阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂保護(hù)酶系和解毒酶系的影響

賈變桃，洪珊珊，張雨超，曹永偉

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801)

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阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂保護(hù)酶系和解毒酶系的影響

賈變桃，洪珊珊，張雨超，曹永偉

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801)

為明確阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂保護(hù)酶系和解毒酶系的影響，采用試管藥膜法以阿維菌素亞致死濃度(LC10和LC25)處理半閉彎尾姬蜂成蟲，分別于處理后1、12、24和48 h測(cè)定其體內(nèi)保護(hù)酶和解毒酶活性變化。結(jié)果表明，阿維菌素亞致死濃度處理后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)寄生蜂體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)活性總體表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用；對(duì)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性表現(xiàn)為先抑制后誘導(dǎo)作用；對(duì)酯酶(EST)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和多功能氧化酶(MFO)具有顯著的抑制作用。研究結(jié)果為深入了解半閉彎尾姬蜂對(duì)阿維菌素的防御機(jī)理提供了一定的理論基礎(chǔ)。

阿維菌素；半閉彎尾姬蜂；保護(hù)酶；解毒酶

小菜蛾 Plutella xylostellaL.是一種重要的蔬菜害蟲，其幼蟲以十字花科蔬菜為食(牟芳等，2015)。在蔬菜生產(chǎn)中，小菜蛾的治理主要以化學(xué)防治為主，然而，由于殺蟲劑的大量使用，使小菜蛾對(duì)多種藥劑產(chǎn)生了抗藥性(Guoet al., 2013)，農(nóng)藥的有效性大大降低。半閉彎尾姬蜂 Diadegma semiclausumHellen(Hym.Icheneumonidae) 是小菜蛾幼蟲期的一種主要寄生蜂。該蜂起源于歐洲，被許多國(guó)家和地區(qū)引進(jìn)用于小菜蛾的防治(TalerkarandShelton, 1993; 陳宗麒等，2003)，其控害作用十分有效?，F(xiàn)已證明，這一寄生蜂在我國(guó)北方地區(qū)廣泛分布(劉樹生等，2004)。利用天敵進(jìn)行生物防治，可降低化學(xué)殺蟲劑的使用量，延緩小菜蛾的抗藥性。然而，殺蟲劑的使用會(huì)降低生物防治的效果。因此，了解殺蟲劑對(duì)天敵的影響，協(xié)調(diào)化學(xué)防治和生物防治的關(guān)系，是制定小菜蛾綜合治理措施的關(guān)鍵。

阿維菌素(abamectin)是土壤鏈霉菌的天然發(fā)酵產(chǎn)物，作用于昆蟲神經(jīng)元突觸或神經(jīng)肌肉突觸的γ-氨基丁酸(GABA)門控氯離子通道和谷氨酸鹽門控氯離子通道，具有高效、廣譜、低殘留等特點(diǎn)，是當(dāng)前防治小菜蛾等害蟲害螨的當(dāng)家農(nóng)藥產(chǎn)品(劉開林等，2007)。盡管已有研究報(bào)道了阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂的毒力及安全性(繆森等，2000；吳國(guó)星等，2008；尹艷瓊等，2010；洪珊珊等，2015；賈變桃等，2015)，但關(guān)于阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂保護(hù)酶和解毒酶活性的影響還未見報(bào)道。與害蟲一樣，半閉彎尾姬蜂體內(nèi)存在的保護(hù)酶系和解毒酶系在殺蟲劑代謝和寄生蜂抗(耐)藥性等方面起著非常重要的作用，通過(guò)研究其活性變化，可以為深入了解半閉彎尾姬蜂對(duì)阿維菌素的防御機(jī)理，協(xié)調(diào)小菜蛾的生物防治和化學(xué)防治等提供理論依據(jù)。因此，作者研究了阿維菌素亞致死濃度對(duì)半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)保護(hù)酶系和解毒酶系活性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試?yán)ハx：半閉彎尾姬蜂于2013年4月采集于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站未施藥的甘藍(lán)田，以室內(nèi)未接觸藥劑飼養(yǎng)的小菜蛾3齡幼蟲供其寄生，飼養(yǎng)條件為溫度25℃±2℃，相對(duì)濕度約70%，光周期14L ∶10D。

供試藥劑：1.8%阿維菌素EC(愛諾蟲清，華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司)。

生化試劑：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase，GST)試劑盒，購(gòu)自南京建成生物研究所；苯硫脲(phenlthiourea，PTU)，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、苯甲磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、牛血清蛋白(bovine albumin，BSA)，美國(guó)Amresco公司生產(chǎn)；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate，SDS)等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：Sorvall ST16R臺(tái)式冷凍離心機(jī)、Thermo Scientific酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific；MGC-300光照培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂成蟲的生物測(cè)定

采用試管藥膜法(洪珊珊等，2015)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 半閉彎尾姬蜂保護(hù)酶活性測(cè)定

酶液制備：根據(jù)毒力測(cè)定結(jié)果以阿維菌素LC10和LC25作為亞致死濃度，以含0.02%的Triton X-100的清水作對(duì)照，共3個(gè)處理。寄生蜂成蜂的處理方法同1.2.1。分別于處理后1、12、24和48 h取存活幼蟲凍存于-20℃冰箱備用。取處理后的寄生蜂成蟲40頭，置于預(yù)冷的3 mL玻璃勻漿器中，加入1.5 mL 0.05 mol/L pH7.0磷酸緩沖液，冰浴研磨，將提取液轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，于4℃、12000 rpm，冷凍離心20 min，將上清液稀釋2倍作為酶活性測(cè)定液，重復(fù)3次。

SOD、POD和CAT活性測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。SOD活性單位定義為每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中抑制率為50%時(shí)所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。POD活性單位定義為每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg底物的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。CAT活性單位定義為1 mg組織蛋白每秒分解1 μmol H2O2酶量為一個(gè)活力單位(U)。

1.2.3 半閉彎尾姬蜂解毒酶活性測(cè)定

酯酶(esterase，EST)活性測(cè)定：取不同處理半閉彎尾姬蜂成蟲40頭置于3 mL玻璃勻漿器中，加入預(yù)冷的1.5 mL 0.05 mol/L pH7.5磷酸緩沖液，冰浴研磨，將提取液轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，于4℃、12000 rpm，冷凍離心20 min，將上清液稀釋2倍即為酶活性測(cè)定液，重復(fù)3次。

酯酶活性測(cè)定參照Hama and Hosoda(1983)的方法：在試管中加入5 mL 6×10-4mol/L α-乙酸萘酯，0.1 mL酶液，充分混勻，30℃恒溫水浴反應(yīng)30 min后，加入1 mL顯色劑(1%固蘭RR鹽和5% SDS以2 ∶5(v/v)臨用前混合而成)。穩(wěn)定30 min后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為600 nm處OD值。由α-萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線求出生成α-萘酚的量(mmol/L)。測(cè)定酶液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算酯酶活性，單位為(μmol/mg pro·30 min)。

GST活性測(cè)定：酶液制備方法同酯酶。酶活性的測(cè)定參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。GST活性單位定義為每毫克蛋白在37℃反應(yīng)1 min使反應(yīng)體系中的GSH降低1 μmol/L為一個(gè)活力單位(U)。

多功能氧化酶(mixed function oxidase，MFO)O-脫甲基活性測(cè)定：參考謝苗等(2011)方法，并稍有改動(dòng)，取20頭半閉彎尾姬蜂成蟲，置于3 mL 勻漿器中，加入預(yù)冷的0.1 mol/L pH7.8磷酸緩沖液(含有1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、1 mmol/L PTU、1 mmol/L PMSF和10%甘油)1.5 mL，冰浴上充分勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)入 2 mL 離心管中，于4℃、10000 rpm，冷凍離心20 min，取上清液在15000 rpm、4℃下再離心20 min，所得上清液即為酶活性測(cè)定液，重復(fù)3次。

以對(duì)硝基苯甲醚為底物，在MFO的作用下生成對(duì)硝基苯酚鈉，在405 nm處測(cè)定其吸光值。反應(yīng)體系：在試管中加入酶液0.1 mL，pH7.8磷酸緩沖液1.7 mL，4 mmol/L對(duì)硝基苯甲醚0.2 mL，0.5 mmol/L NADPH 1 mL。將反應(yīng)液充分混勻后置于37℃恒溫水浴鍋內(nèi)30 min，加入1 mL 1 mol/L HCl終止反應(yīng)。加入5 mL氯仿萃取10 min，取氯仿萃取層溶液(下層)3.5 mL于另一試管，加入3.5 mL濃度為0.5 mol/L NaOH溶液萃取10 min，取上層溶液加入96孔酶標(biāo)板，于酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度值。根據(jù)光密度值從對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出對(duì)硝基苯酚生成量(nmol/mL)。測(cè)定酶液中蛋白含量，計(jì)算MFO活性，單位為(nmol/mg pro·30 min)。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白含量測(cè)定參照Bradford(1976)考馬斯亮藍(lán)法：取1支具塞試管，加入0.1 mL酶液，0.9 mL蒸餾水，5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置2 min后，在酶標(biāo)儀595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線求出對(duì)應(yīng)的蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

生物測(cè)定結(jié)果用Polo Plus 1.0軟件計(jì)算毒力回歸方程的斜率±標(biāo)準(zhǔn)誤、LC10、LC25及其95%置信限。不同處理酶活性數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂成蟲的毒力

阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂成蟲LC10、LC25和LC50值及其95%置信限分別為1.330(0.361-2.315)、2.715(1.229-4.036)和6.003(4.039-8.896)mg/L，其LC50值與吳國(guó)星等(2008)測(cè)定的LC50值(6.036 mg/L)相當(dāng)。本研究選擇LC10(1.330 mg/L)和LC25(2.715 mg/L)處理半閉彎尾姬蜂成蟲。

2.2 阿維菌素對(duì)寄生蜂成蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響

阿維菌素處理后1 h，寄生蜂體內(nèi)SOD活性與對(duì)照相比無(wú)顯著差異；處理后12、24和48 h，LC25處理寄生蜂體內(nèi)SOD活性升高，顯著大于對(duì)照；但到48 h，LC10處理SOD活性顯著升高，顯著大于對(duì)照和LC25處理(表1)。表明阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)SOD活性具有顯著誘導(dǎo)作用。

阿維菌素處理后1 h，寄生蜂體內(nèi)POD活性與對(duì)照相比無(wú)顯著差異；處理后12和24 h，LC10和LC25處理POD活性顯著大于對(duì)照；但到48 h，LC10處理POD活性顯著低于對(duì)照，而LC25處理顯著高于對(duì)照(表1)。說(shuō)明阿維菌素LC10處理對(duì)POD活性具有先誘導(dǎo)后抑制的作用，而LC25處理表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用。

阿維菌素處理后1 h，寄生蜂體內(nèi)CAT活性與對(duì)照相比顯著降低；處理后12 h，LC25濃度處理酶活性顯著升高；處理后24-48 h，LC10和LC25處理CAT活性均顯著大于對(duì)照，但二者沒(méi)有顯著差異(表1)。說(shuō)明阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)CAT活性具有先抑制后誘導(dǎo)作用。

2.3 阿維菌素對(duì)寄生蜂成蟲體內(nèi)解毒酶活性的影響

阿維菌素處理后1 h，LC25處理顯著抑制酯酶活性；12-24 h，LC10和LC25處理顯著抑制酯酶活性，且高濃度處理抑制作用大于低濃度處理；48 h，兩處理酯酶活性顯著低于對(duì)照，但二者之間酶活性沒(méi)有顯著差異(表2)。表明阿維菌素對(duì)寄生蜂成蟲體內(nèi)酯酶活性具有一定程度的抑制作用，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)。

阿維菌素處理后1 h，GST活性沒(méi)有顯著變化；處理后12 h，LC10和LC25處理顯著抑制GST活性，且高濃度處理抑制作用更顯著；24 h，LC10處理組酶活性有所恢復(fù)，與對(duì)照無(wú)顯著差異，LC25處理顯著低于對(duì)照；處理后48 h，兩亞致死濃度處理GST活性顯著低于對(duì)照，濃度越高差異越顯著(表2)。說(shuō)明阿維菌素對(duì)GST活性具有一定的抑制作用。

表1 亞致死濃度阿維菌素處理半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性變化

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。下表同。Note: Data are mean±SD. Different letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 level. The same for the following table.

阿維菌素LC10和LC25處理后各時(shí)間段，MFO活性均顯著低于對(duì)照，但兩處理間差異不大，僅在處理后12 h，LC25處理酶活性大于LC10處理1.92 nmol/mg pro 30 min，處理后48 h，LC25處理酶活性低于LC10處理3.26 nmol/mg pro 30 min(表2)。說(shuō)明阿維菌素對(duì)MFO具有顯著的抑制作用。

表2 亞致死濃度阿維菌素處理半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)解毒酶活性變化

3 結(jié)論與討論

昆蟲體內(nèi)的保護(hù)酶SOD、POD和CAT相互協(xié)調(diào)作用，清除昆蟲體內(nèi)的活性氧或過(guò)氧化物自由基，防御其對(duì)生物體的毒害，一旦保護(hù)酶系遭到破壞，生物體內(nèi)氧自由基濃度過(guò)高，將對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生傷害作用(李周直等，1994；張友軍等，2003)。昆蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性與外界刺激物的強(qiáng)度、昆蟲的耐藥性、抗逆性有關(guān)(王宏民等，2013)。楊瓊等(2015)報(bào)道LC10和LC20濃度的阿維菌素可促進(jìn)異色瓢蟲Harmoniaaxyridis3齡幼蟲和成蟲體內(nèi)SOD活性升高，但對(duì)POD和CAT作用不明顯。朱先志等(2015)報(bào)道煙蚜繭蜂Aphidiusgifuensis成蟲對(duì)不同濃度吡蟲啉具有不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)SOD表現(xiàn)為先抑制后激活，對(duì)POD、CAT總體表現(xiàn)為先激活后抑制的作用。本研究結(jié)果表明，阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)SOD活性具有誘導(dǎo)作用，對(duì)POD活性總體表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，對(duì)CAT活性表現(xiàn)為先抑制后誘導(dǎo)作用。這表明半閉彎尾姬蜂成蟲可通過(guò)提高其體內(nèi)保護(hù)酶活性，抵御阿維菌素對(duì)自身的不利影響，提高其耐藥性。

EST、GST和MFO是昆蟲體內(nèi)的主要解毒酶系，可代謝各種內(nèi)源和外源有毒物質(zhì)(如殺蟲劑、植物次生物質(zhì)等)，提高昆蟲對(duì)殺蟲劑的耐藥性，解毒酶活性增強(qiáng)是昆蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的機(jī)制之一。研究表明，殺蟲劑可誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)解毒酶活性升高，提高蟲體對(duì)殺蟲劑的解毒代謝能力，如阿維菌素和高效氯氰菊酯可誘導(dǎo)小菜蛾體內(nèi)GST活性升高(梁沛等，2003)；阿維菌素亞致死劑量可提高2種色型豌豆蚜Acyrthosiphonpisum體內(nèi)GST和MFO的活性(王小強(qiáng)和劉長(zhǎng)仲，2014)。但也有殺蟲劑通過(guò)抑制昆蟲體內(nèi)相關(guān)解毒酶活性從而達(dá)到殺蟲效果，如馬拉硫磷可抑制東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、全酯酶和GST的活性(趙霞等，2013)；甲胺磷可抑制菜蛾絨繭蜂Cotesiaplutellae體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶和GST的活性(吳剛等，2002)。本研究也表明阿維菌素亞致死濃度可顯著抑制半閉彎尾姬蜂體內(nèi)EST、GST和MFO的活性，使其降解殺蟲劑的能力下降，從而增強(qiáng)了對(duì)寄生蜂的毒力。

Wu and Jiang(2004)認(rèn)為菜蛾絨繭蜂對(duì)甲胺磷、呋喃丹、氰戊菊酯、氯菊酯、阿維菌素和氟蟲腈的耐藥性可能與羧酸酯酶、GST和MFO有關(guān)。Chiang and Sun(1991)曾試圖研究菜蛾絨繭蜂和半閉彎尾姬蜂體內(nèi)解毒酶活性與它們對(duì)某些殺蟲劑敏感性之間的關(guān)系，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)二者具有明顯的相關(guān)性，盡管2種寄生蜂羧酸酯酶、GST和MFO活性比其寄主小菜蛾更低。植食性昆蟲對(duì)殺蟲劑的耐藥性可能來(lái)源于對(duì)寄主植物次生代謝物的解毒，解毒酶活性可被寄主植物的次生代謝物所誘導(dǎo)(Terriere, 1984)。由于沒(méi)有寄主植物次生代謝物的選擇壓力，寄生蜂的解毒酶活性可能比其植食性寄主更低。盡管如此，寄生蜂與害蟲一樣，在長(zhǎng)期殺蟲劑的選擇壓下，其體內(nèi)解毒酶活性會(huì)升高，對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性。李元喜等(2002)通過(guò)施藥于體內(nèi)有寄生蜂的小菜蛾幼蟲獲得了對(duì)氰戊菊酯具有抗性的菜蛾絨繭蜂，其抗性與MFO活性升高有關(guān)。但本研究?jī)H測(cè)定了阿維菌素對(duì)半閉彎尾姬蜂成蟲體內(nèi)解毒酶的短期影響，在長(zhǎng)期阿維菌素的選擇壓力下，其體內(nèi)解毒酶活性是否會(huì)升高還有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果為探明半閉彎尾姬蜂對(duì)阿維菌素的防御反應(yīng)提供了一定的理論依據(jù)，但是要明確其中的機(jī)制及保護(hù)酶和解毒酶的作用方式還有待于深入研究。

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Effect of sublethal concentrations of abamectin on protective and detoxifying enzymes inDiagegmasemclausum

JIABian-Tao,HONGShan-Shan,ZHANGYu-Chao,CAOYong-Wei

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,ShanxiProvince,China)

ToexploretheeffectofabamectinonprotectiveanddetoxifyingenzymesofDiadegma semiclausumHellen,alarvalparasitoidofdiamondbackmoth,theactivitiesofprotectiveanddetoxifyingenzymesweredeterminedaftertreatmentofD. semiclausumadultsfor1, 12, 24and48hourswithLC10andLC25concentrationsofabamectinusingresidualfilmmethod.Theresultsshowedthattheactivitiesofsuperxidasedismutase(SOD)andperoxidase(POD)weresignificantlypromotedwithincreasingtreatmenttimeandthecatalase(CAT)activitywasfirstlyinhibitedthenpromotedbysublethalconcentrationsofabamectin.Atthesametime,abamectinexposureinhibitedtheactivitiesofdetoxifyingenzymessignificantlyatmostoftreatmenttime.TheresultsprovidesometheorybasisforfurtherunderstandingdefensemechanismsofD. semiclausumagainstabamectin.

Abamectin; Diadegma semiclausum;protectiveenzymes;detoxifyingenzymes

山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012011035-3)；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(XB2007008)；山西省研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(20143091)；山西省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(2014097)

賈變桃，女，1971年生，山西祁縣人，副教授，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥毒理與害蟲抗藥性，E-mail: jiabtao@foxmail.com

Received：2015-11-10；接受日期Accepted：2016-02-01

Q965；S476

A

1674-0858(2016)05-0990-06