利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)333例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的結(jié)果分析

林日文,李 靜

(廣東省惠州市結(jié)核病防治研究所檢驗(yàn)科 516008)

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·臨床研究·

利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)333例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的結(jié)果分析

林日文,李 靜△

(廣東省惠州市結(jié)核病防治研究所檢驗(yàn)科 516008)

目的 探討采用利福平(RFP)耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(Xpert MTB/RIF)檢測(cè)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的結(jié)果并進(jìn)行分析。方法 選擇2015年1～12月該所就診的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本333例，分別進(jìn)行抗酸染色涂片鏡檢、Xpert MTB/RIF、傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)，使用Xpert MTB/RIF檢測(cè)痰標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌(MTB)和RFP耐藥的敏感度和特異度，并與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性比較。結(jié)果 Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB的敏感度為93.6%，特異度為92.0%，2種方法進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.82，具有良好的一致性；RFP耐藥的敏感度和特異度分別為78.6%和93.4%，2種方法的Kappa=0.78，具有良好的一致性。結(jié)論 應(yīng)用Xpert MTB/RIF檢測(cè)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，檢測(cè)速度快，準(zhǔn)確性高，快速獲得患者是否耐藥的結(jié)果，可指導(dǎo)臨床準(zhǔn)確用藥，值得臨床應(yīng)用和推廣。

肺結(jié)核； 利福平； Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)

我國(guó)屬于全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，患者數(shù)據(jù)居全球第2位[1]。結(jié)核病疫情具有高患病率、高耐藥率、高感染率的特點(diǎn)。廣東地區(qū)人口流動(dòng)性大，外來人口多，結(jié)核病疫情尤為嚴(yán)峻。目前結(jié)核病比較突出的問題是患者產(chǎn)生耐藥性，治療效果差。如何早期發(fā)現(xiàn)患者對(duì)抗結(jié)核藥產(chǎn)生耐藥性是臨床面臨的挑戰(zhàn)。耐多藥結(jié)核病是指至少對(duì)抗結(jié)核藥物中異煙肼(INH)和利福平(RFP)產(chǎn)生耐藥，由于90%的結(jié)核桿菌對(duì)RFP耐藥同時(shí)也對(duì)INH耐藥，因此RFP耐藥被認(rèn)為是耐多藥的重要標(biāo)志[2-3]。傳統(tǒng)羅氏結(jié)核桿菌耐藥檢測(cè)法，需要的檢測(cè)時(shí)間至少2個(gè)月，因?yàn)闄z測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)患者的及時(shí)治療和臨床用藥造成障礙，利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(Xpert MTB/RIF)快速檢測(cè)法則彌補(bǔ)了其不足?，F(xiàn)檢測(cè)111株結(jié)核分枝桿菌，并對(duì)RFP耐藥情況進(jìn)行總結(jié)分析，為臨床提供科學(xué)依據(jù)和經(jīng)驗(yàn)用藥參考。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2015年1～12月在惠州市結(jié)核病防治研究所就診的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本333例，年齡19～69歲，男170例，女163例，囑患者清晨清理口腔后用力咳出深部濃痰，一式2份。進(jìn)行涂片鏡檢，分別標(biāo)記出涂片陰性和陽性的標(biāo)本，采用Xpert MTB/RIF核酸檢測(cè)和改良羅氏培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性者進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)[3-4]。評(píng)價(jià)2種方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(MTB)和RFP耐藥的敏感度和特異度，并對(duì)2種方法結(jié)果的一致性進(jìn)行比較。

1.2 儀器與試劑 使用珠海Baso公司生產(chǎn)的培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)菌株HRV,抗結(jié)核藥由華南制藥生產(chǎn)，Xpert MTB/RIF核酸檢測(cè)儀是美國(guó)Motyd公司生產(chǎn)，Cartridge反應(yīng)盒由北京芬尼公司提供。

1.3 方法 Xpert MTB/RIF核酸檢測(cè)采用Cepheid公司Gene-Xpert 檢測(cè)系統(tǒng)是一種半巢式定時(shí)熒光PCR體外診斷技術(shù)，針對(duì)rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區(qū)間(RRDR)設(shè)計(jì)引物、探針、檢測(cè)其是否發(fā)生突變，進(jìn)而用于診斷患者是否結(jié)核及是否對(duì)RFP耐藥(rpoB序列存在突變)。打開 Gene-Xpert 檢測(cè)儀的電源開關(guān)，然后運(yùn)行Gene-Xpert 操作軟件，使用掃碼器掃描反應(yīng)盒正面的識(shí)別碼。軟件將全自動(dòng)填寫所需信息。點(diǎn)擊“開始測(cè)試”，2 h出結(jié)果，可判讀是否MTB感染及是否RFP耐藥。MTB檢出高度：CT<16，陽性級(jí)別高，定義為4+： MTB檢出中度：16

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，0

2 結(jié) 果

2.1 Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB效能分析 333例初診患者痰標(biāo)本進(jìn)行涂片染色鏡檢，其中陽性111例，陰性222例，以羅氏培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF涂片陽性患者檢測(cè)MTB的敏感度為94.9%(93/98)，特異度為69.2%(9/11)；Xpert MTB/RIF涂片陰性患者檢測(cè)MTB的敏感度為83.3%(10/12)，特異度為94.7%(199/210)；全部患者檢測(cè)的敏感度93.6%(103/110)，特異度為92.0%(208/226)。2種方法進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.82，具有良好的一致性。見表1。

表1 Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB效能分析(n)

2.2 Xpert MTB/RIF檢測(cè)痰標(biāo)本對(duì)RFP耐藥的結(jié)果分析 333例初診患者痰標(biāo)本進(jìn)行涂片染色鏡檢，涂片陽性111例，涂片陰性222例，以羅氏培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF涂片陽性患者檢測(cè)RFP耐藥的敏感度為72.7%(8/11)，特異度為98.0%(98/100)；Xpert MTB/RIF涂片陰性患者檢測(cè)RFP耐藥的敏感度為100%(3/3)，特異度為91.3%(200/219)。全部患者檢測(cè)的敏感度為78.6%(11/14)，特異度為93.4%(298/319)。2種方法進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.78，具有良好的一致性。見表2。

表2 Xpert MTB/RIF檢測(cè)痰標(biāo)本對(duì)RFP耐藥的結(jié)果分析(n)

3 討 論

肺結(jié)核發(fā)病例數(shù)逐年升高，每年新增患者130萬例。傳統(tǒng)羅氏固體培養(yǎng)法是目前常用的診斷耐藥結(jié)核的方法，其結(jié)果可靠，是診斷耐藥結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)。但其耗時(shí)較長(zhǎng)，平均 1～2 個(gè)月的操作時(shí)間易造成診斷延誤，期間耐藥結(jié)核患者無法得到有效化療，容易導(dǎo)致獲得性耐藥、結(jié)核復(fù)發(fā)或切口處竇道形成[8]。因此，需開發(fā)或?qū)ふ铱焖?、?zhǔn)確、安全的檢測(cè)結(jié)核耐藥性的分子藥敏診斷技術(shù)。近年來，Xpert MTB/RIF受到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注和探討，臨床應(yīng)用處于初級(jí)起步階段。本研究Xpert MTB/RIF檢測(cè)333例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本結(jié)果表明,Xpert MTB/RIF檢測(cè)MTB的敏感度為93.6%，特異度為92.0%，2種方法進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.82，具有良好的一致性格；RFP耐藥的敏感度和特異度分別為78.6%和93.4%，2種方法進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，Kappa=0.78，具有良好的一致性。

Xpert MTB/RIF 作為一種全新的結(jié)核病快速檢測(cè)新方法，具有如下特點(diǎn)：(1)集成性：將樣品準(zhǔn)備、擴(kuò)增、定量檢測(cè)進(jìn)行統(tǒng)一。(2)快捷性：擁有極速加熱和制冷的能力，可在2 h內(nèi)提供精確穩(wěn)定的試驗(yàn)結(jié)果。(3)靈活性：可配置多個(gè)模塊同時(shí)進(jìn)行多種不同的檢測(cè)，任何1個(gè)反應(yīng)都可隨時(shí)啟動(dòng)和終止。(4)易操作：系統(tǒng)軟件實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PCR 進(jìn)行情況，一旦 PCR 完成自動(dòng)給出試驗(yàn)結(jié)果。(5)安全性：獨(dú)立并自成體系的一次性反應(yīng)盒增加了設(shè)備的安全性。(6)精確性：多個(gè)光譜的光學(xué)檢測(cè)可以提供準(zhǔn)確的實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果[9-10]。

Xpert MTB/RIF 檢測(cè)方法是全球結(jié)核病診斷和治療方面的一個(gè)重要里程碑，為面臨罹患結(jié)核病和耐藥結(jié)核病危險(xiǎn)的人群帶來新希望。 耐藥結(jié)核病常規(guī)疫情的監(jiān)測(cè)不僅是臨床用藥和評(píng)價(jià)化療的重要依據(jù)，也是流行病學(xué)和結(jié)核病工作的重要指標(biāo)。結(jié)核分枝桿菌耐藥，特別是對(duì) RFP 耐藥，比對(duì) RFP 敏感的結(jié)核患者有更高的病死率。RFP 耐藥非常廣泛，且是耐多藥的一個(gè)重要標(biāo)志。MDR-TB 患者很難被治愈，將帶來潛在 MDR-TB 的傳染性。因此，結(jié)核分枝桿菌耐藥性快速檢測(cè)對(duì)結(jié)核患者的有效治療至關(guān)重要，特別是 RFP 耐藥性快速檢測(cè)具有重要的臨床意義。

[1]洪秀華.臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2014：326-333.

[2]中國(guó)防癆協(xié)會(huì).結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程[J].中國(guó)防癆雜志，2006，18(1)：28-31.

[3]Lawn SO,Meaba P,Bates M,et al.Advances in tuberculosis disagnostics the xpert MTB/RIF assay and future prospects for a point of care test[J].Lancent Infect Dis,2013,13(4):349-361.

[4]Vadwaiv C,Bochme C,Nabeta P,et al.xpert MTB/RIF:a new pillar in diagnosis of extrapulmonary tuberculosis[J].Clin Microbial,2011,49(7):2540-2545.

[5]唐神結(jié).結(jié)核病臨床診治進(jìn)展年度報(bào)告2014[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014:51-68.

[6]歐喜超，夏輝，李強(qiáng),等.結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥核酸擴(kuò)增檢測(cè)成本分析[J].中國(guó)防癆雜志，2013,35(9)：723-728.

[7]雷云.熒光PCR 診斷肺結(jié)核的臨床應(yīng)用研究[J].臨床肺科雜志，2014，19(7)：1278-1279.

[8]夏輝，趙雁林.xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)在我國(guó)應(yīng)用前景[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29(23)：3799-3800.

[9]趙冰，歐喜超，夏輝,等.xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].中國(guó)防癆雜志，2014，36(6)：462-466.

[10] 鄭強(qiáng)，李朝金，茍莉,等.多種肺結(jié)核臨床實(shí)驗(yàn)室診斷方法的比較分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，35(21)：2941-2942.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.041

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1673-4130(2016)20-2901-02

2016-04-18

2016-07-21)

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