GPC結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定韭菜中50種農(nóng)藥殘留

徐 晶張海霞蒲國鋒楊 靜

（1.哈爾濱市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心 黑龍江·哈爾濱 150070）（2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆所 黑龍江·哈爾濱 150000）

■試驗(yàn)報(bào)告■

GPC結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定韭菜中50種農(nóng)藥殘留

徐 晶1張海霞1蒲國鋒2楊 靜1

（1.哈爾濱市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心 黑龍江·哈爾濱 150070）（2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆所 黑龍江·哈爾濱 150000）

利用GPC結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測韭菜中50種農(nóng)藥殘留。樣品用1%乙酸乙腈震蕩提取，經(jīng)凝膠色譜凈化，收集9～21min的流出液，在線濃縮近干并用乙腈∶水（1∶3）溶解定容至2m1，收集于2m1樣品瓶中，過0.22μm濾膜，以Waters BEH C18色譜柱分離，采用多反應(yīng)檢測模式進(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量。加標(biāo)水平為0.05mg/kg和0.1mg/kg時(shí)，回收率在65.2%～102.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%。農(nóng)藥在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.99。方法具有提取效率高，凈化效果好，準(zhǔn)確度高、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，適用于韭菜中多農(nóng)藥殘留檢測。

韭菜；凝膠滲透色譜；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；農(nóng)藥殘留檢測

韭菜是最常見的綠葉蔬菜之一，其高水分，低熱量，富含維生素、粗纖維及硫化物，不但具有很好的營養(yǎng)價(jià)值，還具有一定的藥用價(jià)值，在我國的栽培區(qū)域極廣。但由于韭菜在種植過程中違規(guī)使用高毒農(nóng)藥、不遵守農(nóng)藥安全間隔期等原因，使韭菜中農(nóng)藥殘留問題較大，消費(fèi)者因?yàn)槭秤脷埩艮r(nóng)藥的韭菜引發(fā)食物中毒的事件頻頻發(fā)生［1］。

韭菜的基質(zhì)十分復(fù)雜，在其農(nóng)藥殘留檢測過程中，傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)不易實(shí)現(xiàn)基質(zhì)成分的有效凈化，導(dǎo)致在目標(biāo)殘留化合物的檢測分析時(shí)產(chǎn)生嚴(yán)重的基質(zhì)干擾現(xiàn)象，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。陳建航等［2］采用微波加熱處理，使酶鈍化減少打擾，檢測姜、韭菜中的農(nóng)藥殘留，但在加熱過程中會(huì)使熱不穩(wěn)定的農(nóng)藥降解。應(yīng)興華［3］等用乙腈提取后，直接用氣相色譜檢測韭菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥，提取后不凈化，會(huì)污染色譜柱及檢測器，并且雜質(zhì)干擾較多，易產(chǎn)生假陽性。徐宜宏［4］等采用QuEchERS方檢測了韭菜中的34中農(nóng)藥殘留，C18、PSA能去除糖等雜質(zhì)，但去除色素的效果不好，石墨化碳黑能去除色素，但對具有平面結(jié)構(gòu)的化合物如等農(nóng)藥有吸附。

凝膠滲透色譜能很好的去除基質(zhì)中潛在的干擾目標(biāo)化合物分析的油脂、色素、生物堿等大分子化合物，并已經(jīng)在農(nóng)藥殘留中得到了廣泛的應(yīng)用［5］。歐盟標(biāo)委會(huì)技術(shù)委員會(huì)的農(nóng)藥殘留測定標(biāo)準(zhǔn)（TC275）和日本厚生勞動(dòng)省的農(nóng)藥殘留分析都采用了GPC法［6-7］。本方法通過在線凝膠滲透色譜對樣品凈化，液相色譜-串

徐晶，女，職稱：高級農(nóng)藝師。 Emai1：xj_hrb@126.com聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，檢測韭菜中的農(nóng)藥殘留。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

供試樣品韭菜，購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀Waters Acquity UPLC–TQD（美國Waters公司），配有電噴霧離子源；凝膠滲透色譜儀FREE STYLE GPC+EVA（德國Lctech）；Milli-Q高純水發(fā)生器（美國Millipore公司）；往復(fù)式震蕩器（IKA）；高速離心機(jī)（Sigma）；渦旋振蕩器（IKA）；氮吹儀（美國Organomation）；電子天平（感量0.01g）；乙腈、乙酸、氯化鈉、醋酸鈉、無水硫酸鎂優(yōu)級純（科密歐）；乙腈、甲醇色譜純（美國Fisher公司）；環(huán)己烷、乙酸乙酯色譜純（科密歐）；供試農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100ug/mL，購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的提取

稱取粉碎的樣品15g（精確到0.01g）置于50mL離心管中，依次加入15mL1%的乙酸乙睛，1.5g醋酸鈉，6g無水硫酸鎂，2顆玻璃珠，渦混1～2min，往復(fù)式振蕩器上震蕩30min后，5000r/min離心10min，取2.4mL乙腈層，氮吹至小于1.0mL后用環(huán)己烷：乙酸乙酯（1∶1）定容至6mL，供凝膠色譜凈化。

1.2.2 凝膠色譜凈化

凝膠色譜柱填料為Bio-Beads S-X，玻璃柱（300mm×20mm），體積比為1∶1的乙酸乙酯-環(huán)己烷溶液作為流動(dòng)相，流速為4.5mL/ min，進(jìn)樣量5mL，前棄9min，收集9～21min樣品，后棄5min，收集液在線旋蒸近干并用乙腈∶水（1∶3）溶解定容至2mL，收集于2mL樣品瓶，過0.22μm濾膜，供液用質(zhì)聯(lián)儀分析檢測。

1.3 儀器條件

1.3.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：WatersACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7μm，2.1x100 mm ）；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：5μL；流速：0.3mL/min；流動(dòng)相1∶A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相2∶A為甲醇，B為5mmol乙酸銨，洗脫程序（見表1）。

表1 兩種不同流動(dòng)相洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI）；源溫度：110℃；毛細(xì)管電壓：0.5kV；脫溶劑溫度：400℃；脫溶劑氣流速（N2）：800L/h；錐孔氣速：50L/h。采用MRM多反應(yīng)檢測模式。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法

王連珠等［8］在蔬菜QuEChERS提取方法中對比了了加緩沖鹽和不加緩沖鹽兩種提取方法對66種有機(jī)磷農(nóng)藥的提取效果，結(jié)果表明加緩沖鹽的提取效果好，尤其是對pH敏感的有機(jī)磷類農(nóng)藥的提取效率高。本試驗(yàn)提取過程中在提取液1%的乙酸乙睛中加醋酸鈉緩沖鹽以保證對pH敏感的農(nóng)藥提取率。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，先加入無水硫酸鎂會(huì)產(chǎn)生結(jié)塊，把農(nóng)藥包裹在結(jié)塊里，不利于農(nóng)藥的提取，應(yīng)在提取液中先加乙酸鈉搖勻后再加無水硫酸鎂，防止產(chǎn)生結(jié)塊。

2.2 GPC方法的優(yōu)化

韭菜中的硫化物和葉綠素含量高，本試驗(yàn)采用GPC凈化的方式去除這些雜質(zhì)。這50種農(nóng)藥的分子量在141～434之間，差距較大，需要通過試驗(yàn)來優(yōu)化GPC的收集時(shí)間。用環(huán)己烷∶乙酸乙酯（1∶1）配濃度為1.5μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)樣體積為5mL，從第6min開始，每兩分鐘接收一瓶，共接收10瓶，氮吹至干，流動(dòng)相溶解，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。檢測結(jié)果表明，這50種農(nóng)藥的流出時(shí)間主要集中在9～21min，但在9min時(shí)收集流出液還有少量色素的殘留，收集液呈透明淺黃色，若收集時(shí)間在10～21min時(shí)，葉綠素能去除干凈，但這樣小分子量的農(nóng)藥如甲胺磷的回收率會(huì)降低。所以本試驗(yàn)選擇收集9～21min的流出液，收集液在線旋蒸并用乙腈∶水（1∶3）溶解定容至2mL，收集于進(jìn)樣瓶中。

2.3 液相方法的優(yōu)化

試驗(yàn)進(jìn)樣0.1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品，對甲醇-5mmol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸體系的流動(dòng)相和不同梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，不同的農(nóng)藥在這兩種流動(dòng)相體系中的電離情況不同，儀器響應(yīng)值不同，選出6種在兩個(gè)體系中電離差異大的農(nóng)藥進(jìn)行對比，見圖1。根據(jù)不同農(nóng)藥的具體電離情況及出峰時(shí)間把這50種標(biāo)品分為兩組，具體見表2；圖2，圖3為這兩組標(biāo)品的總離子流圖。

圖1 6種不同種類相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在兩種流動(dòng)相體系中的響應(yīng)值

圖2 第一組混合標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖

圖3 第二組混合標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖

2.4 質(zhì)譜方法的優(yōu)化

以流動(dòng)注射方式，對50種農(nóng)藥的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，再對其子離子全掃描，每個(gè)化合物選擇2對響應(yīng)值高的特征離子對作為定量及定性離子對進(jìn)行MRM參數(shù)優(yōu)化，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)（見表2）。

表250 種農(nóng)藥標(biāo)品多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）的質(zhì)譜參數(shù)

2.5 方法的線性、回收率和精密度

為了消除基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果造成的影響，以不含待測物的空白樣品為基質(zhì)液，配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為10、20、50、100、150、200、300、400、500μg/kg，進(jìn)行方法線性的測定。以待檢參數(shù)的的面積為（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 50種農(nóng)藥的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.6 方法的回收率、精密度及定量限

在樣品中添加50、100μg/kg=2個(gè)水平的標(biāo)品，每個(gè)水平重復(fù)6次，按照1.2的試驗(yàn)方法進(jìn)行處理，計(jì)算法的回收率和精密度。該法在這兩個(gè)添加水平上的回收率范圍在65.2%～102.1%，方法精密度的范圍在0.9%～8.7%之間，具體數(shù)值見表4。以S/N=10為定量限，不同農(nóng)藥的定量限范圍為0.8～15μg/kg，完全可以滿足韭菜中農(nóng)藥殘留檢測的需要。

表4 方法的添加回收率和精密度（n=6）

3 結(jié)論

液質(zhì)質(zhì)的MRM多反應(yīng)監(jiān)測對于分析復(fù)雜基質(zhì)的抗干擾能力強(qiáng)，但樣品前處理不干凈，會(huì)嚴(yán)重的污染液相色譜柱和質(zhì)譜檢測器，并會(huì)增大基質(zhì)效應(yīng)，影響檢測結(jié)果。凝膠滲透系統(tǒng)根據(jù)化合物的流出時(shí)間不同，能夠很好的祛除韭菜中的葉綠素等大分子雜質(zhì)，降低基質(zhì)干擾，提高檢測的準(zhǔn)確度。并且GPC系統(tǒng)能自動(dòng)的完成凈化、濃縮、復(fù)溶等過程，減少人力，提高了工作效率。每個(gè)化合物性質(zhì)不同，在不同溶液中的帶電能力不同，把待測農(nóng)藥分成兩組，用不同的流動(dòng)相進(jìn)行分析，提高了方法的檢出限。該方法能滿足韭菜中農(nóng)藥殘留的檢測。

［1］王文嬌，張濤，等.韭菜農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀及防控技術(shù).山東農(nóng)藥科學(xué)，2011，10：82-84.

［2］陳建航，葉瑜霏，等.分散固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測蔥、韭菜和姜中多種農(nóng)藥殘留.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2011，6：341-348.

［3］應(yīng)興華，徐霞，等.毛細(xì)管氣相色譜法測定韭菜中13種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的研究.分析測試學(xué)報(bào)，2009，10：1185-1188.

［4］徐宜宏，蔣施，等.韭菜中34種農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法.農(nóng)藥，2012，11：825-828.

［5］LIUL B，HASHI Y，QIN Y P.Development of automated online gel permeation chromatographygas chromatograph mass spectrometry for measuring multiresidual pesticides in agricultural products［J］.Journal of Chromatography B，2007，845（1）：61-68.

［6］SCHENZLER C，THEIR H P.European standardization of methods for pesticide residue analysis in foods-current status［J］.Food Additives and Contaminants，2001，1（10）：875-879.

［7］Director Notice of Ministry of Health，Labour and Welfare，Japan. Analytical methods for residual compositional substances of agricultural chemicals，feed additives.andveterinarydrugsinfood［S］.Syoku-AnNo.0124001，2005，F(xiàn)inalamendmentsweremadeonMay26，2006.

［8］王連珠，周昱，陳泳.QuEChERS樣品前處理-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中66種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量方法評估［J］.色譜2012，30（2）：146-153.

Determination of 50 Pesticide Residues in Leafy Greens by QuEChERS-GPC-UPLC-MS/MS

Xujing Zhanghaixia Puguofeng Yangjing
（Harbin Examing and Inspection Center for Agricultural Products Safety and Quality，Harbin 150070，China）（Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin，150000，China）

This paper describes using the method of GPC combined with ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）to detect 50 kinds of pesticide residues in Chinese chives.The samples were extracted with 1%acid acetonitrile，and purified by gel.And then collect 9～21min the outflow；concentrate the outflow to dry and keep the residue；use acetonitrile∶water（1∶3）to dissolve the residue in a constant volume to 2ml；filter the liquid by 0.22μm membrane into a sample bottle.Separate the sample with the Waters BEH C18 chromatographic column.Then the multiple reaction detection mode was used for the detection，and the external standard method was used for quantification.The recovery rate was between 65.2%～102.1，when the spiked levels are 0.05mg/kg and 0.1mg/kg，with RSD less than 20%.The correlation coefficient of pesticide in the linear range was more than 0.99.The method has the advantages of high extraction efficiency，good purification effect，high accuracy，and high sensitive and so on.It is suitable for the detection of pesticide residues in Chinese chives.

Chinese chives；gel permeation chromatography；ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry；pesticide residue detection

10.16627 /j.cnki.cn22-1215/s.2016.10.018