大熊貓慢性營養(yǎng)不良綜合征病因學研究

王成東 Carlos Sanchez 羅 娌 蘭景超 李明喜 黃詳明楊 智 劉 禮 黃文俊 吳孔菊 楊光友 顏其貴

(1.成都大熊貓繁育研究基地，成都，610081；2.華盛頓國家動物園，華盛頓；3.四川農業(yè)大學，雅安，625014)

大熊貓慢性營養(yǎng)不良綜合征病因學研究

王成東1Carlos Sanchez2羅 娌1蘭景超1李明喜1黃詳明1楊 智1劉 禮1黃文俊1吳孔菊1楊光友3顏其貴3

(1.成都大熊貓繁育研究基地，成都，610081；2.華盛頓國家動物園，華盛頓；3.四川農業(yè)大學，雅安，625014)

大熊貓；

(1.Chengdu Research Base of Giant Panda Breeding，Chengdu ，610081，China；2.The National Zoological Garden，Washington，D.C.，USA；3.Sichuan Agricultural Unversity，Yaan，625014，China)

圈養(yǎng)條件下，大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)慢性營養(yǎng)不良綜合征(Stunted Development Syndrome，SDS)是一種發(fā)病率極高、病因病原不明、難以預防與治愈的全球性疑難病癥，其發(fā)病致死率占大熊貓圈養(yǎng)種群總死亡率的37.5%[1]。特別是處于生長發(fā)育階段的亞成體大熊貓，一旦發(fā)生該病，極容易變成僵貓、失去繁殖能力，最終死亡[1-5]。該病的主要臨床特征是消瘦、被毛粗亂無光澤、食欲時好時壞、排黏頻繁(4～10次/月)且持續(xù)時間長、體重增長緩慢或不增長，更為嚴重者出現(xiàn)腹水、低蛋白血癥等。由于病因學不清，該病在臨床治療上除一般性對癥支持治療外別無他法，即使偶爾有一定效果，但無法從根本上治愈[1-7]，給圈養(yǎng)大熊貓繁育與種群壯大造成了極其嚴重的危害。為了探討該病的發(fā)病原因，本研究特從血液學、寄生蟲學、細菌學、病毒學和病理組織學領域開展了大熊貓慢性營養(yǎng)不良綜合征病因學探索，旨在為該病的臨床治療和預防提供確實的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4只患慢性營養(yǎng)不良綜合征的大熊貓均來自成都大熊貓繁育研究基地大熊貓種群，年齡和體重為2005年時數據，具體臨床資料見表1。

表1 4只患慢性營養(yǎng)不良大熊貓個體基本臨床資料

Tab.1 Clinical datas of four giant pandas sufferring from SDS

1.2 慢性營養(yǎng)不良綜合征判定標準

同時符合以下標準的大熊貓個體被診斷為慢性營養(yǎng)不良綜合征[5]。

1.2.1 外觀

食欲時好時壞、體形消瘦、被毛粗亂無光澤、腹圍增大或伴有波動感，排黏頻繁(>4次/月)(圖1)

圖1 患慢性營養(yǎng)不良綜合征大熊貓個體Fig.1 Giant panda characterized by stunted development syndrome

1.2.2 體形

與同齡個體相比，體形明顯瘦??；成年雄性個體體重低于100 kg，成年雌性個體體重低于80 kg。

1.2.3 繁殖能力

與實際年齡相比生殖器發(fā)育不成熟；雌性個體不發(fā)情、發(fā)情行為紊亂或偶爾受孕產畸形胎兒；雄性個體繁殖季節(jié)無性欲、采不出精液或者偶爾采出精液但精液質量無法滿足繁殖需要。

1.3 儀器

內窺鏡(日本Olympus生產)、B超機(荷蘭PMI生產)、MATRX麻醉機(美國Midmark生產)。

1.4 動物麻醉

5%的鹽酸氯胺酮按8～10 mg/kg體重麻醉保定后，用Isoflurane進行氣管插管麻醉。

1.5 血液常規(guī)與生化

非麻醉無干擾條件下，每月采集4只患病大熊貓外周血液進行血液常規(guī)和生化檢查，持續(xù)檢查1 a。

1.6 病原學檢查

1.6.1 細菌的分離鑒定

1.6.1.1 標本

4只患病大熊貓糞便、肛拭子、血液。

1.6.1.2 分離培養(yǎng)

將標本接種于CEM增菌液中，在42℃含有85% N2、10% CO2和5% O2的微需氧條件下，培養(yǎng)12 h后再移種于Campy BAP血瓊脂平板上培養(yǎng)48 h后觀察結果；將標本增菌后分別接種與S-S、EMB瓊脂及血平板和庖肉培養(yǎng)基中，分別置于需氧、厭氧(37℃)培養(yǎng)24～48 h觀察結果。

1.6.2 寄生蟲檢查

1.6.2.1 寄生蟲蟲卵或卵囊檢查

定期收集每只大熊貓糞便，通過循序沉淀法、漂浮法、改良抗酸染色法并結合PCR方法[8-9]等進行寄生蟲蟲卵或卵囊檢查。

1.6.2.2 犬惡絲蟲檢查

定期采集每只大熊貓血液，采用改良柯氏試驗(Knott’s test)進行犬惡絲蟲(Dirofilariaimmitis)微絲蚴檢查和ELISA方法進行犬惡絲蟲抗原的檢測[9]。

1.6.3 病毒病原學檢查

1.6.3.1 犬瘟熱病毒RT- PCR 擴增

參照文獻[10]進行操作，即采用10 μL體系：RNA 模板7 μL，5×PrimeScritTM緩沖液2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，反轉錄反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存；PCR反應體系為：10 μL 2×TaqPCR Master Mix，6 μL滅菌雙蒸水，3 μL反轉錄模板，各0.5 μL上下游特異引物；PCR循環(huán)參數為：95℃預變性5 min；95℃循環(huán)變性30 s，54℃退火復性30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)次數為30次；72℃延伸10 min，取擴增產物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并觀察結果。

1.6.3.2 犬細小病毒PCR擴增

參照文獻[11]進行操作，PCR反應體系為：10 μL 2×TaqPCR Master Mix，7 μL滅菌雙蒸水，2 μL模板，上下游引物各0.5 μL。0.5反應參數為：95℃預變性 5 min；95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。取10 μL擴增產物于10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，并觀察結果。

1.7 病理組織學檢查

內窺鏡活剪鉗鉗取患病動物結腸可疑病變組織3～4塊，常規(guī)福爾馬林固定后進行病理組織學觀察。

2 結果

2.1 血液學檢查

4只受檢大熊貓連續(xù)1 a的血液常規(guī)和生化檢查結果(表2)顯示：除貧血、低蛋白血癥、低血鈣、高血磷、血清Ca/P明顯倒置外，血液中性粒細胞下降、淋巴細胞升高，尤其是嗜酸性粒細胞(Eosinophil)顯著升高(8%～30%)，呈現(xiàn)典型的嗜酸性粒細胞血癥[12](Eosinophilia)。

表2 4只患病大熊貓個體2005～2006年度血液學檢查結果

Tab.2 CBC and blood chemistry of 3 giant pandas sufferring from SDS from 2005 to 2006

2.2 病原學檢查

2.2.1 寄生蟲學檢查

通過沉淀法和漂浮法檢查，4只患病大熊貓除偶有大熊貓蛔蟲卵檢出外，未見其他寄生蟲蟲卵；通過改良抗酸染色法并結合PCR方法檢查，4只患病大熊貓糞便中未發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲(Cryptosporidium)；通過血液涂片檢查，所有大熊貓血液中未發(fā)現(xiàn)犬惡絲蟲微絲蚴，通過ELISA抗原快速檢查，所有大熊貓血液樣品的犬惡絲蟲抗原呈陰性。

2.2.2 細菌學檢查

研究期間，除1#大熊貓急性腹瀉伴紅色黏液便和2#大熊貓急性腹瀉伴嚴重血尿癥時分離出一株致病性克雷伯氏桿菌外[13]，所有樣品在需氧和厭氧培養(yǎng)基中均未檢出致病性大腸桿菌和沙門氏菌；在微需氧培養(yǎng)基中未檢出彎曲桿菌。

2.2.3 病毒學檢查

通過對犬瘟熱病毒和細小病毒PCR擴增，結果顯示為陰性(圖2，圖3)。

2.2.4 結腸病理組織學觀察

結腸黏膜上皮結構正常，多量黏液分泌(圖4，圖5)；固有層水腫，細胞較正常減少，幾乎無法看到正常狀態(tài)所見中性粒細胞和淋巴細胞，淋巴管擴張，管腔內有很多黏液，腸腺大小正常、腺上皮較為完整(圖6)，但黏膜固有層內結締組織增生(圖7)。

圖2 患病大熊貓犬瘟熱病毒RT-PCR擴增Fig.2 Results of CDV PCR amplifications of 4 giant pandasM：DL500 DNA Marker；陰：陰性對照；陽：陽性對照；1～4：4只患病大熊貓糞便樣品M：DL500 DNA Marker；neg：negative control；pos：positive control；1-4：fecal samples for 4 giant pandas

圖3 患病大熊貓細小病毒PCR擴增Fig.3 Results of parvovirus PCR amplifications of 4 giant pandasM：DL500 DNA Marker；陰：陰性對照；陽：陽性對照；1～4：4只患病大熊貓糞便樣品M：DL500 DNA Marker；neg：negative control；pos：positive control；1-4：fecal samples for 4 giant pandas

圖4 結腸黏膜上皮結構正常，多量黏液分泌 HE X 400Fig.4 The colonic mucosa epithelia seems intact and a lot of mucus secretion，HE x 400

圖5 結腸黏膜上皮結構正常，多量黏液分泌固有層炎癥細胞減少HE X 400Fig.5 The colonic mucosa epithelia seems intact and a lot of mucus secretion；the lamina propria has not enough inflammatory cells，HE x 400

圖6 結腸固有層淋巴管擴張，淋巴管內多量黏液，腸腺大小正常，腺上皮完整，炎癥細胞減少HE x 200Fig.6 The colonic lamina propria lymphatics were dilated, and there was a lot of mucus in the lumen;the glands seem to be of normal diameter and the epithelium seems intact，and not enough inflammatory cells in lamina propria，HE x 200

圖7 結腸固有膜結締組織增生 HE x 200Fig.7 A lot of connective tissue showed in the colonic lamina propria，HE x 200

3 病因學分析

3.1 寄生蟲學

寄生蟲檢查結果表明，患病動物所出現(xiàn)嗜酸性粒細胞血癥與寄生蟲感染無明顯相關性。

3.2 細菌學檢查

除1#和2#大熊貓試驗期間因急性紅色黏液便和血尿癥時分離出1株致病性克雷伯氏桿菌外，未檢出其他細菌性病原。這一結果表明，患病動物免疫力低下，容易發(fā)生條件致病菌感染。

3.3 病毒學檢查

病毒PCR擴增檢查結果顯示，大熊貓慢性營養(yǎng)不良綜合征與犬瘟熱病毒和細小病毒無相關性。

3.4 病理組織學

患病動物結腸黏膜病理組織學結果提示：動物極可能受到某種不利因素的長期影響，致結腸黏膜固有層炎性細胞明顯減少，而無法抵抗外來病原入侵，作為一種代償性機制反應，結腸黏膜淋巴管大量黏液的出現(xiàn)是為快速沖刷外來入侵病原，最后導致結腸黏膜固有層大量結締組織堆積。

4 討論

4.1 大熊貓慢性營養(yǎng)不良綜合征病因學研究現(xiàn)狀

早在1982年，倫敦動物園曾報道過1只慢性營養(yǎng)不良綜合征雌性成年大熊貓的臨床表現(xiàn)與治療措施，并通過免疫學方法檢測發(fā)現(xiàn)該大熊貓個體的發(fā)病與食物中的卵清蛋白(Albumin)高度相關，最后通過取消食物中的雞蛋成分，該患病大熊貓的健康得到明顯改善[14-15]。張金國等報道，2只患慢性營養(yǎng)不良綜合征的亞成年大熊貓血液中三碘甲狀腺原氨酸(T3)明顯低于同齡健康大熊貓，并采用口服甲狀腺激素治療后取得了一定的治療效果，認為大熊貓的慢性營養(yǎng)不良綜合征病與低T3綜合征相關[3]。余建秋等對9只患該病的大熊貓通過包括病原學、血液學和毛發(fā)微量元素測定結果顯示，患病動物除表現(xiàn)為低蛋白血癥外，最明顯的表現(xiàn)為毛發(fā)中Cu、Zn、Mn等微量元素含量極顯著低于健康大熊貓，通過中西醫(yī)對癥治療取得了一定的效果[4]。張成林等通過對4只患病大熊貓的血液學資料、死亡個體病理組織學和臨床表現(xiàn)等綜合分析后認為，消化吸收障礙是引起大熊貓發(fā)生營養(yǎng)不良綜合征的發(fā)病原因[7]。因此，雖然國內外專家從不同領域對該病的發(fā)病原因進行了探索與研究，但至今也未明確該病的發(fā)病原因并找到有效的防治措施。

4.2 大熊貓慢性營養(yǎng)不良綜合征與日糧中動物源性蛋白質的相關性

本研究通過對4只患病個體連續(xù)1 a的血液學、細菌學、病毒學和寄生蟲學檢查結果表明，患病大熊貓除表現(xiàn)為典型的嗜酸性粒細胞血癥外，并未發(fā)現(xiàn)其他可疑的細菌性病原、病毒性病原和寄生蟲病原。在排除寄生蟲感染的前提下，患病動物長期處于高嗜酸性粒細胞血癥已經提示動物極可能受到過敏原刺激處于過敏狀態(tài)。盡管圈養(yǎng)大熊貓的排黏被認為是一種正常的生理性反應，但野外大熊貓生態(tài)學調查至今都未見有排黏報道[16]，而患慢性營養(yǎng)不良綜合征大熊貓高頻率的排黏反應也間接說明對圈養(yǎng)條件下的飼養(yǎng)管理存在某種程度的不適。大熊貓消化系統(tǒng)從解剖結構上看屬于食肉動物，但由于長期的進化和演變，該物種的食性特點已經演化成以竹子為主食的草食性動物[17]。野外研究證明，大熊貓野生幼獸在1.5歲前主要食物是母乳和竹子，1.5歲后開始離開母獸進行獨立生活則完全以竹子為主食[18]。但在圈養(yǎng)條件下，因為擔心大熊貓所攝取的營養(yǎng)不足通常都給圈養(yǎng)大熊貓?zhí)砑痈缓瑒游镌葱缘牡鞍踪|(如雞蛋、牛奶或牛肉)的窩頭，且這種飼養(yǎng)管理模式一直貫穿圈養(yǎng)大熊貓的一生，這顯然與野生大熊貓的食性特點相背離。而患病動物結腸黏膜病理組織學檢查結果顯示：動物極可能受到了某種不明因素的長期影響，導致結腸黏膜固有層炎性細胞出現(xiàn)明顯減少而無法抵抗外來病原入侵，作為一種代償性機制反應，動物結腸黏膜淋巴管大量黏液的出現(xiàn)是為快速沖刷外來入侵病原，最后導致結腸黏膜固有層大量結締組織堆積。根據病理組織學觀察結果、血液嗜酸性粒細胞血癥特點并結合野生大熊貓的食性，推斷圈養(yǎng)大熊貓慢性營養(yǎng)不良綜合征的發(fā)病原因極可能與日糧中動物源性蛋白直接相關。這一推斷與倫敦動物園通過免疫學方法檢測的結果高度吻合[14]。成都大熊貓繁育研究基地根據這一原理，通過取消傳統(tǒng)大熊貓日糧中動物源性蛋白質并給予脫敏治療，先后成功治療了成都大熊貓種群中8只患病個體，治愈率達到100%(另文報道)，取得了極顯著的臨床效果，也間接證明了這一推斷。

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Giant panda(Ailuropodamelanoleuca)；

Etiology of the Stunted Development Syndrome of Giant Panda

Wang Chengdong1Carlos Sanchez2Luo Li1Lan Jingchao1Li Mingxi1Huang Xiangming1Yang Zhi1Liu Li1Huang Wenjun1Wu Kongju1Yang Guangyou3Yan Qigui3

We sampled blood，feces and colonic mucousa from four giant pandas(Ailuropodamelanoleuca)sufferring from stunted development syndrome(or chronic malnutrition)for etiological research.We analyzed hematology，bacteriology，virology，parasitology and histological pathology to discover the pathogenesis.We documented eosinophilia in all four individuals.No pathogenic evidence related to bacteria，canine distemper virus，parvovirus，or parasites.Histopathology of the colonic mucusa revealed fewer neutrophils and lymphocytes in the lamina propria than expected.The lymphatics were dilated superficially，indicating edema，and there was abundant mucus in the lumen.The glands were of normal diameters and the epithelia were intact.There was a lotof connective tissue in the lamina propria.We concluded that the reason for stunted development syndrome of giant panda was related to the animal-origin protein from concentrated food combined with the giant panda diet in the wild.

稿件運行過程

2016-04-28

修回日期：2016-05-31

發(fā)表日期：2016-11-10

慢性營養(yǎng)不良；

病因學

The stunted development syndrome；

Etiology

S858.9

A

2310-1490(2016)04-301-06

采集4只患慢性營養(yǎng)不良綜合征大熊貓的血液、糞便和結腸黏膜分別開展包括血液學、細菌學、病毒學、寄生蟲學和病理組織學領域的檢測，旨在找到大熊貓慢性營養(yǎng)不良綜合征的發(fā)病原因。研究結果顯示：(1)明顯的嗜酸性粒細胞血癥(4/4)；(2)未檢出相關致病性病原；(3)結腸黏膜病理組織學檢查：黏膜固有層幾乎無法看到正常狀態(tài)所見中性粒細胞和淋巴細胞，淋巴管明顯增大且淋巴管內有很多黏液，黏膜上皮完整、腸腺大小未見改變，黏膜固有層大量結締組織增生。據血液學、病原學和結腸黏膜病理組織學檢查結果，并結合野生大熊貓食性特點和圈養(yǎng)大熊貓人工精飼料的配方組成，推斷大熊貓慢性營養(yǎng)不良綜合征與人工精飼料中的動物性蛋白質密切相關。

成都大熊貓繁育研究基金會資助(編號：CPF08011)

王成東，男，51歲，研究員；主要從事大熊貓獸醫(yī)學研究。E-mail：wcdsyy@sina.com