2015年上海地區(qū)豬鏈球菌的檢測(cè)與分析

張維誼 王曉旭 沈莉萍 徐 鋒 寧 昆 齊新永

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

2015年上海地區(qū)豬鏈球菌的檢測(cè)與分析

張維誼 王曉旭 沈莉萍 徐 鋒 寧 昆 齊新永

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

對(duì)2015年上海地區(qū)豬屠宰場(chǎng)、豬養(yǎng)殖場(chǎng)、臨床病死豬開(kāi)展豬鏈球菌的分離檢測(cè)，主要包括對(duì)豬唾液、豬鼻拭子、豬場(chǎng)空氣樣本、扁桃體、肺臟等共363份進(jìn)行細(xì)菌分離和PCR鑒定，共分離到豬鏈球菌43株，對(duì)這43株細(xì)菌開(kāi)展mrp、orf2、s1y、gdh、gapdh、epf、fbps 7種主要毒力因子檢測(cè)，通過(guò)對(duì)病原的分析，了解上海地區(qū)豬鏈球菌病的疫情動(dòng)態(tài)和趨勢(shì)，為防控豬鏈球菌病提供依據(jù)。

豬鏈球菌；檢測(cè)；分型；毒力因子

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是革蘭氏陽(yáng)性球菌，屬于鏈球菌屬馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus equi subsp. equi），主要存在于豬扁桃體和鼻腔中，也存在于生殖道和消化道中，屬國(guó)家規(guī)定的二類動(dòng)物疫病，也是一種重要的人畜共患病原菌。豬鏈球菌在全世界范圍內(nèi)廣泛存在，并且嚴(yán)重影響各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。豬鏈球菌根據(jù)其多糖莢膜的抗原性差異，目前已發(fā)現(xiàn)有35個(gè)血清型（l～34型和1/2型）（陳經(jīng)雕，2008）［1］，主要的毒力因子有谷氨酸脫氫酶（gdh）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）、胞外因子（epf）、溶血素（sly）、纖連蛋白結(jié)合蛋白/纖連蛋白（fpbs）、毒力相關(guān)序列（orf2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

本研究采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)與分子生物學(xué)PCR結(jié)合的鑒定技術(shù)，對(duì)上海地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)和臨床門診開(kāi)展豬鏈球菌病的流行情況調(diào)查，并對(duì)病原進(jìn)行血清型分型和毒力因子檢測(cè)，旨在摸清上海地區(qū)豬鏈球菌病的疫情動(dòng)態(tài)和趨勢(shì)，為防控豬鏈球菌病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣本

來(lái)自2015年上海地區(qū)豬養(yǎng)殖場(chǎng)、豬屠宰場(chǎng)和本中心畜禽臨床樣本，主要包括養(yǎng)殖場(chǎng)中小豬唾液樣本、豬鼻拭子樣本、環(huán)境樣本，生豬屠宰場(chǎng)肺臟、扁桃體和下頜淋巴結(jié)樣本以及門診中病/死豬內(nèi)臟樣本。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

1.2.1 培養(yǎng)基、診斷試劑

Columbia血瓊脂基礎(chǔ)，脫纖維羊血購(gòu)自閔行區(qū)諸翟無(wú)菌動(dòng)物血試劑供應(yīng)站，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡（GP）、引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，Premix購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株SS2 由德國(guó)吉森大學(xué)Baljer 教授惠贈(zèng)。

1.2.3 儀器

全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK2-Compact）、普通PCR儀（BioRad PTC-200）。

2 方法

2.1 樣本采集和處理

2.1.1 小豬唾液樣本：將滅菌棉繩捆綁在食槽，待小豬咬食棉繩10分鐘后，將棉繩中唾液擰至采樣袋。共采集2家豬場(chǎng)豬唾液樣品，36份樣品。吸取100ul唾液涂于培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.1.2 環(huán)境樣本：用空氣浮游菌采樣器對(duì)豬場(chǎng)空氣進(jìn)行樣品采集，空氣流量設(shè)為100cm3/S，采集3s，每棟豬舍采集2份標(biāo)本，共計(jì)32份樣品。對(duì)樣本直接進(jìn)行培養(yǎng)。

2.1.3 養(yǎng)殖場(chǎng)中豬鼻拭子樣本：用滅菌棉簽，伸入豬鼻腔內(nèi)深處，旋轉(zhuǎn)2圈，采集豬鼻拭樣本。每季度采集2個(gè)區(qū)，每次2個(gè)豬場(chǎng)，每個(gè)場(chǎng)10份鼻拭。直接涂于培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.1.4 屠宰場(chǎng)內(nèi)臟樣本：無(wú)菌采集豬屠宰場(chǎng)肺臟、扁桃體和下頜淋巴結(jié)樣本于樣品袋內(nèi)。上下半年分4次采集3個(gè)豬屠宰場(chǎng)的140份樣品進(jìn)行豬鏈球菌分離。上半年肺臟、扁桃體和下頜淋巴結(jié)各20份，下半年采集肺臟、扁桃體各30份。用滅菌生理鹽水沖洗扁桃體和肺臟組織，無(wú)菌采取扁桃體和肺臟組織涂抹接種培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.1.5 病/死豬內(nèi)臟樣本：無(wú)菌采集死亡豬的肝、脾、肺、心、淋巴結(jié)、扁桃體等組織，腦膜炎病例還采集腦組織等樣品；對(duì)局部感染病例，無(wú)菌采集關(guān)節(jié)液及其周圍組織或局部膿液。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

按要求將樣本涂抹接種于Columbia血平板（加入1μl/ml過(guò)濾除菌的NAD和5～10%脫纖維綿羊血），在5%CO2培養(yǎng)箱中經(jīng)36℃培養(yǎng)24～48h，對(duì)可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。挑取單個(gè)菌落接種于Columbia血平板進(jìn)行純培養(yǎng)，觀察菌落特征，染色特點(diǎn)。

2.3 細(xì)菌鑒定

參照文獻(xiàn)［2］合成豬鏈球菌的引物，具體見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為25μl：premix 12.5μl，引物各0.5μl，ddH2O 8.5μl，模板2μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)熱5 min；94℃30s，56℃30s，72℃1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

表1 豬鏈球菌二重PCR檢測(cè)引物

2.4 豬鏈球菌主要毒力因子檢測(cè)

參照李小軍等［2］建立的兩組多重PCR方法檢測(cè)mrp、orf2、sly、gdh、gapdh、epf、fbps 7種主要毒力因子。具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離鑒定

經(jīng)24h培養(yǎng)，對(duì)α溶血、灰白色、濕潤(rùn)、表面光滑、邊緣整齊、1mm大小菌落染色鏡檢，G+球菌，2～5個(gè)鏈，經(jīng)Columbia血平板24h純培養(yǎng)，菌落提取DNA模板，進(jìn)行豬鏈球菌二重PCR檢測(cè)，共43份陽(yáng)性。對(duì)豬鏈球菌PCR陽(yáng)性菌株在VITEK2-Compact和VITEK MS上進(jìn)行鑒定，均為豬鏈球菌屬。

3.2 分離檢測(cè)結(jié)果

2015年從363樣本中共分離到57株豬源致病性鏈球菌，其中共鑒定出豬鏈球菌43株，總陽(yáng)性率為11.85%，具體見(jiàn)如下數(shù)據(jù)：

從36份豬唾液樣本分離到到6株，分離率為16.67%；從80份豬鼻拭中分離到16份豬鏈球菌，分離率為20%；從140份屠宰場(chǎng)內(nèi)臟樣本中分離出豬鏈球菌7株，分離率為8.75%，均來(lái)自上半年扁桃體內(nèi)臟，未從其他組織分離到豬鏈球菌；32份空氣樣品未檢測(cè)到豬鏈球菌。

2015年從75份臨床病例中分離到14例豬鏈球菌病臨床病例，從豬發(fā)病表現(xiàn)來(lái)看，臨床上關(guān)節(jié)炎型、敗血癥型、腦膜炎型分別占35.7%、28.6%、21.4%；14例豬鏈球菌病臨床病例多以混合感染為主，單純鏈球菌感染病例很少見(jiàn)（2，14.29%）。臨床常見(jiàn)的病例偽狂犬+豬鏈球菌（3，21.43%）豬藍(lán)耳病+豬鏈球菌（3，21.43%）。

3.3 豬鏈球菌主要毒力因子檢測(cè)結(jié)果

gdh、gapdhgdh、orf2 3種毒力因子大部分菌株都能檢出，gdh、gapdh這2種毒力因子的檢測(cè)率最高，達(dá)95.34%，orf2的檢出率其次，70.07%，50%菌株能檢出mrp、fbps，但epf、sly檢查率低，分別為39.53%、25.58%。

4 分析

自20世紀(jì)50年代初期證實(shí)豬鏈球菌是豬腦膜腦炎、關(guān)節(jié)炎的主要病原以來(lái)，荷蘭、英國(guó)、美國(guó)、加拿大、澳大利亞、新西蘭、巴西、丹麥、日本、中國(guó)（包括臺(tái)灣省）等先后報(bào)道了豬鏈球菌病。1998年-1999年夏季在我國(guó)江蘇省部分地區(qū)豬群中暴發(fā)流行并導(dǎo)致特定人群感染致死的也是豬鏈球菌，2005年又在四川爆發(fā)生豬因感染鏈球菌發(fā)病死亡的案例，可見(jiàn)豬鏈球菌不僅多畜牧業(yè)造成巨大危害，也對(duì)人類公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅。本研究選擇豬鏈球菌有重要意義，從檢查結(jié)果看陽(yáng)性率達(dá)11.85%，要重視豬鏈球菌病的防控。

豬鏈球菌的天然定植部位是上呼吸道，尤其扁桃體和鼻腔中，在本研究中分離率最高的是從豬養(yǎng)殖場(chǎng)的80份豬鼻拭中分離到16份豬鏈球菌，分離率為20%；而從140份屠宰場(chǎng)的扁桃體中分離出豬鏈球菌7株，分離率為8.75%，扁桃體分離率低于豬鼻拭的分離率。此外，在養(yǎng)殖場(chǎng)的空氣樣品未檢測(cè)到豬鏈球菌，這可能間接證明空氣中未含有豬鏈球菌。

豬鏈球菌培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格，在室溫下僅少量存活，專門需要在體內(nèi)環(huán)境中生長(zhǎng)［3］，體外存活時(shí)間短，采集的樣品需要在沒(méi)有使用抗生素之前。目前沒(méi)有找到添加何種抗生素進(jìn)行豬鏈球菌增菌，直接進(jìn)行平板培養(yǎng)，如果采集的樣品污染嚴(yán)重，分離更加困難，今后需加強(qiáng)對(duì)豬鏈球菌增菌培養(yǎng)的研究。

研究表明，豬鏈球菌致病性強(qiáng)弱與其毒力因子密切相關(guān)。其中mrp和epf是強(qiáng)毒株的標(biāo)志，sly為一種巰基活化類毒素，在菌體入侵和裂解細(xì)胞的過(guò)程發(fā)揮作用。其他獨(dú)立因子均與細(xì)菌的致病性有著密切的關(guān)系。研究中有50%菌株檢出mrp，39.53%的菌株檢出epf，說(shuō)明有近4成的豬鏈球菌為強(qiáng)度株。

［1］ 李小軍.上海地區(qū)豬鏈球菌致病性血清型及其毒力因子的流行病學(xué)調(diào)查［D］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［2］ 趙德明，張仲秋，周向梅.豬病學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2014：800-801.

［3］ 李鵬，何永聚，馮書章.豬鏈球菌2型新毒力相關(guān)基因的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011，24（3）：362-365.

張維誼（1979—），女，碩士，高級(jí)獸醫(yī)師，一直從事動(dòng)物疫病的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)、診斷和技術(shù)推廣工作。

研究來(lái)源：滬農(nóng)青字（2014）第2-12 號(hào)和滬農(nóng)科攻字（2014）第7-3-3號(hào)