微板速率法檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的研究

高朝賢，朱玉蘭，陳鈺婷，李麗梅，張 文，劉征宇，楊學琴，惠長野△

(1.廣東省深圳市職業(yè)病防治院病理毒理科 518020；2.廣東省深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心醫(yī)學實驗室 518033)

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·論 著·

微板速率法檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的研究

高朝賢1，朱玉蘭2，陳鈺婷1，李麗梅1，張 文1，劉征宇1，楊學琴1，惠長野1△

(1.廣東省深圳市職業(yè)病防治院病理毒理科 518020；2.廣東省深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心醫(yī)學實驗室 518033)

目的 探討全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)微板速率法檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的方法評價和臨床應(yīng)用。方法 參照國際臨床化學聯(lián)合會(IFCC)的推薦方法，結(jié)合分析系統(tǒng)建立微板速率法，通過方法學試驗，評價其線性、批內(nèi)和批間重復性；比較823例體檢者血清標本采用微板速率法與常規(guī)生化分析儀法檢測ALT的結(jié)果，并評價方法的臨床應(yīng)用。結(jié)果 微板速率法檢測ALT，在活性303 U/L以下具有良好的線性；批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于1/5TEa，其檢測結(jié)果與常規(guī)生化分析儀的相關(guān)性良好。結(jié)論 全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)微板速率法檢測ALT，為大批量標本同時檢測ALT和ELISA項目提供了很好的選擇，值得臨床推廣使用。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶； 微板速率法； 酶聯(lián)免疫分析

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測是采供血機構(gòu)獻血者和出入境檢驗檢疫機構(gòu)法定的體檢者必查項目之一[1-4]。ALT檢測方法較多[5-6]。國際臨床化學聯(lián)合會(IFCC)和國家衛(wèi)計委推薦速率法[7-8]。本研究基于速率法原理，結(jié)合全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)的特點建立一種快速檢測方法(微板速率法)，并對該方法的線性、精密度、準確度等進行評價。為采供血機構(gòu)和檢驗檢疫機構(gòu)篩查ALT提供一種更高效的檢測方法。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 由深圳國際旅行衛(wèi)生保健中心提供的823例出入境者血清標本，標準品由美國貝克曼公司提供，質(zhì)控品購自RANDOX公司。

1.2 儀器與試劑 Genesis RSP 150/8全自動加樣儀(瑞士Tecan 公司)，F(xiàn)AME 24/20全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)(瑞士Hamilton公司)，AU2700全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)；96孔微量反應(yīng)板(北京萬泰藥業(yè)有限公司)，ALT速率法試劑(上?？迫A生物科技股份有限公司)，標準血清(美國貝克曼公司，批號：66300/0117，定值：85.6 U/L)，質(zhì)控血清[英國RANDOX，批號：HN1530/740UN、HN1532/539UE，參考值：(38±9)、(133±27)U/L]。

1.3 方法 微板速率法檢測ALT：96孔平底酶標板，設(shè)標準孔3孔，質(zhì)控孔2孔(低值和高值各1孔)，留1孔空白，其他為待檢標本孔，采用Genesis RSP 150/8全自動加樣儀分別加標準血清、質(zhì)控血清，標本血清各40 μL，試劑1加入200 μL。試劑2裝入FAME 24/20全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)，設(shè)定第1次讀板程序。試劑2加樣量50 μL，加樣速度為最快，試劑加完后立即讀板，測定主波長340 nm， 參考波長620 nm。設(shè)定第2次讀板的主波長和參考波長同第1次讀板程序，不需加試劑。第1次讀板完成后，取出酶標板，37 ℃孵育600 s后，進行第2次讀板。導出檢測數(shù)據(jù)，Excel處理算出標本檢測結(jié)果。

1.3.1 線性試驗 抽取ALT活性683 U/L(AU2700 全自動生化分析儀)的血清標本，使用生理鹽水做2/3比例稀釋成活度梯度683、455、303、202、135、90、60、40、27、18、12 U/L的11例標本，應(yīng)用微板速率法檢測ALT結(jié)果。

1.3.2 重復性試驗 RANDOX質(zhì)控血清2例，正常值和高值血清各1例，應(yīng)用微板速率法連續(xù)重復檢測20 次，評價該方法的批內(nèi)重復性；每天檢測1次，重復20 d，評價該方法的批間重復性。

1.3.3 對比試驗 823例血清標本分別采用微板速率法和AU2700全自動生化分析儀的傳統(tǒng)檢測方法進行檢測，分析2種方法的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。繪制吸光度變化與ALT活性散點圖，擬合ALT≤303 U/L的直線方程；描述批內(nèi)、批間重復性試驗的均值、標準差及變異系數(shù)；比較2種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 線性試驗 ALT 活性在303 U/L 以下具有良好的線性， ALT與測得吸光度變化的擬合曲線為Y=0.003X+0.005 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3。超過303 U/L，吸光度變化偏離曲線，隨ALT活性升高但吸光度升高不明顯。見圖1。

圖1 微板速率法檢測ALT線性試驗

2.2 重復性試驗 美國臨床實驗室改進法案修正案(CLIA′88)規(guī)定ALT允許總誤差(TEa)為靶值的±20%，微板速率法檢測ALT批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于4%，小于1/5TEa。見表1。

表1 微板速率法檢測ALT重復性試驗

圖2 微板速率法與生化分析儀法的對比試驗

2.3 對比試驗 2種方法檢測823 例血清標本的結(jié)果具有良好的相關(guān)性，擬合線性回歸方程為Y=0.989X+0.289，R2=0.993。2種方法檢測823 例陽性結(jié)果顯示，大于40 U/L陽性結(jié)果的符合率為99.88%。見圖2和表2。

表2 2種方法檢測ALT的結(jié)果比較[n(%)]

3 討 論

IFCC推薦的ALT檢測方法是速率法，其原理是L-丙氨酸和α-酮戊二酸在ALT的作用下生成丙酮酸和L-谷氨酸，丙酮酸在乳酸脫氫酶(LDH)的作用下生成L-乳酸，同時還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化成為NAD+，NADH吸光度的下降速率和ALT的活力呈正比，NADH在340 nm處有特異吸收峰，測定其下降速率，即可測出ALT活性。該方法具有準確度高、重復性好的特點，在臨床檢測中應(yīng)用廣泛，但必須在生化分析儀上完成。與ALT一樣，HBsAg和HIV等ELISA項目也是獻血者和法定體檢者的必檢項目，采供血機構(gòu)和出入境檢驗檢疫機構(gòu)通常需先用酶標儀完成ELISA檢測再用生化分析儀完成ALT檢測。本研究建立的微板速率法可使ALT與ELISA檢測項目同時加樣，并可同時利用全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)檢測，1次可檢測90例標本，10 min內(nèi)完成，免除繁瑣步驟，減少差錯發(fā)生，同時也可避免不同儀器間多次檢測的攜帶污染問題。

本研究微板速率法在ALT活性303 U/L以下時具有良好的線性，檢測上限約300 U/L，檢測ALT具有良好的批內(nèi)和批間重復性，與傳統(tǒng)生化分析儀法的結(jié)果比較，兩者相關(guān)性很好，陽性結(jié)果符合率達99.88%。相關(guān)研究報道，微板ALT檢測方法多數(shù)以賴氏法和丙酮酸氧化酶法為主，這2種方法由于檢測的重復性差，特別是對高值標本的檢測存在嚴重的偏離現(xiàn)象，目前已基本淘汰[9-11]。與其他改良的微板速率法比較，本研究只需檢測2個點吸光度，操作更加簡便[12]。

本研究微板速率法不同于連續(xù)監(jiān)測的速率法，是加入試劑后吸光度與反應(yīng)10 min后吸光度變化的2點速率，對該方法的深入研究結(jié)果表明，反應(yīng)時間影響檢測的重復性和線性范圍。在實際操作中，很難做到每批標本的反應(yīng)時間完全一致，因此需在每塊微孔板上都設(shè)置標準品，計算K值。本研究在儀器、試劑等條件下，10 min反應(yīng)時間的線性上限約300 U/L，超過300 U/L的結(jié)果檢測會偏低，應(yīng)當稀釋后重新復查，不同實驗室由于檢測體系不同，檢測的線性范圍可能存在差異。微板在大批量標本檢測中具有一定的優(yōu)勢，對單個或少量標本的檢測并不是理想的選擇。

綜上所述，本研究建立的微板速率法具有操作性強、結(jié)果穩(wěn)定可靠的優(yōu)點，與傳統(tǒng)生化分析儀法有較好的可比性。該方法可采用全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)使ALT與ELISA其他項目同時檢測，值得臨床推廣應(yīng)用。

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Study on microtiter plate kinetic method to detection ALT

GAOChaoxian1,ZHUYulan2,CHENYuting1,LILimei1,ZHANGWen1,LIUZhengyu1,YANGXueqin1,HUIChangye1△

(1.DepartmentofPathologyandToxicology,ShenzhenPreventionandTreatmentCenterforOccupationalDiseases,Shenzhen,Guangdong518020,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,ShenzhenInternationalTravelHealthcareCenter,Shenzhen,Guangdong518033,China)

Objective To investigate the clinical application of ALT detection based on microtiter plate kinetic method in the automatic enzyme immunoassay system.Methods By beference to the IFCC recommended kinetic method,microtiter plate kinetic method was established in the automatic enzyme immunoassay system of ALT detection.The linear,intro-batch and inter-batch duplicability of the method were evaluated.ALT test results of 823 samples with microtiter plate kinetic method and automatic biochemistry analyzer method were compared.Results Microtiter plate kinetic method had good linearity where ALT activity <303 U/L,the intra batch and inter batch variation coefficients < 1/5TEa.The detection results of the clinical samples were correlated with the biochemical analyzer.Conclusion Microtiter plate kinetic method to detection ALT in the automatic enzyme immunoassay system is an ideal method for simultaneous detection of ALT and ELISA in large batch samples,which is worth popularizing.

ALT; microtiter plate kinetic method; enzyme linked immunosorbent assay

高朝賢，男，主管技師，主要從事醫(yī)學檢驗研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.20.015

A

1673-4130(2016)20-2841-03

2016-05-11

2016-08-11)