水稻α—NAC基因家族的克隆及生物信息學(xué)分析

王曉靜　孫林靜　馬忠友　孫玥　李軍玲　張融雪　閆雙勇　劉學(xué)軍

摘要：新生多肽結(jié)合復(fù)合體（Nascent polypeptide-associated complex，NAC）是由d和B兩個(gè)亞基組成的異二聚體復(fù)合物。水稻新生多肽結(jié)合復(fù)合體α鏈基因家族共有3個(gè)基因，分別位于1、3號(hào)和5號(hào)染色體上。本研究根據(jù)公布的水稻基因組序列，通過(guò)RT-PCR方法克隆了粳稻品種中花11號(hào)中α-NAC家族的3個(gè)基因。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，水稻α-NAC基因家族的氨基酸序列比較保守，包含NAC和UBA兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，與玉米NAC基因家族的親緣關(guān)系最近。OslgNAC和Os3gNAC、Os5gNAC的相似性分別為67.4%、81.8%，Os3gNAC和Os5gNAC的相似性為69.5%。本研究結(jié)果為Osα-NAC蛋白純化及蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供參考，為今后Osα-NAC基因家族的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；新生多肽結(jié)合復(fù)合體α鏈；生物信息學(xué)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S511+Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）04-0008-06

新生多肽結(jié)合復(fù)合體（Nascent polypeptide-associated complex，NAC）由α鏈和β鏈組成，在體內(nèi)和體外均可以形成一個(gè)穩(wěn)定的有功能的復(fù)合體。根據(jù)不同物種的同源序列比較發(fā)現(xiàn)，NAC有一段非常保守的結(jié)構(gòu)域，稱為NAC結(jié)構(gòu)域，一般位于亞基的N端。NAC的兩個(gè)亞基都可以在核糖體上與新生多肽直接作用，是核糖體輸出通道的動(dòng)力組成部分，給新生多肽的形成提供保護(hù)，阻止不合適的蛋白相互作用。在人的造骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)α-NAC雖然本身不是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，但它可能具有共激活某些轉(zhuǎn)錄因子的功能。為了行使轉(zhuǎn)錄共激活子功能，α-NAC能夠在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中穿梭。因此，α-NAC被認(rèn)為是具有調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯雙重功能的蛋白。

近年來(lái)，植物中對(duì)β-NAC的研究報(bào)道逐漸增多。從辣椒（Capsicum annuum）中克隆到和β-NAC同源性很高的CaBTF3，其對(duì)辣椒的HR抗病機(jī)制有作用。與對(duì)照辣椒植株相比，受煙草花葉病毒侵染的CaBTF3沉默辣椒植株中，HR導(dǎo)致的壞死細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)HR相關(guān)基因的表達(dá)量下降，煙草花葉病毒的外殼蛋白量增加。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)互花米草（Spartina alterniflo-ra）的β-NAC后，在正常生長(zhǎng)環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)發(fā)育狀況不受影響，但是在鹽害和干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的抵抗力。在小麥中，BTF3（β-NAC）沉默的轉(zhuǎn)基因植株不耐干旱和凍害。在水稻中，BTF3（β-NAC）對(duì)種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的功能，OsBTF3沉默的轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)受到明顯抑制，花粉活力和種子數(shù)量明顯減少。有人通過(guò)分子克隆的方法從水稻中得到OsBTF3基因，對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析，并獲得了OsBTF3過(guò)表達(dá)和RNAi轉(zhuǎn)基因水稻，對(duì)OsBTF3在抗病性、抗逆性和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能進(jìn)行研究。α-NAC和β-NAC以異源二聚體的形式存在于植物細(xì)胞中，推測(cè)α-NAC也具有重要的生理功能。雖然α-NAC在植物物種中廣泛存在，但其生物學(xué)功能的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究根據(jù)網(wǎng)站http：//rice.plantbiology.mSU.edu公布的水稻基因組序列信息，利用Prim-er Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物，采用RT-PCR方法從粳稻品種中花11號(hào)中分別克隆得到α-NAC家族三個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA，并通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)α-NAC基因家族的同源基因進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粳稻品種中花11號(hào)種植于上海市植物生理生態(tài)研究所人工氣候室。大腸桿菌DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；TRIZOL為Invitrogen公司產(chǎn)品；Rever Tra Aceα為T(mén)oyobo公司產(chǎn)品；EX Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker及pMD19-T載體為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；引物合成和基因測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 Ostr-NAC基因家族的克隆

1.2.1 水稻總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成取水稻三葉期新鮮葉片加液氮研磨至粉末，每50～100mg材料加入1mL TRIZOL（Invitro-gen），振蕩混勻，依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取，電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測(cè)定260、280nm下的吸光值，計(jì)算總RNA的純度與濃度。以總RNA為模板，Oligo（dT）為引物，按照Rever TraAce僅（Toyobo）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。20μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×RT Buffer 4μL，dNTP混合物（各10mmol/L）2μL，RNase抑制劑（10U/μL）1μL，Oligo（dT）₂₀（10pmol/μL）μL，反轉(zhuǎn)錄酶1μL，總RNA2～3μg，加Nuclease-free去離子水補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：42%反應(yīng)1h。產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因的克隆及測(cè)序

根據(jù)網(wǎng)站公布的水稻基因組序列信息，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物（表1），以合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件為：94℃10min；94℃30s，56～60℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并拍照。

按照TaKaRa公司的pMD19-T載體說(shuō)明書(shū)，將切膠回收的目的片段進(jìn)行連接反應(yīng)。連接液體系為10μL：連接液5μL，載體0.5μL，回收DNA的量2.5μL，去離子蒸餾水2μL。16℃連接過(guò)夜。取10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH50t感受態(tài)細(xì)胞，取細(xì)胞懸浮液涂布于含Amp的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落，進(jìn)行PCR檢測(cè)。挑選陽(yáng)性克隆送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 根據(jù)水稻基因組注釋項(xiàng)目網(wǎng)站（http：//rice.plantbiology.msu.edu）上Osα-NAC基因家族3個(gè)基因的相關(guān)信息，使用BioEdit和ORFFinder分別分析cDNA的堿基組成和開(kāi)放閱讀框（ORF）。在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上搜集擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、果蠅（Drosoph-ila melanogaster）、古細(xì)菌（Methanothermobactermarburgensis）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）、線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）、小鼠（Mus musculus）和人類(lèi)（Homo sapiens）等物種α-NAC的氨基酸序列，并進(jìn)行同源性比較。通過(guò)MEGA5.1軟件將19個(gè)α-NAC蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析，根據(jù)鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Osα-NAC基因的序列分析

Osα-NAC基因家族共有3個(gè)成員，分別位于1、3號(hào)和5號(hào)染色體上，根據(jù)其在染色體的分布位置分別命名為OslgNAC、Os3gNAC和Os5gNAC。依據(jù)水稻基因組注釋項(xiàng)目網(wǎng)站的注釋及序列分析得知，OslgNAC的全長(zhǎng)DNA為2759bp，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，5-UTR長(zhǎng)112bp，3-UTR長(zhǎng)281bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）長(zhǎng)609bp，預(yù)測(cè)的編碼蛋白有203個(gè)氨基酸殘基（圖1A）。Os3gNAC的全長(zhǎng)DNA為2251bp，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，5-UTR長(zhǎng)159bp，3-UTR長(zhǎng)1090bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)長(zhǎng)666bp，預(yù)測(cè)的編碼蛋白有222個(gè)氨基酸殘基（圖1B）。Os5gNAC的全長(zhǎng)DNA為2119bp，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，5-UTR長(zhǎng)81bp，3-UTR長(zhǎng)432bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)長(zhǎng)618bp，預(yù)測(cè)的編碼蛋白有209個(gè)氨基酸殘基（圖1C）。

2.2 Osα-NAC基因的克隆

使用設(shè)計(jì)的引物分別以水稻全長(zhǎng)cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，片段大小與預(yù)期相符（圖2）。將目的片段切膠回收，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，各挑選2個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與網(wǎng)站公布的序列結(jié)果一致。

2.3 α-NAC的氨基酸序列比對(duì)分析

2.3.1 不同物種α-NAC氨基酸序列同源性分析人類(lèi)、線蟲(chóng)、酵母都只含有一個(gè)α-NAC基因，水稻和擬南芥在進(jìn)化過(guò)程中分化出多個(gè)α-NAC的同源基因。不同物種α-NAC的氨基酸序列比對(duì)分析（圖3）表明，α-NAC的氨基酸序列比較保守，包含NAC和UBA（Ubiquitin-associ-ated）兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別處于肽鏈的N端和C末端。

2.3.2 水稻和擬南芥α-NAC的氨基酸序列比對(duì)分析水稻和擬南芥不同α-NAC蛋白之間的氨基酸序列相似性差別不大，在50%～85%之間（表2），其中AtNACA1和AtNACA3之間的氨基酸序列相似性最高，達(dá)到了84.8%，而AtNACA1和AtNACA5之間的相似性最低，為53.6%。在進(jìn)化樹(shù)分析中，水稻的Os1gNAC和Os5gNAC親緣性最近，氨基酸序列比較顯示它們的序列相似性達(dá)到了81.8%，說(shuō)明它們可能具有相似的生物學(xué)功能。

2.4 α-NAC的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)α-NAC蛋白的進(jìn)化分析（圖4）表明，古細(xì)菌α-NAC（aeNAC）單獨(dú)成為一個(gè)分支，之后又進(jìn)化出酵母（EGD2）和其余物種的僅一NAC蛋白，說(shuō)明古細(xì)菌α-NAC屬于α-NAC基因家族出現(xiàn)較早的基因。在另一節(jié)點(diǎn)上，可以看到植物α-NAC蛋白和動(dòng)物α-NAC蛋白在進(jìn)化上形成兩個(gè)不同的分支。Os1gNAC和Os5gNAC的親緣關(guān)系比較近，與玉米的3個(gè)NAC蛋白（Zm1NAC、Zm2NAC、Zm3NAC）屬于同一個(gè)分支，而Os3gNAC和它們的親緣關(guān)系則比較遠(yuǎn)，與玉米的另一個(gè)NAC蛋白（zm4NAC）屬于同一個(gè)分支。

3 結(jié)論與討論

NAC是廣泛存在于細(xì)菌、動(dòng)物和植物中的保守蛋白，由α和β兩條鏈組成。不同物種α-NAC含有不同數(shù)目的同源基因，植物α-NAC基因家族較龐大。本研究通過(guò)RT-PCR方式從水稻中成功克隆得到Osα-NAC基因家族的3個(gè)基因，根據(jù)其所在染色體的位置，分別命名為Os1gNAC、Os3gNAC和OsggNAC。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，Osα-NAC基因家族的3個(gè)基因全長(zhǎng)DNA大小分別為2759、2251bp和2119bp，都包含有外顯子和內(nèi)含子。不同物種的氨基酸同源序列比較發(fā)現(xiàn)，α-NAC基因家族的氨基酸序列比較保守，包含NAC和UBA兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中位于亞基N端的NAC結(jié)構(gòu)域在α-NAC和β-NAC中均存在，而UBA結(jié)構(gòu)域則只在α-NAC的C端存在。對(duì)α-NAC蛋白的進(jìn)化分析表明，古細(xì)菌α-NAC屬于α-NAC基因家族出現(xiàn)較早的基因。Os1gNAC與Os5gNAC的親緣關(guān)系比較近，而Os3gNAC與它們的親緣關(guān)系則比較遠(yuǎn)。

本研究首次報(bào)道了Osα-NAC基因家族的3個(gè)基因，克隆得到的產(chǎn)物和生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)將對(duì)以后的研究工作提供試驗(yàn)材料和科學(xué)依據(jù)，為水稻抗逆新品種的培育及利用基因工程手段改良水稻提供優(yōu)良的基因資源。