肥城桃果實(shí)VDAC基因的克隆、生物信息學(xué)分析及蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

衣冠帥　劉雨辰　朱樹(shù)華

摘要：線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）是線粒體膜上的一種蛋白復(fù)合體，在線粒體介導(dǎo)的程序性死亡過(guò)程中起著重要作用。電壓依賴型陰離子通道蛋白（VDAC）是MPTP的重要組成蛋白，可調(diào)節(jié)其開(kāi)放與關(guān)閉，但VDAC在植物體中的作用機(jī)理尚不明確。本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR結(jié)合DNA末端快速擴(kuò)增（RACE）方法，克隆得到肥城桃果實(shí)線粒體VDAC基因cDNA，全長(zhǎng)共1225bp，其中編碼區(qū)828bp，編碼276個(gè)氨基酸；氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，桃果實(shí)VDAC與其它植物的VDAC蛋白具有較高的一致性；體外構(gòu)建了pET-30a-VDAC重組表達(dá)載體，并成功在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)；使用鎳柱純化法，得到純化的重組蛋白，為下一步研究桃果實(shí)VDAc蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：肥城桃；線粒體；電壓依賴型陰離子通道蛋白（VDAC）；基因克??；生物信息學(xué)分析；蛋白表達(dá)

中圖分類號(hào)：S662.1+Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）04-0001-07

線粒體存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中，是細(xì)胞的微型“能量工廠”，在細(xì)胞疾病、衰老、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。線粒體通透性轉(zhuǎn)換（MPT）對(duì)細(xì)胞影響巨大，當(dāng)其發(fā)生時(shí)，分子量在15kD以下的蛋白、一些離子和其它有害代謝物可以自由進(jìn)出原本不允許通過(guò)的線粒體內(nèi)膜，導(dǎo)致其跨膜電勢(shì)消失、ATP合成受阻、線粒體滲透壓降低，最終使線粒體發(fā)生腫脹，甚至破裂。目前普遍的研究表明，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換受一種跨線粒體內(nèi)外膜的蛋白復(fù)合體調(diào)節(jié)，稱之為線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）。

線粒體電壓依賴型陰離子通道蛋白（VDAC）是線粒體外膜上的一種高度保守的蛋白質(zhì)，幾乎存在于所有物種的線粒體表面，是線粒體外膜上最豐富的蛋白，對(duì)于保持線粒體與細(xì)胞質(zhì)之間的物質(zhì)和能量代謝起著十分重要的作用。因此，VDAC被認(rèn)為很有可能是MPTP的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，VDAC的超表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡速率增加，這可能是由于VDAC蛋白含量的增高會(huì)導(dǎo)致其在線粒體膜表面形成多聚體，這種多聚體首先在植物體中被發(fā)現(xiàn)。通過(guò)對(duì)酵母菌、小鼠、人類等多種細(xì)胞的VDAC超表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞發(fā)生凋亡的概率都有所升高。另有研究表明，伴隨VDAC超表達(dá)而產(chǎn)生的活性氧（ROS）的增加也是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要原因。

目前，關(guān)于VDAC蛋白在動(dòng)物及人體中作用的研究已經(jīng)開(kāi)展了很多，但在植物體中的研究還不是很成熟。本試驗(yàn)以肥城桃果實(shí)為材料，克隆得到桃果實(shí)線粒體VDAC基因全長(zhǎng)，并在大腸桿菌中成功表達(dá)獲得重組蛋白，以期進(jìn)一步了解植物VDAC蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

肥城桃[Prunus persica（L.）Batsch cv.Feicheng]果實(shí)采自山東省肥城市桃園鎮(zhèn)。從長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲害的植株上隨機(jī)選取大小相近、色澤均勻、無(wú)機(jī)械損傷的桃果實(shí)，采摘后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，4℃預(yù)冷24h。果肉切塊后用液氮冷凍處理，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌E.coli BL21（DE3）、DH50t，表達(dá)載體pET-30a質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體pMD18-T Vector購(gòu)自TaKaRa公司。

試驗(yàn)所需引物（表1）由北京六合華大基因科技公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 肥城桃果實(shí)總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成參照改良CTAB法提取肥城桃果實(shí)總RNA。使用TaKaRa公司的PrimeScript Ⅱ 1st StrandcDNA Synthesis Kit試劑盒合成第一鏈cDNA。

1.2.2 肥城桃果實(shí)線粒體VDAC基因中間序列的克隆從GenBank中查找其它植物的VDAC基因序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物VDAC-F、VDAC-R，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后將目的片段切膠，使用Mini BEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0（TaKaRa）試劑盒進(jìn)行DNA片段的回收。之后連接pMD18-T Vector，進(jìn)行克隆載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)后，送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 肥城桃果實(shí)VDAC基因全長(zhǎng)的獲得及生物信息學(xué)分析根據(jù)中間片段的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)RACE引物GSP1、GSP2及巢氏引物NGSP1、NG-SP2。使用SMARTerTM RACE cDNA（TaKaRa）試劑盒進(jìn)行5'-RACE與3'-RACE。巢式PCR產(chǎn)物電泳切膠回收后，按上述方法構(gòu)建克隆載體、測(cè)序，將測(cè)序得到的5端序列和3端序列與中間片段拼接，得到VDAC基因全長(zhǎng)序列。將全長(zhǎng)序列在NCBI ORF Finder分析開(kāi)放閱讀框，并在NC-BI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找同源序列，使用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)分析，通過(guò)MEGA 4.1軟件分析桃果實(shí)VDAC與其它植物VDAC蛋白序列的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用ProtParamtool（http：//web.expasy.org/protparam/）在線分析蛋白的理化性質(zhì)。利用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白的親水性。使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TM—HMM/）預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。最后使用在線網(wǎng)站提供的工具對(duì)VDAC蛋白進(jìn)行二維及三維結(jié)構(gòu)的模擬。

1.2.4 VDAC蛋白的體外表達(dá)

根據(jù)VDAC的開(kāi)放閱讀框，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物VDAC-1、VDAC-2。經(jīng)PCR獲取VDAC全長(zhǎng)片段，使用pMD18-T Vector按上述方法構(gòu)建克隆載體。克隆載體與pET-30a質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后將目的條帶切膠回收，使用TaKaRa T4 DNA Ligase進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pET-30a-VDAC。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達(dá)菌株BL21（DE3），經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證無(wú)誤后進(jìn)行蛋白表達(dá)。取100μL菌液加入到50mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀=0.4～0.6，取1mL菌液用于對(duì)照，向剩余菌液中加入50μL1mol·L^-1IPTG至終濃度為1mmol·L^-1，37℃誘導(dǎo)過(guò)夜，取1mL菌液進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.2.5 重組VDAC蛋白的純化

使用His標(biāo)記蛋白質(zhì)專用鎳柱介質(zhì)（Tiandz）進(jìn)行蛋白純化，方法按照使用說(shuō)明進(jìn)行。用200mmol·L^-1咪唑洗脫液洗脫蛋白。純化后的VDAC蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 VDAC基因全長(zhǎng)的獲得

通過(guò)對(duì)比不同植物VDAC基因序列，根據(jù)其保守區(qū)序列設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR，所得結(jié)果如圖1A所示，在500bp左右出現(xiàn)目的條帶，符合預(yù)期長(zhǎng)度。將該條帶回收并克隆測(cè)序，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)了RACE引物及巢氏引物。如圖1B，5-RACE巢氏PCR與3-RACE巢氏PCR均得到與預(yù)期長(zhǎng)度相符合的目的條帶，將5-RACE與3-RACE測(cè)序結(jié)果與中間片段拼接，得到肥城桃VDAC基因全長(zhǎng)序列共1225bp（圖2A），在GenBank中的登錄號(hào)為KJ652911.1。

2.2 VDAC基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)分析，該序列含有起始密碼子ATG（80bp）和終止密碼子TAG（909bp），具有完整的開(kāi)放閱讀框。閱讀框共有828個(gè)堿基，編碼276個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如圖2B所示。ProtParamtool預(yù)測(cè)蛋白分子式為C₁₃₂₈H₂₁₀₇N₃₅₉O₄₁₇S，分子量為29806.5D，理論等電點(diǎn)為7.88，不穩(wěn)定系數(shù)為12.67。ProtScale分析其疏水性平均值為-0.205，表明VDAC為親水性蛋白。TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)VDAC為膜外蛋白。從二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3A）可以發(fā)現(xiàn)，肥城桃VDAC蛋白在起始位置有一段α螺旋結(jié)構(gòu)，緊接著是無(wú)規(guī)則卷曲與β折疊結(jié)構(gòu)交替出現(xiàn)，總共有19段β折疊結(jié)構(gòu)。肥城桃VDAC三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果為桶狀（圖3B）。在二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中的β折疊結(jié)構(gòu)平行排列，圍繞成一個(gè)管道，而N端的α螺旋結(jié)構(gòu)則單獨(dú)位于管道的中間。進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，桃果實(shí)VDAC與其它植物VDAC氨基酸序列同源性較高，其中與橙子（Cit-rus sinensis）、白梨（Pyrus bretschneideri）、葡萄（Vi-tis vinifera）、麻風(fēng)樹(shù)（Jatropha curcas）、荷花（Ne-lumbo nucifera）、巨桉（Eucalyptus grandis）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）的相似度分別為87.68%、94.57%、74.28%、84.06%、78.62%、72.10%、73.91%，說(shuō)明植物的VDAC蛋白具有較高的保守性（圖4）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，桃果實(shí)VDAC與白梨VDAC聚為一類，說(shuō)明二者親緣關(guān)系最近（圖5）。

2.4 VDAC蛋白的體外表達(dá)及純化

使用T4連接酶將帶有酶切位點(diǎn)的VDAC基因片段與表達(dá)載體pET-30a連接，重組質(zhì)粒導(dǎo)人大腸桿菌B121（DE3），加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得VDAC重組蛋白。電泳結(jié)果（圖6A）顯示，VDAC重組蛋白成功表達(dá)，分子量約31kD。從菌液中分離出包涵體，用含尿素的結(jié)合液溶解，經(jīng)過(guò)鎳柱純化的VDAC重組蛋白（圖6B）中基本不含其它雜蛋白，純度較高。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用同源克隆的方法獲得了肥城桃VDAC基因中間片段，之后根據(jù)中間片段設(shè)計(jì)RACE引物，獲得VDAC5及3端序列，通過(guò)拼接得到準(zhǔn)確的肥城桃VDAC基因cDNA全長(zhǎng)。對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，桃VDAC蛋白與其它植物VDAC蛋白具有較高的同源性。本試驗(yàn)還體外重組了表達(dá)載體pET-30a-VDAC，在BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)得到VDAC重組蛋白，并利用Ni-NTA與帶有His標(biāo)簽的VDAC重組蛋白結(jié)合，將目的蛋白從雜蛋白中分離出來(lái)。

Hiller等對(duì)從包涵體中復(fù)性的VDAC蛋白進(jìn)行的核磁共振和X射線衍射分析發(fā)現(xiàn)，VDAC蛋白是由19段β折疊構(gòu)成的筒狀結(jié)構(gòu)蛋白。前人研究顯示，VDAC蛋白的N端存在長(zhǎng)度為20個(gè)氨基酸的α螺旋結(jié)構(gòu)，這段螺旋結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出一面疏水一面親水的性質(zhì)；在復(fù)性的或是失去活性的VDAC蛋白中，這段僅螺旋結(jié)構(gòu)始終位于VDAC蛋白的內(nèi)腔中，說(shuō)明它在VDAC蛋白的結(jié)構(gòu)功能中有著重要的意義。對(duì)桃果實(shí)VDAC蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果與已確定的人類VDAC1蛋白和煙草NtVDAC1.1蛋白極為類似。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，許多代謝產(chǎn)物和蛋白如ATP/ADP、活性氧、谷胱甘肽、己糖激酶等都表現(xiàn)出對(duì)線粒體通透性的調(diào)節(jié)作用，因此可以推斷VDAC蛋白參與了這些物質(zhì)對(duì)線粒體通透性的調(diào)節(jié)。其中，己糖激酶（HK）對(duì)體外重組的VDAC蛋白表現(xiàn)出直接的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，HK可以誘導(dǎo)VDAC關(guān)閉，而當(dāng)HK從VDAC蛋白上釋放出來(lái)時(shí)，VDAC得以重新開(kāi)啟。由此認(rèn)為，HK誘導(dǎo)VDAC蛋白關(guān)閉進(jìn)而抑制了MPTP的開(kāi)放。另有研究表明，HK與VDAC在植物體內(nèi)存在共表達(dá)現(xiàn)象。更多關(guān)于肥城桃果實(shí)線粒體VDAC重組蛋白活性檢測(cè)、結(jié)構(gòu)分析的試驗(yàn)正在進(jìn)行中，將為MPTP的組成和功能、VDAC調(diào)控MPTP開(kāi)放機(jī)理乃至細(xì)胞凋亡機(jī)制提供理論依據(jù)。