酪氨酸酶抑制法與斑馬魚評(píng)價(jià)模型的比較研究

陳健敏，余曉靜，黃梅萍，黃玉鳳

(莆田學(xué)院 藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建 莆田 351100)

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酪氨酸酶抑制法與斑馬魚評(píng)價(jià)模型的比較研究

陳健敏，余曉靜，黃梅萍，黃玉鳳

(莆田學(xué)院 藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建 莆田 351100)

傳統(tǒng)的酪氨酸酶抑制法與新型的斑馬魚評(píng)價(jià)模型之間是否存在優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，斑馬魚模型是否具有廣泛適用性，這兩個(gè)問題對(duì)美白劑評(píng)價(jià)方法的發(fā)展具有較大的意義.采用酪氨酸酶抑制法和斑馬魚評(píng)價(jià)模型同時(shí)評(píng)價(jià)常用美白劑包括曲酸、熊果苷、抗壞血酸、光甘草定和氫醌的美白作用.結(jié)果證明，用這兩種方法評(píng)價(jià)曲酸和熊果苷都呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，說明兩種方法具有一致性；但是，抗壞血酸和光甘草定在酪氨酸酶活性抑制法中顯示出抑制作用，但對(duì)斑馬魚色素的形成并沒有明顯的抑制，這又說明兩種方法具有矛盾性.酪氨酸酶抑制法能夠闡述美白作用的機(jī)制包括單酚酶抑制和雙酚酶抑制，而斑馬魚評(píng)價(jià)模型卻能夠評(píng)價(jià)美白劑的安全性包括致畸率和死亡率.總之，兩種評(píng)價(jià)方法各具優(yōu)缺點(diǎn)，兩種方法的聯(lián)合應(yīng)用能夠在美白劑的評(píng)價(jià)上實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ).

酪氨酸酶；抑制作用；美白劑；斑馬魚

目前美白劑功效的評(píng)價(jià)方法主要包括酪氨酸酶抑制法、細(xì)胞生物學(xué)法、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法和人體試驗(yàn)法.酪氨酸酶是黑色素合成途徑中的限速酶，它主要通過影響酪氨酸轉(zhuǎn)化成多巴，以及多巴氧化為多巴醌來影響黑色素的生成[1].酪氨酸酶抑制法通常就是用于測(cè)定美白劑對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率,且測(cè)定時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便，所需費(fèi)用低,適用于對(duì)美白劑進(jìn)行大通量篩選[2].該法雖然簡(jiǎn)單快捷，但不能反映美白劑能否到達(dá)有效作用位點(diǎn)，也無法反映美白劑的其他作用機(jī)制，所以存在一定的局限性.在篩選和評(píng)價(jià)備選化合物美白活性階段，需要大量的實(shí)驗(yàn)，用哺乳動(dòng)物模型或人體試驗(yàn)雖然能夠得到較為可靠的數(shù)據(jù)，但費(fèi)用高昂且周期較長(zhǎng)[3].為此，迫切需要開發(fā)新的方法，以達(dá)到簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)并準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)美白劑功效的目的.

斑馬魚是一種小型熱帶魚,由于具有易飼養(yǎng)、生長(zhǎng)發(fā)育快、給藥簡(jiǎn)單、繁殖能力強(qiáng)、易于活體觀察等優(yōu)點(diǎn)，并與人類基因相似度高達(dá)87%，許多器官和系統(tǒng)的早期發(fā)育與人類極為相似，已成為研究人類相關(guān)疾病的重要模式生物之一[4-6].斑馬魚身體表面的色斑特征是由3種色素細(xì)胞產(chǎn)生，在受精卵發(fā)育24 h左右就可看見皮膚色素的斑點(diǎn)[7-8].鑒于斑馬魚色素形成過程較快速、小分子滲透性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，Choi等[10]于2007年首次提出利用斑馬魚作為美白劑的評(píng)價(jià)模型[9].利用斑馬魚作為評(píng)價(jià)模型已經(jīng)發(fā)現(xiàn)熊果苷、熊果苷的衍生物[11]、連翹環(huán)己醇酮[12]、覆盆子酮[13]和苯乙酮衍生物[14]等均能夠抑制斑馬魚色素的形成，可以作為潛在的美白劑.

然而，斑馬魚評(píng)價(jià)模型是否能夠完全取代酪氨酸酶抑制法，是否也存在著一定的局限性，這些問題的解決對(duì)美白劑評(píng)價(jià)方法的發(fā)展具有重要意義.為此，筆者選取了常用的美白劑，包括曲酸、熊果苷、抗壞血酸、光甘草定和氫醌，同時(shí)采用酪氨酸酶抑制法和斑馬魚評(píng)價(jià)模型對(duì)其美白功效進(jìn)行評(píng)價(jià)，擬找出兩種方法各自的優(yōu)勢(shì)和不足，為美白劑評(píng)價(jià)方法的發(fā)展提供一定的數(shù)據(jù)支持.

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

試劑：抗壞血酸購(gòu)于Sigma-Aldrich 公司；光甘草定(純度為98.5%)購(gòu)于成都普思生物科技有限公司；酪氨酸酶(來源于蘑菇，比活力為500 U·mg-1)，左旋多巴、酪氨酸、氫醌、α-熊果苷和曲酸均購(gòu)自上海晶純生化科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)中的其他試劑均為分析純.

儀器：UV2550 紫外可見分光光度計(jì)，日本島津； PHS-3C 型酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司； SK2500TSH體視顯微鏡，深圳賽克數(shù)碼科技開發(fā)有限公司.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)用成年斑馬魚( 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所，武漢) 飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖系統(tǒng)中，飼養(yǎng)條件為：28.5 ℃恒溫，人工控制光/暗周期為：14/10 h.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

酪氨酸酶用0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH=6.8)配制，單酚酶活性測(cè)試時(shí)濃度為1 000 U·mg-1，雙酚酶活性測(cè)試時(shí)濃度為400 U·mg-1.酪氨酸酶抑制法中：水溶性美白劑用蒸餾水作為溶劑，而油溶性美白劑用二甲亞砜(DMSO)作為溶劑，現(xiàn)配現(xiàn)用.胚胎培養(yǎng)液：母液A(鹽水)：4 g海鹽，加蒸餾水于100 mL容量瓶定容；母液B(亞甲基藍(lán))：0.1 g亞甲基藍(lán)，加蒸餾水于100 mL容量瓶定容；取150 μL母液A,加25 μL母液B，加蒸餾水于100 mL容量瓶定容，即得胚胎培養(yǎng)液.斑馬魚評(píng)價(jià)模型中：水溶性美白劑用胚胎培養(yǎng)液作為溶劑，而油溶性美白劑用含1% DMSO的胚胎培養(yǎng)液作為溶劑，現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.2.2 酪氨酸酶抑制法

[15]的方法并做修改.測(cè)定雙酚酶活性時(shí)以0.5 mmol·L-1多巴為底物，測(cè)定酪氨酸酶單酚酶活性時(shí)以0.5 mmol·L-1的酪氨酸作為底物，均用0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH=6.8)配制.取試管A1、A2、A3，分別加入2.8 mL底物溶液，28 ℃預(yù)熱10 min后，A2和A3加入100 μL美白劑溶液，A1加入等體積蒸餾水或DMSO.混勻后，A1、A2加入100 μL酪氨酸酶溶液，A3加入100 μL磷酸緩沖溶液，搖勻，反應(yīng)10 min時(shí)測(cè)定A475，平行測(cè)定3次.根據(jù)公式：酶活性(%)=[(A2-A3)/A1]×100% 計(jì)算出相應(yīng)抑制劑下的酶活性.(A1：底物，酪氨酸酶在樣品溶劑存在下反應(yīng)10 min的吸光度值；A2:底物，酪氨酸酶在抑制劑存在下反應(yīng)10 min的吸光度值；A3：底物，抑制劑反應(yīng)10 min的吸光度值).對(duì)于單酚酶活性測(cè)試，美白劑若具有雙酚酶活性，僅用上述方法不能測(cè)定單酚酶抑制作用.只能采用以下方法，美白劑(不同濃度)與酪氨酸酶分別加入預(yù)熱10 min的酪氨酸溶液中，隨著時(shí)間變化記錄吸光度值的變化，前2 min內(nèi)每0.5 min記錄1次，之后1 min記錄1次，直至30 min，然后繪制以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)的關(guān)系圖，從圖中得到酶反應(yīng)的遲滯時(shí)間和曲線斜率的變化，從而判斷美白劑是否具有單酚酶抑制作用.

1.2.3 斑馬魚評(píng)價(jià)方法

斑馬魚的繁殖參照文獻(xiàn)[16]的方法.取卵前一日，雌雄魚分開，第2天光照開始前將雌雄魚( 1∶2) 并池，約1 h后，開始收集胚胎.將收集的胚胎充分清洗后，挑選發(fā)育正常的胚胎，加入胚胎培養(yǎng)液，于28.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 h.用塑料吸管把胚胎收集到24孔板上，每孔加入1 mL美白劑溶液、10個(gè)胚胎.以胚胎培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，以0.25 mmol·L-1的苯硫脲溶液作為陽性對(duì)照，培養(yǎng)24 h后更換相應(yīng)的溶液.繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在體視顯微鏡下觀察斑馬魚幼魚體表色素的形成情況，是否畸形，并統(tǒng)計(jì)死亡率，從而判斷美白劑的美白功效和毒性.

2 結(jié)果與討論

2.1 美白劑對(duì)酪氨酸酶雙酚酶活性的影響

由于氫醌本身是酪氨酸酶的底物，其氧化產(chǎn)物在475 nm處也有吸收，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，無法利用酪氨酸酶抑制法進(jìn)行評(píng)價(jià)，此處測(cè)定曲酸、熊果苷、抗壞血酸和光甘草定4種美白劑在不同濃度下對(duì)酪氨酸酶雙酚酶活性的影響.以美白劑濃度作為橫坐標(biāo)，酪氨酸酶的相對(duì)活性作為縱坐標(biāo)，繪制圖1.

圖1 美白劑對(duì)酪氨酸酶雙酚酶活性的影響Fig.1 Effects of whitening agents on diphenolase activity of tyrosinase

從圖1a可以看出熊果苷對(duì)酪氨酸酶的雙酚酶活性沒有抑制作用，反而有激活作用，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[17].曲酸和抗壞血酸對(duì)酪氨酸酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，而且抑制程度與濃度呈正相關(guān)，從圖1a中計(jì)算出導(dǎo)致酶活力下降一半所需的抑制劑曲酸和抗壞血酸的濃度(IC50)分別為75.74,111.47 μmol·L-1.從圖1b可以看出光甘草定在低濃度下就對(duì)酪氨酸酶雙酚酶活性表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，IC50為0.43 μmol·L-1，抑制作用是曲酸的176倍.結(jié)果表明，利用酪氨酸酶雙酚酶抑制試驗(yàn)可以評(píng)價(jià)曲酸、抗壞血酸和光甘草定的美白功效，并能夠通過IC50進(jìn)行定量比較.

2.2 美白劑對(duì)酪氨酸酶單酚酶活性的影響

從圖1a可以看出熊果苷對(duì)于酪氨酸酶雙酚酶活性沒有抑制作用，但是熊果苷是高級(jí)化妝品中常用的美白劑，臨床上顯示出美白作用[18]，因此考察其對(duì)酪氨酸酶單酚酶活性的影響，結(jié)果如圖2a所示.對(duì)于曲酸和光甘草定來說，由于二者本身就有雙酚酶抑制能力，就不能簡(jiǎn)單地利用酪氨酸作為底物，若通過吸光度值A(chǔ)475的高低來判斷抑制率，結(jié)果會(huì)受到雙酚酶抑制的影響.在這種情況下，通常是利用反應(yīng)時(shí)間與吸光度值關(guān)系圖中的遲滯時(shí)間是否增加和曲線斜率是否變化來判斷是否具有單酚酶活性[19].繪制在不同濃度的曲酸和光甘草定下，時(shí)間與吸光度的變化關(guān)系圖，結(jié)果如圖2a～b所示.氫醌本身是酪氨酸酶的底物，抗壞血酸的機(jī)制已基本明確，此處不再探討.

圖2a所示結(jié)果證明熊果苷具有較強(qiáng)的單酚酶抑制作用.從圖2b可以看出，曲酸濃度范圍從0增加到41.33 μmol·L-1，酶反應(yīng)的遲滯時(shí)間從1.44 min逐漸增加到10.03 min，說明曲酸具有單酚酶活性抑制作用.而圖2c則表明，光甘草定濃度范圍從0增加到0.325 μmol·L-1，酶反應(yīng)的遲滯時(shí)間保持在1.47 min左右，說明光甘草定并不影響反應(yīng)的遲滯時(shí)間，但具有單酚酶活性抑制作用.

圖2 美白劑對(duì)酪氨酸酶單酚酶活性的影響Fig.2 Effects of whitening agents on monophenolase activity of tyrosinase

2.3 美白劑對(duì)斑馬魚色素形成及存活率的影響

美白劑對(duì)斑馬魚色素形成的影響結(jié)果如圖3所示.

圖3 美白劑對(duì)斑馬魚色素形成的影響Fig.3 Effects of whitening agents on the pigmentation of zebrafish embryo

從圖3可以明顯看出，陰性對(duì)照，即用胚胎培養(yǎng)液或含1% DMSO的胚胎培養(yǎng)液，培養(yǎng)的斑馬魚幼魚體表有明顯的色素斑點(diǎn)，而且體態(tài)正常，無畸變.陽性對(duì)照，即加入0.25 mmol·L-1苯硫脲，培養(yǎng)的斑馬魚幼魚體表沒有色素斑點(diǎn)，體態(tài)正常.以上結(jié)果說明斑馬魚評(píng)價(jià)模型建立成功.熊果苷和曲酸從左至右，濃度分別為0.010，0.10，1.0，20，50 mmol·L-1與0.10，1.0，5.0，20，50 mmol·L-1，可以發(fā)現(xiàn)隨著美白劑濃度的增大，斑馬魚體表的色素逐漸減少，而且濃度較高時(shí)，發(fā)現(xiàn)斑馬魚發(fā)生畸變.從圖3中可以直觀地看出，熊果苷相對(duì)于曲酸來說，對(duì)斑馬魚色素具有更強(qiáng)的抑制作用.抗壞血酸從左至右濃度從0.020 mmol·L-1增大到1.0 mmol·L-1，光甘草定從0.013 mmol·L-1增大到0.20 mmol·L-1，但是觀察不到明顯的色素抑制作用，抗壞血酸的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20].對(duì)于光甘草定來說，還發(fā)現(xiàn)濃度較低時(shí)，仍然能使胚胎發(fā)生畸變.氫醌濃度從左至右分別為0.030，0.060，0.12，0.24，0.48 mmol·L-1，隨著濃度的增大，對(duì)斑馬魚色素抑制作用逐漸增強(qiáng).對(duì)比熊果苷的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，氫醌的濃度較低時(shí)就能夠起到抑制作用，說明美白作用更強(qiáng)，在0.48 mmol·L-1的濃度下就能致畸變，而熊果苷在5.0 mmol·L-1時(shí)，斑馬魚體態(tài)正常，說明氫醌致畸性強(qiáng).

斑馬魚體態(tài)是否畸變只是考察美白劑毒性的一個(gè)方面，另一個(gè)重要方面是考察斑馬魚胚胎的死亡率，可以進(jìn)一步比較美白劑的毒性大小，美白劑對(duì)斑馬魚胚胎死亡率的影響結(jié)果列于表1.

表1 美白劑對(duì)斑馬魚胚胎死亡率的影響

由表1的陰性對(duì)照可以看出，含有1% DMSO的培養(yǎng)液會(huì)對(duì)胚胎死亡率產(chǎn)生一定的影響.比較熊果苷和曲酸的死亡率，發(fā)現(xiàn)熊果苷的毒性更強(qiáng)，胚胎死亡數(shù)均高于相當(dāng)濃度的曲酸.低濃度有致畸作用的氫醌在不同濃度時(shí)引起的胚胎死亡率為0%，這說明低濃度氫醌雖然有較強(qiáng)的致畸作用，但是相對(duì)于熊果苷來說，死亡率更低.抗壞血酸在1.0 mmol·L-1時(shí)胚胎死亡率達(dá)到60%，而光甘草定在低濃度下就有較高的致死率，這可能與其溶劑(含1% DMSO)有關(guān).結(jié)果表明斑馬魚評(píng)價(jià)模型不僅能夠直觀地觀察到美白劑的美白作用，而且能夠?qū)γ腊讋┑陌踩赃M(jìn)行比較分析.

2.4 兩種美白劑評(píng)價(jià)方法的比較分析

酪氨酸酶抑制法能夠定量地測(cè)定IC50，從而比較不同美白劑的美白活性大小，而且能闡明美白劑是否是通過抑制酪氨酸酶活性而實(shí)現(xiàn)美白作用的，有利于研究美白劑作用的機(jī)制.比如研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)熊果苷對(duì)雙酚酶活性沒有抑制，而對(duì)單酚酶活性有抑制，說明熊果苷美白活性源自單酚酶抑制能力.它的缺點(diǎn)在于不能直觀地比較美白劑的活性，要看懂相關(guān)數(shù)據(jù)，需要一定的專業(yè)背景.斑馬魚評(píng)價(jià)模型的優(yōu)點(diǎn)之一在于能夠十分直觀地觀察美白劑是否對(duì)色素產(chǎn)生抑制，通過觀察美白劑對(duì)色素抑制的程度可以判斷美白劑的活性大小，比如從圖3就可以直接看出熊果苷等美白劑的美白作用，但是缺少定量依據(jù).另外，可以通過斑馬魚的畸變率和死亡率來比較美白劑的致畸性和毒性，評(píng)價(jià)美白劑的安全性.兩種方法均操作簡(jiǎn)單，試驗(yàn)成本低，周期短，適合高通量篩選美白劑.

兩種方法之間是否存在優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也可窺見一斑.對(duì)于熊果苷和曲酸這兩種常用的美白劑，在酪氨酸酶抑制法中都表現(xiàn)出對(duì)酪氨酸酶有較強(qiáng)的抑制作用，而且都對(duì)斑馬魚色素產(chǎn)生抑制，這說明兩種方法具有一致性.但是，對(duì)于抗壞血酸和光甘草定來說，二者均具有抑制酪氨酸酶活性的作用，但是均不能抑制斑馬魚色素的生成，這說明這兩種方法又有矛盾的地方.而且抗壞血酸和光甘草定作為常用的美白劑，已經(jīng)在臨床上證明其具有美白作用[21]，因此斑馬魚模型具有一定的局限性.氫醌作為傳統(tǒng)的美白劑，能夠有效地抑制斑馬魚色素的生成，但是卻難以利用酪氨酸酶抑制法測(cè)定其抑制能力，因?yàn)槠涿复呋漠a(chǎn)物本身也具有顏色，會(huì)干擾測(cè)定，這說明了酪氨酸酶抑制法也具有一定的局限性.兩種評(píng)價(jià)方法均具有一定的優(yōu)點(diǎn)和不足，各自的優(yōu)點(diǎn)恰能彌補(bǔ)對(duì)方的不足，所以結(jié)合兩種方法來評(píng)價(jià)美白劑的功效和安全性具有巨大的優(yōu)勢(shì).

3 結(jié)束語

筆者采用兩種美白劑評(píng)價(jià)方法對(duì)常用的美白劑(曲酸、熊果苷、抗壞血酸、光甘草定和氫醌)進(jìn)行美白功效的評(píng)價(jià)，比較兩種方法的優(yōu)勢(shì)和不足.結(jié)果表明，酪氨酸酶抑制法簡(jiǎn)單方便、能提供定量的數(shù)據(jù)來判斷美白劑的作用，而且能夠闡述美白作用機(jī)制；斑馬魚模型能夠直觀地通過觀察得出美白功效，而且能夠?qū)γ腊讋┑陌踩赃M(jìn)行評(píng)價(jià).對(duì)于一部分的美白劑來說，兩種方法評(píng)價(jià)的結(jié)果是一致的，但是對(duì)于某些美白劑來說，評(píng)價(jià)的結(jié)果并不一致，說明兩種方法都具有一定的局限性.聯(lián)用兩種方法，使之形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，能夠更加客觀、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)美白劑的功效和安全性.

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(責(zé)任編輯 于 敏)

Comparative studies of enzymatic assays and zebrafish system for evaluating whitening agents

CHEN Jianmin,YU Xiaojing,HUANG Meiping,HUANG Yufeng

(College of Pharmaceutical and Medical Technology,Putian University,Putian 351100,China)

The relationship between novel zebrafish system and traditional enzymatic assays is still unknown,and the general applicability of the results obtained from zebrafish system is debatable.It is of great significance in working out these issues for development of methods for evaluating whitening agents.In this study,the authors tested commonly used whitening agents including kojic acid,arbutin,ascorbic acid,glabridin and hydroquinone using both enzymatic assays and zebrafish system.The results demonstrated that both kojic acid and arbutin presented positive reaction using the methods,which proved the methods had good agreement.However,inconsistent results were also observed in the methods.Ascorbic acid and glabridin both showed inhibitory effects in enzymatic assays,but no inhibitory effects on the pigmentation of zebrafish.Enzymatic assays could be used to explain the mechanism of whitening agents,while zebrafish system could provide the data of safety.In conclusion，each of these methods presented advantages and disadvantages,and it was suggested that combination of both methods would be complemental in superiority for evaluating whitening agents.

tyrosinase;inhibitory effects;whitening agents;zebrafish

10.3969/j.issn.1000-2162.2016.06.013

2016-01-18

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015J05167)；莆田市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014S02(1))；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(201411498013，201511498014)；福建省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(201511498052)

陳健敏(1985-),男，福建龍巖人，莆田學(xué)院講師，博士.

Q554.1

A

1000-2162(2016)06-0073-07