豬肺炎支原體高密度發(fā)酵工藝的研究

朱秀同 高曉磊 張德寶 柳 珊 郁宏偉 李曉艷 劉 濤

豬肺炎支原體高密度發(fā)酵工藝的研究

朱秀同 高曉磊 張德寶 柳 珊 郁宏偉 李曉艷 劉 濤

（瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司，河北保定 071000）

為提高豬肺炎支原體發(fā)酵培養(yǎng)的滴度，在500L發(fā)酵罐基礎(chǔ)上，對(duì)豬肺炎支原體J株的發(fā)酵工藝進(jìn)行了一系列優(yōu)化試驗(yàn)，各項(xiàng)發(fā)酵培養(yǎng)條件經(jīng)優(yōu)化后，發(fā)酵支原體的滴度得到了明顯提高，發(fā)酵滴度可達(dá)到1×109CCU/ml以上，本研究為提供高效、安全和穩(wěn)定的豬肺炎支原體疫苗產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

豬肺炎支原體；發(fā)酵工藝；優(yōu)化

豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是引起豬支氣管肺炎（Mycoplasmal pneumoniae of swine，俗稱豬氣喘病）的主要病原。該病廣泛存在于世界各國(guó)，嚴(yán)重危害著養(yǎng)豬事業(yè)的發(fā)展。豬只感染后除導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率降低生長(zhǎng)發(fā)育不良外，且易繼發(fā)病毒或細(xì)菌感染，造成豬死亡率升高，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失慘重［1］，疫苗免疫是預(yù)防本病最重要的手段。

肺炎支原體的培養(yǎng)條件非?？量?，是疫苗規(guī)?；a(chǎn)的工藝難題。影響豬肺炎支原體發(fā)酵的因素非常多，如支原體生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、接種密度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基的pH值攪拌轉(zhuǎn)速以及通氣量等等。我們選用免疫原性良好的J株進(jìn)行了發(fā)酵工藝研究，測(cè)定了其在不同培養(yǎng)時(shí)期的菌液滴度，明確了該菌株在適宜培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)趨勢(shì)變化；并對(duì)各影響參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化以有效提高疫苗的生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種 豬肺炎支原體J株

1.1.2培養(yǎng)基 據(jù)A26培養(yǎng)基配方成分，經(jīng)瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司研發(fā)部改進(jìn)

1.1.3主要設(shè)備500L發(fā)酵罐

1.2方法

豬肺炎支原體J株培養(yǎng)條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)按照單個(gè)變量順次進(jìn)行，共進(jìn)行了以下幾個(gè)參數(shù)的優(yōu)化，根據(jù)發(fā)酵結(jié)束時(shí)支原體滴度的變色單位（Colour Change Unit，CCU）結(jié)果判定優(yōu)化效果。

1.2.1培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化 在500L發(fā)酵罐中進(jìn)行，培養(yǎng)基體積為300L，培養(yǎng)基初始pH值調(diào)為7.5，將生長(zhǎng)穩(wěn)定的二級(jí)種子液按照10%接種，37℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100r/min，培養(yǎng)32h、40h、48h、56h各取樣1次，分別進(jìn)行CCU測(cè)定。

1.2.2局種密度的優(yōu)化 在500L發(fā)酵罐中進(jìn)行，培養(yǎng)基體積為300L，培養(yǎng)基初始pH值調(diào)為7.5，將生長(zhǎng)穩(wěn)定的二級(jí)種子液按照1%，5%，10%和15%接種量接種到發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100r/min，培養(yǎng)40h取樣，分別進(jìn)行CCU測(cè)定。

1.2.3pH值的優(yōu)化 按照5%接種量在500L發(fā)酵罐中進(jìn)行，培養(yǎng)基體積為300L，培養(yǎng)基初始pH值調(diào)為7.0、7.5、7.8和8.0，37℃培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100r/min，培養(yǎng)40h取樣，分別進(jìn)行CCU測(cè)定。

1.2.4轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 按照5%接種量在500L發(fā)酵罐中進(jìn)行，培養(yǎng)基體積為300L，培養(yǎng)基初始pH值調(diào)為7.5，轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為50r/ min、100r/min、200r/min，37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)40h取樣，分別進(jìn)行CCU測(cè)定。

1.2.5通氣量的優(yōu)化 按照5%接種量在500L發(fā)酵罐中進(jìn)行，培養(yǎng)基體積為300L，培養(yǎng)基初始pH值調(diào)為7.5，轉(zhuǎn)速設(shè)定為100r/ min，37℃培養(yǎng)。通氣方式分3種，分別為發(fā)酵前一次性補(bǔ)加、100L/min固定不變和200L/min固定不變，各培養(yǎng)40h取樣，分別進(jìn)行CCU測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化

不同培養(yǎng)時(shí)間的支原體計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，40h為最佳培養(yǎng)時(shí)間，過早或過晚停止發(fā)酵培養(yǎng)物滴度均偏低（見表1），發(fā)酵后40h可能豬肺炎支原體正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，尚未進(jìn)入衰退期，所以滴度相對(duì)較高。

表1　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豬肺炎支原體生長(zhǎng)的影響

2.2接種密度的優(yōu)化

本研究結(jié)果顯示，接種密度對(duì)豬肺炎支原體產(chǎn)生較大影響，5%-10%的接種量比較適宜（表2）。過低的接種密度會(huì)導(dǎo)致支原體生長(zhǎng)過慢，過高則會(huì)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)早期大量消耗，致使支原體生長(zhǎng)提前進(jìn)入衰亡期。

表2　接種密度對(duì)豬肺炎支原體生長(zhǎng)的影響

2.3pH值的優(yōu)化

本研究結(jié)果顯示，發(fā)酵前培養(yǎng)基的pH值對(duì)豬肺炎支原體發(fā)酵有重要影響，pH值在7.5～7.8范圍內(nèi)所得菌數(shù)較高，為最適pH值范圍（見表3）。pH值過低或過高均達(dá)不到良好的效果。

表3　pH值對(duì)豬肺炎支原體生長(zhǎng)的影響

2.4轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

本研究結(jié)果顯示，不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)豬肺炎支原體發(fā)酵有重要影響，100rpm為最適宜轉(zhuǎn)速，過低生長(zhǎng)速度較慢，過高則導(dǎo)致菌體大量死亡（見表4）。

表4　轉(zhuǎn)速對(duì)豬肺炎支原體生長(zhǎng)的影響

2.5通氣量的優(yōu)化

本研究結(jié)果顯示，通氣量的改變對(duì)豬肺炎支原體生長(zhǎng)無明顯影響（見表5）。

表5　通氣量對(duì)豬肺炎支原體生長(zhǎng)的影響

3 討論與小結(jié)

針對(duì)不同菌種和不同用途的發(fā)酵都需要對(duì)影響發(fā)酵的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行綜合考慮，只有對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行全面優(yōu)化才能達(dá)到預(yù)期的效果。發(fā)酵罐體積不同，發(fā)酵時(shí)各項(xiàng)參數(shù)對(duì)豬肺炎支原體培養(yǎng)滴度的影響也不同，不能照搬其它發(fā)酵研究的結(jié)果。本研究對(duì)豬肺炎支原體J株的培養(yǎng)時(shí)間、接種密度、pH值、轉(zhuǎn)速和通氣量等5項(xiàng)發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，基本確定了在500L發(fā)酵罐上的發(fā)酵培養(yǎng)方式，即發(fā)酵時(shí)選擇加入5%的二級(jí)種子液、調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值7.5～7.8、轉(zhuǎn)速100rpm，發(fā)酵前補(bǔ)入足量滅菌空氣，發(fā)酵40h后即可收獲，本研究為為提升發(fā)酵培養(yǎng)效率和過程控制提供了重要依據(jù)。

值得指出的是，由于豬肺炎支原體培養(yǎng)極為困難，人們通常認(rèn)為10%的接種量為最佳接種量，本研究結(jié)果證明5%的接種量即可保證發(fā)酵的成功，過高的接種密度不僅會(huì)造成種子的浪費(fèi)，而且會(huì)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)在培養(yǎng)早期便大量消耗，致使細(xì)菌生長(zhǎng)提前進(jìn)入衰退期。

本研究中用到的滴度測(cè)定方法為CCU法，該方法是以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo)來計(jì)算微生物的含量的，研究中，我們采用該法對(duì)培養(yǎng)菌液進(jìn)行2次重復(fù)計(jì)數(shù)，取平均值為最終結(jié)果。與PCR等快速判斷的方法相比，CCU法雖然具有耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)（10d），但其數(shù)據(jù)可靠，操作簡(jiǎn)便，可重復(fù)性強(qiáng)，重要的是CCU法反映的是活菌滴度，因此是大生產(chǎn)中最可靠的計(jì)數(shù)方法，本研究為瑞普生物生產(chǎn)高效、安全和穩(wěn)定的豬肺炎支原體滅活疫苗產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

［1］ RF Ross Mycoplasma Disease. Swine Disease［M］.Iow a State University press，1986：469-483.

朱秀同（1981-），碩士學(xué)歷，獸醫(yī)師，主要從事獸用生物制品方面研究。

保定市蓮池區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016-07）