實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)聯(lián)合檢測6種性病病原微生物的研究

王曉東,王 然,李鳳煥,向 鑫

(中國人民解放軍第二五四醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300142)

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·臨床研究·

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)聯(lián)合檢測6種性病病原微生物的研究

王曉東,王 然,李鳳煥,向 鑫

(中國人民解放軍第二五四醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300142)

目的 探討實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)同時(shí)檢測多種性病病原體的可行性和臨床意義。方法 采用FQ-PCR方法對(duì)716例患者生殖道標(biāo)本的淋球菌(NGH)、沙眼衣原體(CT)、解脲支原體(UU)、梅毒螺旋體(TP)、人乳頭瘤病毒(HPV)6/11型及16/18型等6種微生物或亞型進(jìn)行定量檢測，并與定性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行比較。結(jié)果 2種PCR方法對(duì)6種病原體檢測的總符合率分別為94.83%、96.16%、95.29%、100%、94.37%、94.12%。陽性率差異分別為1.29%、1.45%、2.18%、0、7.04%、0.98%， HPV6/11-DNA FQ-PCR法陽性率高于PCR(P<0.01),其他5項(xiàng)指標(biāo)檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 陽性標(biāo)本定量平均拷貝數(shù)對(duì)數(shù)分別為(6.71±3.36)、(5.56±2.48)、 (6.83±3.17)、 (4.89±3.52)、(5.75±3.13)、(4.95±2.68)。結(jié)論 FQ-PCR操作簡便、快速，高效，并能準(zhǔn)確定量,對(duì)性病的診斷、發(fā)展和預(yù)后監(jiān)測、療效評(píng)價(jià)、指導(dǎo)用藥具有重要的臨床意義。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，熒光定量； 奈瑟氏球菌，淋??； 衣原體，沙眼； 支原體，解脲； 梅毒螺旋體； 乳頭瘤病毒

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測通常擴(kuò)增不同目的DNA片段，設(shè)計(jì)不同的特異引物及溫度參數(shù)，在同一擴(kuò)增參數(shù)條件下，同時(shí)檢測多種病原微生物[1]。有關(guān)調(diào)查顯示，性傳播疾病發(fā)病率在我國正逐年上升[2]，人群結(jié)構(gòu)以中青年為主，與受教育的文化程度呈負(fù)相關(guān)，為性傳播疾病得到及時(shí)、有效的治療，以及加強(qiáng)流行病防控，因此選擇快速、敏感、特異、高效的檢測手段非常重要。

1 資料與方法

1.1 一般資料 716例標(biāo)本來自2010年5月至2015年5月該院泌尿外科、婦科、皮膚性病門診的泌尿生殖系統(tǒng)感染及有高危性接觸史患者，男332例，年齡16～59歲，平均32歲；女353例，年齡15～51歲，平均27歲。

1.2 儀器與試劑 DA-7600 基因擴(kuò)增儀及熒光定量PCR試劑，分別購自達(dá)安基因和華美生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模板制備 女性宮頸及陰道分泌物拭子或男性尿道拭子的無菌試管中，加入1.5 mL生理鹽水并旋渦混勻器,充分震蕩，將混懸液倒入無菌EP管，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀加50 μL DNA提取液，混勻后置金屬熱浴,100 ℃ 10 min，10 000 r/min離心5 min，分別取5 μL模板DNA置入相對(duì)應(yīng)的6種目的DNA熒光定量擴(kuò)增管。

1.3.2 FQ-PCR擴(kuò)增參數(shù) 包含引物、熒光探針、底物dNTP、Taq聚合酶、離子buffer和模板的反應(yīng)體系50 μL，94 ℃預(yù)變性120 s，然后 94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s,35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸過程讀取熒光，擴(kuò)增結(jié)束導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量超過100 copy/mL為陽性。

1.3.3 PCR擴(kuò)增參數(shù) 包含引物、底物dNTP、Taq聚合酶、離子buffer的40 μL PCR擴(kuò)增體系內(nèi)加入5 μL模板DNA，預(yù)變性98 ℃ 180 s，加入2 U Taq酶，94 ℃ 30 s,54 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s,35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠做指示劑，5～6 V/cm電泳2 h,凝膠置254 nm波長紫外透照儀下參照,Maker 比對(duì)熒光條帶位置。

2 結(jié) 果

2.1 FQ-PCR檢測結(jié)果 716例標(biāo)本申請(qǐng)6、5、4、3、2、1項(xiàng)性病病原體DNA檢測，分別為43、62、207、365、369、286例。見表1。

表1 FQ-PCR檢測6種性病病原體DNA結(jié)果

表2 FQ-PCR與PCR檢測結(jié)果的比較[n/n(%)]

2.2 2種檢測方法的結(jié)果比較 性病病原體DNA檢出率依次為解脲支原體(UU)、6/11型人乳頭瘤病毒(HPV)、淋球菌(NGH)、沙眼衣原體(CT)、HPV16/18型、梅毒螺旋體(TP)，與有關(guān)報(bào)道接近[3-6]。陽性率和定量拷貝值最高為UU，54例標(biāo)本定量超過108copy/μL，陽性定量水平最低為CT，平均低于104copy/μL，最高上限未超過106copy/μL。在進(jìn)行熒光定量檢測的同時(shí)，從DNA模板分別隨機(jī)抽取對(duì)應(yīng)78、69、92、56、71、51份DNA模板，分別進(jìn)行NGH、CT、UU、TP、HPV6/11、HPV16/18 PCR擴(kuò)增，總符合率94.83%，陽性率差異1.29%；CT-DNA 總符合率96.16%，陽性率差異1.45%； UU-DNA總符合率95.29%，陽性率差異2.18%；TP-DNA 總符合率100%；HPV6/11-DNA 總符合率95.77%，陽性率差異4.22%；HPV16/18-DNA 總符合率94.12%，陽性率差異0.98%。 2種方法檢測HPV6/11-DNA陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其他比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3 討 論

性傳播疾病的病原微生物種類較多，常見的細(xì)菌感染主要是NGH，可引起泌尿生殖系統(tǒng)的急性炎性或化膿性感染[7]。本研究結(jié)果表明，感染率最高的病原微生物是UU，支原體無細(xì)胞壁，不能維持固定的形態(tài)而呈現(xiàn)多形性，不易細(xì)胞培養(yǎng)。感染泌尿生殖道的衣原體主要種類是CT，它是嚴(yán)格的活細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物，具有獨(dú)特的發(fā)育周期。UU和CT引起的泌尿生殖道感染癥狀類似，是主要的非淋菌性尿道炎，依靠FQ-PCR準(zhǔn)確診斷病原微生物，選擇敏感藥物有針對(duì)性地進(jìn)行有效治療。TP近年來在我國增長迅速，顯性和隱性梅毒患者均可是傳染源，且潛伏TP居多，已成為報(bào)告病例數(shù)較多的性病之一。HPV是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬，能引起人體皮膚、黏膜的鱗狀上皮增殖。最多見的是低危6/11型及高危16/18型，高危型HPV持續(xù)感染也已被證明是導(dǎo)致宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素[8-10]。近年來性傳播疾病發(fā)病率越來越高，發(fā)病年齡卻逐年降低。防治性病更應(yīng)教導(dǎo)青少年尊崇傳統(tǒng)的道德倫理觀念，加強(qiáng)青春期正確性教育和性病預(yù)防知識(shí)，培養(yǎng)良好的衛(wèi)生習(xí)慣，從根本上減少性傳播疾病的發(fā)生。

FQ-PCR反應(yīng)體系中有2條普通的特異性引物，1條熒光標(biāo)記探針，這條探針的5′端和3′端分別標(biāo)記供體熒光報(bào)告基團(tuán)和受體熒光淬滅基團(tuán)，探針完整時(shí)，供體報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光能量傳遞給相近的受體熒光染料并被吸收，進(jìn)而激發(fā)出另一波長并能同時(shí)淬滅供體基團(tuán)發(fā)射的熒光；TaqDNA聚合酶不僅有延伸DNA的引物活性，還有5′～3′外切核酸酶活性，擴(kuò)增循環(huán)過程中，Taq酶的外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告和淬滅2個(gè)熒光基團(tuán)分離，熒光信號(hào)得到釋放，自動(dòng)監(jiān)測系統(tǒng)可接收到發(fā)射熒光，擴(kuò)增目的DNA鏈越多，熒光分子釋放越多，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。由于PCR擴(kuò)增指數(shù)時(shí)期，模板CT值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量依據(jù)。多種病原微生物在同一反應(yīng)條件下同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增檢測，顯著提高效率，在保障敏感性和特異性的前提下，不僅檢測出感染病原微生物的種類，而且提示局部病原微生物的感染量級(jí)水平，對(duì)病情發(fā)展和預(yù)后能夠進(jìn)行有針對(duì)性的治療及監(jiān)測。

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