狗獾東北亞種卵巢卵泡的超微結構研究

王 素 葛艷艷 王冠群 劉玉堂*

(1.東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040；2.莊河市第五高級中學，大連，116413)

狗獾東北亞種卵巢卵泡的超微結構研究

王 素1葛艷艷2王冠群1劉玉堂1*

(1.東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040；2.莊河市第五高級中學，大連，116413)

狗獾東北亞種；

(1.College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Harbin，150040，China；2.Zhuanghe Fifth Senior High School，Dalian，116413，China)

狗獾(Melesmeles)隸屬于食肉目(Carnivora)鼬科(Mustelidae)，是一種兼具延遲著床和半冬眠特征的中型穴居動物，并于2000年8月1日入選國家林業(yè)局發(fā)布的《國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學研究價值的陸生野生動物名錄》。近年來，由于人們的捕殺和棲息地的破壞導致狗獾數(shù)量銳減。目前關于狗獾的研究主要涉及行為[1-3]、生態(tài)[4-5]、飼養(yǎng)[6-8]等，同時關于狗獾的繁殖期有了新的進展，有研究證明狗獾東北亞種的繁殖交配期是在4～6月，不同于以往的報道[3，8]，但關于狗獾卵巢卵泡的超微結構研究尚未見報道。本實驗通過透射電鏡對4～6月的狗獾東北亞種(Melesmelesamurensis)卵巢卵泡的超微結構進行觀察，探究其卵泡的發(fā)育規(guī)律，為狗獾的生殖生理及其胚胎工程提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2012年4～6月，在狗獾交配期選黑龍江省雙鴨山市饒河脈動珍稀動物繁育有限公司飼養(yǎng)場取2年齡以上剛剛成功完成交配的健康雌性成年狗獾的卵巢，按常規(guī)方法處理，先后制成卵巢皮質包埋塊、經(jīng)半薄切片對卵泡分類和卵母細胞定位后用超薄切片機切成厚度在50 nm左右的切片，染色后透射電鏡觀察、記錄并照相。

1.2 卵泡細胞的分類

在本實驗中，我們參照水貂(Mustelavison)卵泡分類方法[9]，將卵泡按照直徑大小、卵泡細胞的層數(shù)、透明帶的情況、卵泡腔是否出現(xiàn)分為4個階段。第Ⅰ階段：卵母細胞由單層扁平卵泡細胞圍繞，分布于皮質的淺層；第Ⅱ階段：卵母細胞由立方狀卵泡細胞圍繞，卵泡細胞與卵母細胞之間出現(xiàn)裂隙；第Ⅲ階段：卵母細胞由兩至數(shù)層卵泡細胞圍繞，卵泡膜清晰，形成完整的透明帶；第Ⅳ階段：卵母細胞由多層卵泡細胞圍繞，卵泡膜增厚，透明帶增厚，出現(xiàn)大的卵泡腔，并出現(xiàn)卵丘。

2 結果

2.1 第Ⅰ階段

卵母細胞為圓形或橢圓形，中央有一個大而圓的均質核。細胞器大多分布于質膜下的皮質區(qū)。線粒體豐富，多為圓形，嵴較少，單個或成群的分布于細胞質中。粗面內質網(wǎng)豐富，可見與線粒體相伴。高爾基體由扁平囊和小泡構成，位于近質膜的皮質區(qū)，凹面朝向質膜。偶見皮質顆粒。脂滴數(shù)量較多，大小不一，呈嗜鋨性深染(圖1)。此時期卵泡細胞為單層扁平細胞，卵泡細胞及其核均呈長扁形，核質比較高。細胞器位于核周圍的細胞質中，線粒體為圓形，數(shù)量較少，與周圍的粗面內質網(wǎng)聯(lián)系緊密?？梢姷礁郀柣w。大部分卵泡細胞與卵泡細胞及卵母細胞為平滑相貼，有時可見橋粒連接。

圖1 第Ⅰ階段卵泡細胞，可見大量深染的脂滴(→)，x 6 000Fig.1 Follicle cells in stageⅠ，plenty of hyperchromatic lipid droplet can be seen(→)，x 6 000

2.2 第Ⅱ階段

卵母細胞開始增大。線粒體直徑變小，含少量的嵴，有時與內質網(wǎng)及高爾基體相連系，可見啞鈴型線粒體。滑面內質網(wǎng)增多，以單個囊池形式存在。高爾基體數(shù)量較多。胞質中脂滴數(shù)量較多，染色變淺。質膜上可見吞噬小泡。此時期卵泡細胞變?yōu)閱螌恿⒎?圖2)，核質比很大，細胞器數(shù)量增加，分布于核兩側。細胞質中可見成束的微絲。線粒體圓形或橢圓形，沒有明顯的嵴，四周圍繞有豐富的內質網(wǎng)。細胞質中出現(xiàn)一些厚壁的空泡，此泡狀結構膜內側附著一薄層膠質樣物質。卵泡細胞外的基膜明顯，向卵泡方向形成柱狀突起。

2.3 第Ⅲ階段

卵母細胞中線粒體數(shù)量增加，呈圓形、橢圓形或啞鈴型，高爾基體有時與線粒體、內質網(wǎng)相接。皮質顆粒增多，分為明暗兩種形式，在質膜下一字排開。脂滴分布于細胞器層與核之間的胞質中。卵母細胞外圍有完整的透明帶。此階段卵泡細胞增加，核大呈圓形或橢圓形，在接近核邊緣出現(xiàn)許多微絲。線粒體多為圓形或橢圓形，有些線粒體中可見嵴。粗面內質網(wǎng)經(jīng)常連接著線粒體。細胞質中可見厚壁的空泡(圖3)。細胞膜上可見許多胞吐小泡。

圖2 第Ⅱ階段卵泡細胞，x 10 000Fig.2 Follicle cells in stageⅡ，x10 000

圖3 第Ⅲ階段卵泡細胞，可見厚壁空泡(→)，x 12 000Fig.3 Follicle cells in stageⅢ，thick walled physalides can be seen(→)，x 12 000

2.4 第Ⅳ階段

卵母細胞非常大，核膜邊緣不規(guī)則。中央?yún)^(qū)細胞器少于皮質區(qū)。線粒體呈圓形、橢圓形或啞鈴型，數(shù)量增加，成群的聚集在一起(圖4)。高爾基體數(shù)量較多，結構典型，主要由管狀囊池構成。皮質顆粒位于卵母細胞膜下，線狀排列，仍可見明、暗兩種類型。脂滴數(shù)量較多，染色淺，核膜周圍存在一定數(shù)量的脂滴。卵母細胞膜上仍可見吞噬小泡。透明帶增厚，圍繞卵母細胞(圖5)。卵母細胞膜與透明帶之間有縫隙，微絨毛減少，有的縮短變彎，生長方向變得沒有規(guī)律，部分已經(jīng)從透明帶中退出。此階段卵泡細胞的細胞核較大，胞質中可見成束的微絲(圖6)。接近透明帶的卵泡細胞為柱狀細胞，粗面內質網(wǎng)豐富，可見線粒體與內質網(wǎng)相貼。有的卵泡細胞中存在脂滴，有的卵泡細胞中可見厚壁空泡。此外可見到卵泡細胞形成的放射狀結構，卵泡細胞間空隙加大，卵丘細胞呈現(xiàn)出不同程度的伸展狀態(tài)。卵泡細胞與卵母細胞間的橋粒連接被中斷。卵泡中出現(xiàn)卵泡腔，卵泡液增多，與卵泡細胞連接的透明帶不是平滑的，可見卵泡細胞的突起與卵細胞表面連接。

圖4 第Ⅳ階段卵泡細胞，可見成群分布的線粒體(→)，x 25 000Fig.4 Follicle cells in stageⅣ，mitochondria gathered together in groups can be seen(→)，x 25 000

圖5 第Ⅳ階段卵泡細胞，可見透明帶(→)，x 5 000Fig.5 Follicle cells in stageⅣ，the pellucid zone can be seen(→)，x 5 000

圖6 第Ⅳ階段卵泡細胞，可見成束的微絲(→)，x 15 000Fig.6 Follicle cells in stageⅣ，the fascicular microfilament can be seen(→)，x 15 000

3 討論

3.1 卵母細胞的超微結構變化

狗獾卵母細胞中的細胞器散布于細胞質中，而東北梅花鹿(Cervusnipponhortulorum)[10]、牛(Bos primigenius taurus)[11]等動物細胞器則逐漸遷移到皮質區(qū)，在細胞中央形成不含細胞器的“透明區(qū)”。

線粒體是細胞內供應能量的“動力工廠”。狗獾卵母細胞中線粒體由少增多，在第Ⅳ階段，線粒體成群分布。線粒體逐漸增多并聚集說明線粒體為胞質內生命活動提供較高的能量水平。牛[11]、山羊(Capraaegagrushircus)[12]、東北梅花鹿[10]卵母細胞中有的線粒體具有帽狀結構，在狗獾中未發(fā)現(xiàn)帽狀結構線粒體，水貂[9]、大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)[13]、銀狐(Vulpesvulpes)[14]中也未發(fā)現(xiàn)，這可能是物種之間的差異。

皮質顆粒是卵母細胞特有的細胞器，皮質顆粒的增殖及分布的變化被認為是卵母細胞成熟的標志之一[15]。狗獾第Ⅰ階段卵母細胞就可見到皮質顆粒，但數(shù)量較少。這與水貂[9]、牛[11]皮質顆粒形成的時間較為相似，而有別于豬(Susscrofadomestica)[16]、大鼠、小鼠[17-18]等動物。第Ⅳ階段時，狗獾卵巢皮質顆粒增多并呈線形排列于卵母細胞膜下，這與大多數(shù)哺乳動物是相似的，但牛存在大量的皮質顆粒成團向皮質區(qū)遷移的現(xiàn)象[11]。

脂滴作為營養(yǎng)物質的一種貯存形式，普遍存在于哺乳動物的卵母細胞中，為胚胎發(fā)育提供能量。狗獾第Ⅰ階段卵母細胞就出現(xiàn)大量的脂滴，這與其他動物明顯不同，水貂[19]第Ⅱ階段開始出現(xiàn)脂滴，東北梅花鹿在三級卵泡的卵母細胞才偶見到少量的脂滴[10]；在脂滴數(shù)量方面：狗(Canislupusfamiliaris)[20]、馬鹿(Cervuselaphus)[21]、水貂[19]的卵母細胞中脂滴數(shù)量較多，豚鼠卵母細胞內脂滴含量中等[22]，而大鼠、倉鼠和幾種靈長類動物的卵母細胞內脂滴含量很少[23-24]。水貂的胚胎具有延遲著床的生理特征[25-26]，而脂滴可為延遲著床的胚胎提供營養(yǎng)[19]。狗獾同樣具有延遲著床的特性，而且時間較水貂要長，這可能就是脂滴在狗獾中出現(xiàn)較早并且數(shù)量多的原因。研究中還發(fā)現(xiàn)，狗獾卵母細胞中的脂滴在第Ⅰ階段時呈嗜鋨性染色，且著色較深，到第Ⅳ階段時顏色變淺。水貂也存在這樣的現(xiàn)象，研究證明水貂脂滴的主要成分是中性脂肪和磷脂，而其顏色深表明磷脂含量高，脂滴顏色變淺與磷脂在卵泡腔形成后消失有關[19]。狗獾卵母細胞中脂滴著色深淺變化可能也是這個原因。狗獾第Ⅰ階段直徑較小而顏色深，表明其磷脂含量高，由此可推斷，磷脂含量高可能是鼬科動物所具有的共同特征，這很可能與水貂和狗獾屬于交配刺激排卵動物有關，第Ⅰ階段卵母細胞儲存較多磷脂，有利于為其在短時間內迅速發(fā)育成熟過程各種膜細胞器的快速增殖提供原料儲備。

3.2 卵泡細胞超微結構變化

卵泡細胞為卵母細胞的生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質及信息。狗獾卵泡發(fā)育過程中，可見卵泡細胞與卵母細胞通過胞質突起保持聯(lián)系，這種現(xiàn)象同樣存在于水貂[27]、東北梅花鹿[10]、牛[11]等動物中。

卵泡中細胞器隨著卵母細胞的發(fā)育而更加豐富，線粒體和內質網(wǎng)往往相伴，核糖體散布于胞質中，這表明卵泡細胞的合成和分泌逐漸旺盛，但在狗獾的卵泡細胞中很少見到高爾基體，水貂也是如此，其原因值得探究。

狗獾卵泡細胞中存在厚壁小泡，水貂[27]及東北梅花鹿[10]也存在此結構，但其功能尚不明確。Weakley[28]認為此結構是脂滴，楊景晁[29]等人則認為是脂滴前體。

狗獾第Ⅱ階段卵泡細胞內出現(xiàn)成束的微絲，并隨著卵泡細胞的發(fā)育而增多。微絲在水貂、東北梅花鹿等動物中均可見，只是出現(xiàn)時間略有不同。目前對微絲的研究認為其功能是支持卵泡克服來自卵巢其他細胞的壓力，使卵泡向外擴張。

[1] 謝志剛，楮可龍，蔣文忠，等.圈養(yǎng)條件下狗獾的夜活動節(jié)律及時間分配[J].湖北農業(yè)科學，2011，50(10)：2070-2073.

[2] 徐循，謝志剛，崔勇勇，等.重引入狗獾秋冬季行為的初步研究[J].動物學雜志，2012，47(3)：49-52.

[3] 王亮，李永成，張藐，等.籠養(yǎng)狗獾東北亞種繁殖規(guī)律[J].動物學雜志，2015，50(6)：957-962.

[4] 殷寶法，劉宇慶，劉國興，等.京杭運河堤壩區(qū)域狗獾的棲息地特征[J].生態(tài)學報，2011，31(7)：2002-2007.

[5] 楊會濤，劉振生，徐坤，等.狗獾秋季對生境的選擇——以黑龍江省方正林業(yè)局為例[J].生態(tài)學報，2010，30(7)：1875-1881.

[6] 韓慶，彭友林.狗獾的人工養(yǎng)殖技術[J].飼料研究，2002(1)：46-47.

[7] 游樹楷.人工養(yǎng)殖狗獾[J].特種經(jīng)濟動植物，2002，5(3)：9.

[8] 劉玉堂，陳忠.狗獾的繁殖特征及其重要醫(yī)學研究價值[J].經(jīng)濟動物學報，2010，14(4)：228-231.

[9] 劉玉堂，秦鵬春.水貂初級卵母細胞發(fā)育過程中細胞器變化的電鏡觀察[J].解剖學雜志，1992，15(6)：452-454.

[10] 馬澤芳，張林媛，鄭丁團，等.東北梅花鹿初級卵母細胞的超微結構[J].獸類學報，2006，26(1)：59-63.

[11] 孫青原，秦鵬春.牛卵母細胞發(fā)育的超微結構研究[J].山東農業(yè)大學學報，1989，20(4)：9-16.

[12] 譚景和，孫青原，楊增明，等.山羊卵母細胞發(fā)育的超微結構研究[J].解剖學報，1992，23(1)：106-110.

[13] 張志和，張美佳，侯蓉，等.大熊貓卵母細胞體外成熟及受精后的超微結構觀察[J].中國獸醫(yī)學報，2000，20(5)：501-504.

[14] 孫鳳俊，邴印忠，劉春龍，等.銀狐卵母細胞發(fā)育和老化過程的細胞學研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2001(6)：28-29.

[15] Sathananthan A H，Trounson A O.Ultrastructural observations on cortical granules in human follicular oocytes cultured in vitro[J].Gamete Research，1982，5(2)：191-198.

[16] 李云龍，秦鵬春.豬卵巢內卵母細胞發(fā)育的超微結構研究[J].東北農學院學報，1983，1(1)：69-88.

[17] Szollosi D.Development of cortical granules and the cortical reaction in rat and hamster eggs[J].The Anatomical Record，1967，159(4)：431-446.

[18] Sz?ll?si D.Oocyte maturation and paternal contribution to the embryo in mammals[M]//Gropp A,Benirschke K.Developmental biology and pathology.Springer Berlin Heidelberg，1976：9-27.

[19] 劉玉堂，秦鵬春.水貂卵母細胞發(fā)育過程中脂滴的形態(tài)學及組織化學變化的研究[J].東北農學院學報，1993，24(4)：382-387.

[20] Tesoriero J V.A morphologic，cytochemical，and chromatographic analysis of lipid yolk formation in the oocytes of the dog[J].Gamete Research，1982，6(3)：267-279.

[21] 齊艷萍，崔凱，李和平.馬鹿卵母細胞的超微結構研究[J].特產研究，2006，28(3)：8-10.

[22] Adams E C，Hertig A T.Studies on guinea pig oocytes I.Electron microscopic observations on the development of cytoplasmic organelles in oocytes of primordial and primary follicles[J].Journal of Cell Biology，1964，21(3)：397-427.

[23] Sz?ll?si D.Changes of some cell organelles during oogenesis in mammals[M]//Biggers D,Schuetz A W.Oogenesis Baltimore：University Park Press，1972：47-64.

[24] Zamboni L.Ultrastructure of mammalian oocytes and ova[J].Biology of Reproduction，1970，2(S2)：44-63.

[25] Enders A C.Reproduction of mink[J].Proceedings of the American Philosophical Society，1952，96(6)：691-755.

[26] Enders A C.The fine structure of the blastoeyst[M]//Blandau R J.The biology of the blastocyst.Chicago：University of Chicago Press，1971：71-94.

[27] 劉玉堂，秦鵬春.水貂卵母細胞發(fā)育過程中卵泡細胞的微細結構研究[J].獸類學報，1995，15(4)：273-278.

[28] Weakley B S.Electron microscopy of the oocyte and granulosa cells in the developing ovarian follicles of the golden hamster(Mesocricetusauratus)[J].Journal of Anatomy，1966，100(Pt 3)：503-534.

[29] 楊景晁，田長永，張林媛，等.東北梅花鹿卵泡發(fā)育過程中卵泡細胞超微結構的觀察[J].特產研究，2009，31(1)：5-10.

Melesmelesamurensis；

Ultrastructure Study on Ovarian Follicles of Meles meles amurensis

Wang Su1Ge Yanyan2Wang Guanqun1Liu Yutang1*

We used a transmission electron microscope(TEM)to study the ultrastructure of ovarian follicle development inMelesmelesamurensis.With the development of oocytes，the morphology of organelles changed，the quantity of organelles increased and the organelles were scattered in the cytoplasm.The mitochondria in stage I were initially round and then developed into a dumbbell shape and gathered together in groups in stage Ⅳ.The highly developed Golgi complex was visible in stage I.The amount of cortical granule was small in stage I but increased in number and lined up under the plasma membranes in stage Ⅳ.Lipid droplets in stage I were black，osmiophilic，of various sizes and occurred in large quantities，and they occurred in greater numbers and were less black osmiophilic in stage Ⅳ. During the development of follicle cells，their shape changed from long flat into cube or circle，numbers increased，their organelles occurred in greater numbers，and the connections between the organelles was closer.The thick walled vesicle and the fascicular microfilament were visible in the cytoplasma of follicle cells.

稿件運行過程

2016-05-06

修回日期：2016-05-20

發(fā)表日期：2016-11-10

卵巢卵泡；

超微結構；

細胞器

Ovary follicle；

Ultrastructure；

Organelles

Q952.4

A

2310-1490(2016)04-311-05

為探究狗獾卵巢卵泡的發(fā)育規(guī)律，應用透射電鏡對狗獾東北亞種(Melesmelesamurensis)卵巢卵泡的超微結構進行觀察，結果表明：隨著卵母細胞發(fā)育，胞質內細胞器的形態(tài)發(fā)生變化，數(shù)量不斷增多，并散布于細胞質中；卵母細胞質中的線粒體在第Ⅰ階段為圓形，發(fā)育到第Ⅳ階段可見啞鈴型線粒體，并成群聚集在一起；第Ⅰ階段卵母細胞即可見發(fā)達的高爾基復合體及少量皮質顆粒，發(fā)育到第Ⅳ階段皮質顆粒數(shù)量增多并在質膜下一字排開；在第Ⅰ階段卵母細胞中可見許多嗜鋨性脂滴，大小不一，顏色深，第Ⅳ階段脂滴數(shù)量較多，顏色變淺。卵泡細胞在發(fā)育過程中由長扁形變?yōu)榱⒎叫渭皥A形，數(shù)量增多，胞質中的細胞器逐漸增多，細胞器間的聯(lián)系更加緊密；卵泡細胞質中出現(xiàn)厚壁的空泡；并可見成束的微絲。

國家林業(yè)局野生動植物保護司項目[林計發(fā)2015]；東北林業(yè)大學大學生創(chuàng)新訓練項目

王素，女，21歲，本科生；主要從事野生動物與自然保護區(qū)管理研究。 E-mail：wangsu1995@163.com

*通訊作者：劉玉堂， E-mail：liu-yutang@foxmail.com