電針百會、神庭穴對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠學習記憶功能及嘌呤受體P2X7表達的影響*

游小芳黃 佳△林曉敏宋長明林冰冰陶 靜，2陳立典

（1.福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建 福州 350122；2.福建省康復技術重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122）

電針百會、神庭穴對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠學習記憶功能及嘌呤受體P2X7表達的影響*

游小芳1黃 佳1△林曉敏1宋長明1林冰冰1陶 靜1，2陳立典3

（1.福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建 福州 350122；2.福建省康復技術重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學，福建 福州 350122）

目的 觀察電針百會、神庭穴對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠學習記憶功能及海馬區(qū)嘌呤受體P2X7的影響，探討其可能機制。方法 采用改良Zea Longa線栓法制備大鼠左側大腦中動脈缺血（MCAO）再灌注損傷模型，造模成功后隨機分為模型組與電針組，另設假手術組。電針組大鼠取穴百會、神庭，治療7 d。采用Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶功能；采用免疫組化法觀察大鼠海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞活化標記物ED1與嘌呤受體P2X7的表達。結果 電針組大鼠空間學習記憶功能較模型組改善（P＜0.05），神經(jīng)行為學評分降低（P＜0.05）。模型組大鼠海馬區(qū)ED1、P2X7受體表達較假手術組明顯增多（P＜0.01），電針組表達則少于模型組（P＜0.05）。結論 電針百會、神庭穴能改善局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠學習記憶功能，其機制可能與抑制小膠質(zhì)細胞活化及P2X7受體表達有關。

腦缺血 電針 學習記憶功能 炎癥 P2X7受體

腦卒中具有高發(fā)病率、高復發(fā)率、高致殘率、高致死率的特征，是全球主要病死原因及長期殘疾致病原因［1-2］。其中急性缺血性卒中發(fā)病率約占腦卒中80%［3］。認知功能障礙是腦卒中后常見功能障礙之一，其發(fā)病率高達65%［4-5］。針刺是治療腦卒中常用方法之一，大量臨床和基礎研究均表明針刺能有效改善腦卒中后認知功能障礙，但其作用機制尚未完全清楚［6-9］。神經(jīng)炎癥反應在腦卒中后病理損傷過程起重要作用［10-13］。最近研究發(fā)現(xiàn)嘌呤/嘧啶類物質(zhì)是最先激活膠質(zhì)細胞炎癥信號的主要分子［12］，其中嘌呤受體P2X7參與介導腦卒中后神經(jīng)炎癥反應，促進炎癥介質(zhì)釋放，與認知功能損害密切相關［14-15］。課題組前期基礎研究證實，針刺能抑制小膠質(zhì)細胞（MG）活化，改善神經(jīng)炎癥反應，發(fā)揮腦保護作用［16-18］。本研究通過觀察腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞ED1、嘌呤受體P2X7表達，探討電針百會、神庭穴治療缺血性腦卒中認知功能障礙的可能機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 采用成年健康雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供［合格證號:SCXK（瀘）2014-0003］。于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心［許可證號: SYXK（閩）2014-0001］分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由進食及飲水，適應性喂養(yǎng)1周。實驗過程均嚴格按照國際動物保護及使用指南規(guī)定進行。

1.2 試劑與儀器 P2RX7 Antibody（11144-1-AP，Proteintech）、Anti-ED1（AbDSEROTEC）、UIstraSentive SP（Mouse、Rabbit）IHC Kit（KIT-9720）、DAB顯色試劑盒（DAB-0031）。光學顯微鏡（Leica，德國）、Image-lab圖像分析系統(tǒng)（BIO-RAD LABORATORIES）、Morris水迷宮 （中國醫(yī)學科學院藥物研究所）、G6805型電針儀（華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）、0.5寸毫針（華佗牌30號，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.3 模型制備與分組 所有實驗大鼠術前12 h禁食，隨機分組為假手術組12只與造模組24只，參照參考Zea Longa方法［19］制備大腦中動脈缺血（MCAO）模型。大鼠稱質(zhì)量后予10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，常規(guī)備皮、消毒。取頸正中切口切開皮膚約1.5 cm，鈍性分離、充分暴露左側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），用縫合線結扎CCA近心端、ECA，游離結扎ICA并用血管夾阻斷其血流。在距離CCA結扎處遠心端約3 mm處剪一小口，將栓線插入，撤去ICA上血管夾，沿ICA方向緩慢推動栓線至大腦中動脈分支處，感到輕微阻力時停止，線栓插入距離ECA、ICA分叉約18～20 mm，固定線栓，清洗創(chuàng)口，縫合皮膚。缺血90 min后回抽線栓至CCA分叉處，完成再灌注。假手術組只分離CCA、ECA、ICA，不予結扎和插線。術中及術后維持大鼠體溫在37℃左右。動物蘇醒后按Zea Longa評分判斷模型是否成功。評分1～3分者納入實驗。造模成功動物隨機分為模型組與電針組各12只。

1.4 干預措施 術后第2日，電針組穴位取百會、神庭，百會:頂骨正中，向后斜刺2 mm。神庭:前正中線上，在額頂骨縫交界線前方處，向上斜刺2 mm［20］，應用30號0.5寸華佗牌不銹鋼毫針，G6805電針儀，電壓峰值6 V，疏密波，頻率2 Hz，電針20 min，每日1次，共7 d。假手術組、模型組回籠飼養(yǎng)，每日與電針組同樣條件下抓取，不予電針治療。

1.5 觀察項目 1）Morris水迷宮測試:Morris水迷宮用來測試大鼠空間學習記憶功能［21］。Morris水迷宮的圓形水池直徑為200 cm，高為50 cm，水深30 cm，水溫保持（25±2）℃。水池分為4個象限，在第3象限中央放置平臺，黑色圓心平臺直徑為6 cm，低于水面1～2 cm，四周的池壁表面光滑整潔，水池周圍參照物從實驗開始到結束位置保持不變。術后第3日開始訓練。2）定位航行實驗:實驗開始前先將大鼠置于水池中，使其適應2 min，每日將大鼠按順時針方向依次由第1、2、3、4象限入水點順序，面向池壁放入水中。若大鼠在90 s內(nèi)找到平臺，并在平臺上停留的時間達到3 s以上，認為大鼠找到平臺，此時由計算機記錄其時間為逃避潛伏期，讓大鼠在平臺上停留10 s；若大鼠在90 s內(nèi)未找到平臺，此時逃避潛伏期計為90 s，將大鼠牽引到平臺上停留10 s，定位航行實驗歷時4 d。3）空間探索實驗:術后第7日撤去平臺，任意選取一入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄90 s內(nèi)大鼠穿越放置原平臺區(qū)域的次數(shù)。

1.6 免疫組化檢測 采用腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，經(jīng)左心室先后灌注0.9%氯化鈉注射液250 mL和4%多聚甲醛溶液250 mL，迅速斷頭取腦，放置于4%多聚甲醛內(nèi)，4℃固定24～48 h。再行梯度脫水、石蠟包埋。切片，脫蠟，透明；置于枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）抗原修復15 min，3%H2O2室溫孵育5 min；PBS漂洗3次，每次5 min；10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min；不同大腦切片上分別加入ED1一抗（1∶200）或者P2X7一抗（1∶300），放置濕盒中4℃過夜；滴加生物素標記二抗，室溫孵育10 min，PBS漂洗3次；滴加鏈霉卵白素-過氧化物酶，室溫10 min；PBS漂洗3次；DAB顯色1 min；清水漂洗，蘇木素復染細胞核1 min，返藍20 min，脫水，透明，封片。400倍鏡下觀察。陽性表達呈棕黃色。左側海馬區(qū)隨機取6個視野，分析每張圖海馬區(qū)平均光密度。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)行為學評分比較 見表1。缺血再灌注后2 h，模型組與電針組大鼠神經(jīng)行為學評分較假手術組明顯升高（P＜0.01），模型組和電針組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。電針治療7 d后，電針組神經(jīng)行為學評分較模型組降低（P＜0.05），提示電針對腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)缺損癥狀有改善作用。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學評分比較（分，±s）

與假手術組同時期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同時期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n 缺血再灌注后2 h 電針治療7 d假手術組 12 0 0模型組 12 2.31±0.48**1.85±0.6**電針組 12 2.15±0.69**1.23±0.44*△

2.2 各組大鼠水迷宮實驗結果比較 見表2。定向航行實驗結果顯示，各組大鼠逃避潛伏期隨著訓練時間推移逐漸縮短。模型組逃避潛伏期較假手術組明顯延長（P＜0.01）；電針組逃避潛伏期較模型組縮短（P＜0.05）?？臻g探索實驗結果顯示，模型組與電針組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯少于假手術組（P＜0.05），電針組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯多于模型組（P＜0.05），說明電針百會、神庭穴可以改善大鼠空間學習記憶能力。

表2 各組大鼠水迷宮實驗結果比較（±s）

表2 各組大鼠水迷宮實驗結果比較（±s）

大鼠穿過平臺次數(shù)（次/90 s）組別 n第3日 第4日 第5日 第6日假手術組 7 34.44±13.87 24.91±8.21 11.01±3.04 10.48±4.69 3.86±1.22大鼠逃避潛伏期時間測試（s）模型組 780.71±6.84**78.04±8.36**67.93±26.09**73.45±17.35**1.29±1.11*電針組 761.46±16.28*40.69±16.81*△△30.23±13.13*△26.20±9.34*△△2.86±1.77*△

2.3 各組大鼠ED1免疫組織化學染色比較 見圖1，表3。ED1標志活化的小膠質(zhì)細胞。假手術組未觀察到陽性細胞。模型組海馬區(qū)可見大量小膠質(zhì)細胞胞體增大，形態(tài)改變?yōu)閳A形或阿米巴狀。與假手術組相比，模型組與電針組陽性細胞明顯增加（P＜0.01），電針組陽性細胞較模型組明顯減少（P＜0.01）。提示腦缺血再灌注損傷后，海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞活化，電針能有效抑制小膠質(zhì)細胞活化。

圖1 各組海馬CA1區(qū)ED1的表達（免疫組織化學染色，400倍）

表3 各組ED1、P2X7平均光密度值 比較（±s）

表3 各組ED1、P2X7平均光密度值 比較（±s）

組 別 n ED1平均光密度值 P2X7平均光密度值假手術組 4 0 0.007±0.001模型組 4 0.051±0.001**0.077±0.014**電針組 4 0.032±0.003**△△0.061±0.011**△

2.4 各組大鼠P2X7免疫組織化學染色 見圖2，表3。免疫組化P2X7陽性表達呈棕色或棕褐色。 結果顯示，與假手術組相比，模型組與電針組P2X7陽性表達顯著增加（P＜0.01），電針組陽性表達較模型組明顯減少（P＜0.05）。提示腦缺血再灌注損傷后，海馬區(qū)P2X7受體表達增多，電針能有效抑制P2X7受體表達。

圖2 各組海馬CA1區(qū)P2X7的表達（免疫組織化學染色，400倍）

3 討 論

腦卒中認知功能障礙屬中醫(yī)學 “健忘”“呆證”“善忘”等范疇，病位在腦，病理性質(zhì)為本虛標實，虛者為髓海不足，髓減腦消，神機失用。實者痰瘀內(nèi)生，痹阻腦竅，神明失司。督脈循行入絡腦，與腦髓關系密切，督脈的生理病理功能與認知功能障礙關系密切。督脈為“陽脈之海”，總督一身陽脈之氣，而“陽氣者，精則養(yǎng)神，柔則養(yǎng)筋”。督脈調(diào)暢，氣血運行通暢，陽氣得以宣發(fā)，精微得以布散，腦髓得以濡養(yǎng)，神機靈透，肢體活動自如。若督脈瘀阻，腎精匱乏，則神明失用。百會位于顛頂，是督脈、手少陽三焦經(jīng)、足太陽膀胱經(jīng)、足少陽膽經(jīng)和足厥陰肝經(jīng)的會穴；神庭為督脈、陽明經(jīng)、足太陽交匯之穴。針刺百會、神庭穴常用于治療心神病癥，對腦卒中認知功能障礙療效確切，臨床應用廣泛［6-7］。本研究顯示，電針百會、神庭穴能改善缺血再灌注損傷大鼠空間學習記憶功能。

缺血性腦卒中后，小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫效應細胞，迅速被激活，ED1是其活化的標志物，進而誘發(fā)神經(jīng)炎癥反應，促進炎癥介質(zhì)釋放，如IL-1、IL-6、TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1、活性氧、基質(zhì)金屬蛋白酶等，導致血腦屏障破壞，促進循環(huán)中單核細胞浸潤，中性粒細胞和淋巴細胞滲入，加重神經(jīng)元損傷，抑制海馬神經(jīng)突觸長時程增強（LTP），損害學習記憶功能。課題組前期研究表明電針可能通過抑制缺血周圍區(qū)皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞的活化及促炎因子的釋放，起到神經(jīng)保護作用［16］。

嘌呤/嘧啶類物質(zhì)是最先激活膠質(zhì)細胞炎癥信號的主要分子［12］，P2X7是嘌呤受體之一，為離子通道受體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達，包括下丘腦核、丘腦、海馬、皮質(zhì)等，小膠質(zhì)細胞上有表達。P2X7受體參與腦缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應［14］。腦缺血損傷后，受損的神經(jīng)元和其他神經(jīng)膠質(zhì)細胞迅速釋放ATP，激活小膠質(zhì)細胞上P2X7受體，膠質(zhì)細胞上的P2X7受體通過與Parmexinl通道相互作用可以介導腦缺血缺氧損傷過程中ATP進一步釋放、小膠質(zhì)細胞的活化，活性氧的產(chǎn)生，促進產(chǎn)生和釋放炎癥介質(zhì)，如IL-1β、TNF-α和IL-6，介導并放大炎癥反應，促進神經(jīng)元死亡，導致神經(jīng)功能損傷加重［12］。P2X7受體特異性抑制劑通過抑制膠質(zhì)細胞活化，減少炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α、IL-6釋放，減輕短暫性全腦缺血再灌注大鼠炎癥反應，對海馬區(qū)神經(jīng)元有明顯的保護作用，并可以改善全腦缺血后大鼠的空間記憶能力［14］。

本研究顯示，大鼠腦缺血再灌注后，缺血周圍區(qū)海馬活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著增加，P2X7受體表達增加；電針可抑制缺血周圍區(qū)海馬小膠質(zhì)細胞活化、降低P2X7受體表達水平。綜上，電針百會、神庭穴可改善腦缺血再灌注損傷大鼠空間學習記憶功能，其作用機制可能是通過抑制缺血周圍區(qū)海馬小膠質(zhì)細胞的活化及P2X7受體表達。

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Effects of Electroacupuncture on Learning-memory Abilities and P2X7 Receptors Expressions in Hip-pocampus of Cerebral Ischemia-reperfusion Injury Rats

YOU Xiaofang，HUANG Jia，LIN Xiaomin，et al. College of Rehabilitation Medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)ujian，F(xiàn)uzhou 350122，China.

Objective:To observe the efficacy of treatment with electroacupuncture at Baihui（DU20）and Shenting（DU24）on learning-memory ability and P2X7 receptors expressions in rats after cerebral ischemia/ reperfusion（I/R）injury and to explore its possible mechanism.Methods:The male SD rats were randomly divided into the ischemia control group and the electroacupuncture group after using a focal cerebral ischemia-reperfusion-injured rat model，and the sham operation group was established.The electroacupuncture group

electroacupuncture at Shenting（BL24）and Baihui（DU20）for 7 days.Learning and memory abilities were tested by Morris water maze；the expression of ED1 and P2X7 receptors was determined with immunohistochemical staining.Results:The learning and memory abilities were improved in the electroacupuncture group（P＜0.05），and the neurological deficit score decreased（P＜0.05），with less expression of ED1 positive microglia and P2X7 receptors（P＜0.05），compared with the model group.The expression of ED1 positive microglia and P2X7 receptors in the model group was obviously more than that of the sham operation group（P＜0.01）.Conclusion:The electroacupuncture at Shenting（DU24）and Baihui（DU 20）acupoints can improve the learning and memory ability from cerebral ischemia/reperfusion（I/R），which might be associated with inhibiting the microglia and P2X7 receptors activation in hippocampus.

Cerebral ischemia；Electroacupuncture；Learning and memory；Neuroinflammation；P2X7 receptors

R245.9+7

A

1004-745X（2016）10-1851-06

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.006

國家自然科學基金資助項目（81403462）；福建省教育廳資助省屬高校項目（JK2014022）

△（電子郵箱：jasmine1874@163.com）

（2016-03-15）