復(fù)心湯對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞GATA4、PKA、ERK表達(dá)的影響*

薛一濤焦華琛劉 江高翔宇

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011；2.山東省章丘市中醫(yī)醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

·綜 述·

復(fù)心湯對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞GATA4、PKA、ERK表達(dá)的影響*

薛一濤1焦華琛1劉 江1高翔宇2△

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011；2.山東省章丘市中醫(yī)醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014）

目的 為明確復(fù)心湯治療心衰的作用靶點(diǎn)，以心肌細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子GATA4、PKA、ERK作為觀察對(duì)象，觀察復(fù)心湯對(duì)GATA4、PKA、ERK表達(dá)的影響。方法 健康成年的雄性Wistar大鼠75只，隨機(jī)分為復(fù)心湯低劑量組、復(fù)心湯中劑量組、復(fù)心湯高劑量組、纈沙坦組、生理鹽水組，制備含藥血清，原代乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)，加入相應(yīng)含藥血清干預(yù)24 h，Western blot法測(cè)各組乳鼠心肌細(xì)胞中GATA4、PKA、ERK表達(dá)。結(jié)果 復(fù)心湯3組及纈沙坦組乳鼠心肌細(xì)胞中GATA4、PKA、ERK表達(dá)量明顯低于生理鹽水組（P＜0.01），復(fù)心湯中劑量組抑制GATA4、PKA、ERK表達(dá)方面較復(fù)心湯低、高劑量組及纈沙坦組更明顯（P＜0.01）。結(jié)論 復(fù)心湯通過抑制心肌細(xì)胞GATA4、PKA、ERK表達(dá)，抑制心室肥厚，改善心衰。

慢性心力衰竭 心室重構(gòu) 心肌肥厚 復(fù)心湯 GATA4

復(fù)心湯是治療慢性心力衰竭有效方藥，經(jīng)過多年臨床應(yīng)用，效果顯著。本研究通過探討復(fù)心湯對(duì)導(dǎo)致心衰心肌肥厚的GATA4、PKA、ERK等信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子的影響，來(lái)確定復(fù)心湯治療心衰與各信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系，明確復(fù)心湯抗心衰的作用靶點(diǎn)及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康成年的雄性Wistar大鼠75只，180～220 g；SPF級(jí)健康雄性Wister1-3 d乳鼠6只，5～7 g，購(gòu)買自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)Scxk（魯）20150009。經(jīng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試藥與儀器 纈沙坦（規(guī)格:80 mg膠囊，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20040217）:北京諾華制藥有限公司；0.9%氯化鈉注射液（規(guī)格:500 mL/瓶，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H37021260）:山東潔晶藥業(yè)有限公司。山羊血清封閉液（c-0005），購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；GAPDH（ab181603）購(gòu)自abcam公司，-20℃保存，Rabbit來(lái)源，1∶10000稀釋；山羊抗兔IgG（ZB-2301）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，1∶5000稀釋；復(fù)心湯藥物組成:炙附子30 g，淫羊藿30 g，葶藶子30 g，澤瀉20 g，當(dāng)歸15 g，黃柏30 g。由山東省中醫(yī)院中藥制劑室濃縮提純，每毫升含生藥7.1 g，密封裝瓶，置4℃保存?zhèn)溆?。高速低溫離心機(jī)（MICROMAX RF，Thermo IEC美國(guó)）ND-1000分光光度計(jì) （JCS0112，Gene Company美國(guó)）移液器（10～1000μl，GLISON法國(guó)）超低溫冰箱（725，Thermo Forma美國(guó)）Minishaker（MSI，IKA廣州）超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F，蘇州安泰技術(shù)有限公司）化學(xué)發(fā)光圖像分析儀（LAS-4000mini2200，富士 日本）二氧化碳培養(yǎng)箱（bb506uv，NUAIR德國(guó)）倒置顯微鏡（Axiovert 40C，OLYMPUS公司日本）。

1.3 含藥血清制備 75只Wister大鼠隨機(jī)分為復(fù)心湯高、中、低劑量組、纈沙坦組、生理鹽水組。復(fù)心湯低劑量組給予低劑量復(fù)心湯1 mL/d（每毫升約含生藥1.90 g）灌胃，復(fù)心湯中劑量組給予中劑量復(fù)心湯1 mL/d（每毫升約含生藥3.79 g）灌胃，復(fù)心湯高劑量組給予高劑量復(fù)心湯1 mL/d（每毫升約含生藥7.58 g）灌胃，纈沙坦組給予纈沙坦水溶液1 mL/d（3.6 mg/mL），生理鹽水組給予0.9%氯化鈉注射液1 mL/d灌胃，每日1次，共10 d。末次灌胃2 h后下腔靜脈收集血液后處死動(dòng)物并離心血液取得血清，將血清滅活、濾菌后與DMEM培養(yǎng)基以15%濃度混合；將各組分離的血清標(biāo)記后放于-80℃冷凍保存。

1.4 原代心肌細(xì)胞分離、純化與培養(yǎng) 1）取新生1～3 d Wister大鼠乳鼠，75%酒精消毒后是用眼科剪與眼科鑷開胸取出心臟，將心室部分剪下放入D-Hank′s液中沖洗大約3次左右。2）將心肌組織置于50 mL離心管中，用眼科剪剪成碎塊，約1 mm3，吸取0.05%Ⅱ型膠原酶和0.06%胰蛋白酶按1∶1比例混合3 mL加入已剪碎的心肌組織中，吸管吹打，置于CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2～95%空氣）中靜置5 min，自然沉淀，棄第一次消化上清。3）再次加入消化酶3 mL，37℃條件下分離成單細(xì)胞懸液，每消化5 min后吸出上層細(xì)胞懸液，加入少量含血清培養(yǎng)基以中止消化。4）再向組織中加入消化酶混合液3 mL進(jìn)行消化，重復(fù)多次，直到組織碎塊肉眼不可見。5）將收集上清液經(jīng)200目孔徑不銹鋼網(wǎng)過濾，離心機(jī)離心后，取得心肌細(xì)胞，用含15%胎牛血清培養(yǎng)基混懸，接種于培養(yǎng)瓶中，然后置于CO2培養(yǎng)箱（5%CO2～95%空氣，37℃）中，差速貼壁1 h。6）取差速貼壁后細(xì)胞懸液臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞存活率，后再次接種于培養(yǎng)瓶，置CO2培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2～95%空氣）中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)觀測(cè)待細(xì)胞鋪滿后可用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.5 藥物干預(yù)及觀察項(xiàng)目 將培養(yǎng)狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞隨機(jī)分組去胎牛血清并分別加入相應(yīng)含藥血清進(jìn)行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后處理標(biāo)本，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞中GATA4、PKA、ERK的表達(dá)［1］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組乳鼠心肌細(xì)胞中GATA4、PKA、ERK表達(dá)結(jié)果 見表1，圖1。用LAS-4000 mini化學(xué)發(fā)光圖像分析儀進(jìn)行灰度值定量測(cè)定，并定量分析后顯示:與生理鹽水組相比，復(fù)心湯低劑量組、復(fù)心湯中劑量組、復(fù)心湯高劑量組、纈沙坦組大鼠心肌細(xì)胞中GATA4、PKA、ERK1/2表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；與復(fù)心湯中劑量組比較，復(fù)心湯低劑量組、復(fù)心湯高劑量組、纈沙坦組大鼠心肌細(xì)胞中GATA4、PKA、ERK1/2表達(dá)量明顯增高（P＜0.01）；與纈沙坦組相比復(fù)心湯低劑量組、復(fù)心湯高劑量組大鼠心肌細(xì)胞中GATA4、PKA、ERK1/2表達(dá)量明顯增高（P＜0.01）。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞中GATA4、PKA、ERK1/2、P-ERK1/2相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞中GATA4、PKA、ERK1/2、P-ERK1/2相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

與復(fù)心湯中劑量組比較，*P＜0.01；與纈沙坦組比較，◇P＜0.01。與低劑量組比較，△P＜0.01。

?

3 討 論

心衰屬中醫(yī)學(xué) “心悸”“怔忡”“喘證”等病證的范疇。病位在心，病機(jī)以氣虛血瘀貫穿始終，與肺脾腎關(guān)系密切。目前認(rèn)為［2］心力衰竭的中醫(yī)病機(jī)主要為本虛標(biāo)實(shí)，其中以心腎陽(yáng)虛、血瘀水停者為最常見。復(fù)心湯以制附子作為主藥，回陽(yáng)救逆，補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛，為回陽(yáng)第一品。臣以淫羊藿、葶藶子兩藥，一補(bǔ)一瀉，虛實(shí)兼顧，輔助君藥溫補(bǔ)腎陽(yáng)、利水消腫。佐以澤瀉、當(dāng)歸、黃柏三味，兼顧氣分、血分和水分，與君臣藥共同起到益氣溫陽(yáng)、活血利水的作用。

圖1 Western blot法分析乳鼠心肌細(xì)胞中GATA4、PKA、ERK的表達(dá)

GATA基因家族屬鋅指蛋白家族，因其能識(shí)別“GATA”DNA序列，故此命名［3］。GATA-4/5/6與心臟發(fā)育密切相關(guān)［4］，在心肌特化和分化過程中是大量心臟特異基因的直接調(diào)控者，其中GATA4是心臟信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游效應(yīng)因子，相比其他亞型，GATA4在心肌肥厚中的作用尤為重要。GATA-4與心臟發(fā)育密切相關(guān)［5］，在心肌特化和分化過程中是大量心臟特異基因的直接調(diào)控者，是心臟信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游效應(yīng)因子，在心肌肥厚中作用尤為重要。已知研究結(jié)果表明，GATA-4與DNA的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄與其變異與否密切相關(guān)，同時(shí)GATA-4在不同細(xì)胞亞核斑點(diǎn)間的選擇性蓄積也受其變異作用［6］。已知成年鼠實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)α-MHC、心鈉素（ANF）、腦鈉素（BNP）、鈉/鈣離子交換通道，A1腺苷受體、m2毒蕈堿型乙酰膽堿受體和AngII1a受體多種影響心臟結(jié)構(gòu)基因均受GATA-4調(diào)控［7］。

GATA-4分子結(jié)構(gòu)上Ser105和Ser261是兩個(gè)重要磷酸化位點(diǎn)。肥厚心肌細(xì)胞中GATA-4與ET-1結(jié)合可被ERK抑制劑阻斷。ET-1表達(dá)增強(qiáng)的同時(shí)也對(duì)GATA-4進(jìn)行正反饋調(diào)控。相關(guān)動(dòng)物模型的壓力超負(fù)荷實(shí)驗(yàn)中，GATA4與BNP基因序列的結(jié)合被ET-1受體激動(dòng)劑完全抑制，證實(shí)了GATA-4的DNA結(jié)合活性受ET-1影響［8］。其中p38-MAPK信號(hào)通路參與這一過程。研究證實(shí)，肥厚刺激條件p38激酶可激活BNP基因與GATA-4結(jié)合使BNP基因蛋白質(zhì)表達(dá)量的提高。此外也有研究表明PKA可直接磷酸化GATA-4Ser 261增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性［9］。乙?；?、亞細(xì)胞定位及與輔因子相互作用等多種調(diào)節(jié)方式亦可影響GATA-4基因轉(zhuǎn)錄活性。目前研究證實(shí)，GATA-4是多種刺激和信號(hào)通路的下游效應(yīng)因子。ERK、PKA均為GATA4上游轉(zhuǎn)錄因子，已知ERK、PKA所在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與心衰的發(fā)生有密切關(guān)系。因此，此研究對(duì)于揭示復(fù)心湯治療心衰的作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，有重要意義。

薛一濤等通過動(dòng)物與臨床實(shí)驗(yàn)研究復(fù)心湯 （炙附子、仙靈脾、澤瀉、葶藶子、黃柏、當(dāng)歸）抗心衰機(jī)制，研究表明，應(yīng)用復(fù)心湯，抑制心衰大鼠Raf/MEK/ERK通路的蛋白激活［10］；抑制心衰大鼠PI3K-Akt-GSK3β途徑的蛋白激活［11］；提高心衰大鼠Caspase-8，Bcl-2蛋白轉(zhuǎn)錄［12］，多種阻斷細(xì)胞凋亡途徑［13］；降低心衰大鼠血清TNF-α及BNP水平以延緩心衰［14］，心衰患者外周血淋巴細(xì)胞β1-AR mRNA的表達(dá)增高［15］，明顯消除CHF患者癥狀［16］。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，復(fù)心湯3組及纈沙坦組乳鼠心肌細(xì)胞中GATA4、PKA、ERK表達(dá)量明顯低于生理鹽水組，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明復(fù)心湯和纈沙坦是通過抑制GATA4、PKA、ERK的表達(dá)及其所在信號(hào)通路過度激活狀態(tài)，來(lái)發(fā)揮抗心力衰竭的作用，其中復(fù)心湯中劑量組抑制GATA4、PKA、ERK表達(dá)方面較低劑量組、高劑量組更明顯，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示在一定劑量范圍內(nèi)，復(fù)心湯在抑制GATA4、PKA、ERK的表達(dá)方面呈現(xiàn)劑量依賴性，劑量越高療效越好，超過一定劑量則效應(yīng)降低。復(fù)心湯中劑量組與纈沙坦組在抑制GATA4、PKA、ERK表達(dá)方面存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示復(fù)心湯中劑量在改善心衰，抑制心室肥厚，改善心衰心室重構(gòu)的某些方面較纈沙坦更有效。

綜上，GATA4、PKA、ERK等信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子與心衰的形成與進(jìn)展密不可分；復(fù)心湯可通過抑制GATA4、PKA、ERK等信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)達(dá)到抑制心室重構(gòu)的目的；中劑量復(fù)心湯對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞的作用效果明顯優(yōu)于高劑量復(fù)心湯低劑量復(fù)心湯以及纈沙坦試驗(yàn)組。

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Influence of Fu Xin Decoction′s on the Expression of GATA4、PKA、ERK in Myocardial Cell of Rats

XUE Yitao，JIAO Huachen，LIU Jiang，et al. Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，ShanDong JiNan 250011，China.

Objective:In myocardial cell signal transduction molecules GATA4，PKA，ERK as research object，This research through observation Fu Xin Decoction for the effect of GATA4、PKA、ERK expression，F(xiàn)or the clear Fu Xin Decoction′s targets for the treatment of heart failure.Methods:75 healthy adult male Wistar rats were randomly divided into low dose group，median dose group and high dose group of Fu Xin Decoction，valsartan group，normal saline group.Medicated serum were prepared.The cultivation of the myocardial cells and processing，join the drug-containing serum levels of processing for 24 hours.The expression of myocardial cells GATA4，PKA，ERK were detected with the method of Western blot.Results:Compared with normal saline group，low dose group，median dose group and high dose group of Fu Xin Decoction，valsartan group，GATA4，PKA，ERK in rat myocardial cells，expression quantity to decrease，with statistically significant difference（P＜0.01）；Compared with median dose group after low dose group，high dose group of Fu Xin Decoction，valsartan GATA4，PKA，ERK in rat myocardial cells，expression quantity increased obviously had a statistically significant difference（P＜0.01）.Conclusion:Fu Xin Decoction can by adjusting the rat myocardial cells GATA4、PKA、ERK to achieve the goal of treatment for heart failure.

Chronic heart failure；Ventricular remodeling；Myocardial hypertrophy；After heart soup；GATA4

R285.5

A

1004-745X（2016）10-1907-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.024

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81273703）

△（電子郵箱：gaoxiangyuv@163.com）

（2016-05-11）