAL活性與供試品種抗病性的關(guān)系。將各品種對(duì)照10d內(nèi)變化值平均后與病情指數(shù)做相關(guān)分析，結(jié)果顯示顯著水平p>0.05，即相關(guān)性不顯著；將各品種第7d酶活性與病情指數(shù)做相關(guān)分析后，結(jié)果顯示p<0.05，說明品種抗病性越高。第7d的PAL活性就越高，反之則越低；將第7d的增幅與病情指數(shù)做相關(guān)分析，結(jié)果顯示p<0.05，說明品種抗病性越高7d的酶活性增幅就越大，反之就越小。將后二者進(jìn)一步做回歸分析，得回歸方程及回歸曲線。

2.供試品種間POD（過氧化物酶）活性與白粉病抗性的關(guān)系

POD活性與供試品種抗病性的關(guān)系。將各品種對(duì)照10d內(nèi)變化平均后與病情指數(shù)做相關(guān)分析，結(jié)果顯示顯著水平P>0.05，即相關(guān)性不顯著；將各品種第7d酶活性與病情指數(shù)做相關(guān)分析后，結(jié)果表明各品種第7d的酶活性與其病情指數(shù)有顯著的負(fù)相關(guān)性；將第7d的增幅與病情指數(shù)做相關(guān)分析，結(jié)果表明各品種第7d的增幅與其病情指數(shù)有顯著的負(fù)相關(guān)性。將后二者進(jìn)一步做回歸分析，得回歸方程及回歸曲線。

3.供試品種間PPO（多酚氧化酶）活性與白粉病抗性的關(guān)系

（1）PPO活性的在品種間的動(dòng)態(tài)變化。PPO活性測(cè)定結(jié)果表明， 未接種番茄幼苗葉片中，各品種間酶活性無顯著差異，且都變化趨勢(shì)不明顯；接種白粉菌后抗病品種的PPO活性迅速升高，表現(xiàn)出對(duì)病菌侵染強(qiáng)烈的應(yīng)激變化，而感病品種升高趨勢(shì)相對(duì)緩慢，但都在第0.5d（品種3144在第1d）形成一個(gè)峰值，高抗品種鉆石PPO活性最高（30.29U·g-1·min-1），比其對(duì)照均值升高109.04%，而感病品種3144僅比其對(duì)照均值升高3.03%；隨后逐漸下降，到第7d時(shí)，感病品種里格爾87-5和3144酶活性下降到與對(duì)照相近水平，之后各品種PPO活性又開始上揚(yáng)。

（2） PPO活性與供試品種抗病性的關(guān)系。將各品種對(duì)照平均后與病情指數(shù)做相關(guān)分析，結(jié)果顯示顯著水平p>0.05，即相關(guān)性不顯著；將各品種第0.5d酶活性與病情指數(shù)做相關(guān)分析后，結(jié)果表明各品種第0.5d的酶活性與其病情指數(shù)有顯著的負(fù)相關(guān)性；將第0.5d的增幅與病情指數(shù)做相關(guān)分析，結(jié)果表明各品種第0.5d的酶活性增幅與其病情指數(shù)有顯著的負(fù)相關(guān)性。將后二者進(jìn)一步做回歸分析，得回歸方程及回歸曲線。

三、結(jié)論和討論

1.本試驗(yàn)對(duì)番茄感染白粉病后過氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶的變化做了研究，結(jié)果表明， PAL活性與供試品種抗病性第10d后不顯著，第7d相關(guān)性較顯著。POD活性與供試品種抗病性第10d不顯著，第7d有顯著負(fù)相關(guān)性。PPO活性與供試品種抗病性第0.5d有顯著負(fù)相關(guān)性?？共∑贩N的過氧化物酶活性顯著低于感病品種；感病后，感病品種的酶活性升高幅度明顯大于抗病品種，說明其與抗病性密切相關(guān)，但是否可以作為鑒定番茄品種抗白粉病的生化指標(biāo)，尚有待于進(jìn)一步深入研究。

2.苯丙氨酸類代謝是形成多種具有抗菌作用產(chǎn)物的途徑之一。有關(guān)研究報(bào)道，當(dāng)植物受病菌侵染。后，伴隨PAL活性的升高有木質(zhì)素的積累和植保素的合成，表明PAL的活性與植物抗病性有關(guān)。這反映了不同抗性的番茄品種間的抗病基因不同，而PAL活性是抗病基因的一種表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同抗病品種的PAL活性差異不明顯，但是感染白粉病菌后PAL活性的變化與番茄的抗病性呈正相關(guān)，即病原菌對(duì)抗病品種PAL活性的誘導(dǎo)比感病品種大的多。

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