甘露消毒丹對(duì)感染腸道病毒71型細(xì)胞miRNA-155表達(dá)的影響*

何宜榮賀又舜曹 蓉何 棟趙國(guó)榮艾碧琛△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙410000）

·研究報(bào)告·

甘露消毒丹對(duì)感染腸道病毒71型細(xì)胞miRNA-155表達(dá)的影響*

何宜榮1賀又舜1曹 蓉1何 棟2趙國(guó)榮1艾碧琛1△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙410000）

目的 觀察甘露消毒丹及其殘方對(duì)腸道病毒71型（EV71）感染后的RD細(xì)胞miRNA-155表達(dá)的影響。方法 運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，設(shè)甘全方組、清殘方組、利殘方組、利巴韋林組、正常細(xì)胞對(duì)照組、模型對(duì)照組，將藥物作用于EV71感染后的RD細(xì)胞，24 h后RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞miR-155表達(dá)。結(jié)果 1）模型對(duì)照組、甘全方組、清殘方組、利巴韋林組miR-155表達(dá)均比正常細(xì)胞對(duì)照組低，利殘方組比正常細(xì)胞對(duì)照組升高（P＜0.05或P＜0.01）；甘全方組、清殘方組、利殘方組miR-155的表達(dá)比模型對(duì)照組高（P＜0.05或P＜0.01），利巴韋林組與模型對(duì)照組差異不明顯（P＞0.05）；甘全方組、清殘方組、利殘方組miR-155表達(dá)比利巴韋林組升高（P＜0.05或P＜0.01），清殘方組、利殘方組的表達(dá)比甘全方組升高（P＜0.05或P＜0.01），利殘方組最高。結(jié)論 EV71感染RD細(xì)胞后miR-155表達(dá)降低，與文獻(xiàn)報(bào)道趨勢(shì)不同，提示其表達(dá)可能具有細(xì)胞特異性；甘全方、清殘方、利殘方均能上調(diào)EV71感染后miR-155的表達(dá)從而調(diào)控免疫反應(yīng)；利殘方與清殘方之間可能存在相互拮抗關(guān)系。

甘露消毒丹 殘方 EV71 microRNA-155

手足口病是嬰幼兒常見(jiàn)的傳染性疾病，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數(shù)患者并發(fā)呼吸道感染、心肌炎、無(wú)菌性腦膜炎、肺水腫等并發(fā)癥后病情進(jìn)展快，易發(fā)生死亡，近年手足口病疫情發(fā)生率及死亡率均有增高的趨勢(shì)［1］。手足口病主要由小RNA病毒科的腸道病毒引起，其中以腸道病毒71型（EV71）及柯薩奇病毒A組16型（CoxAl6）型最常見(jiàn)。CoxA16引起的手足口病癥狀較輕，EV71可通過(guò)引起細(xì)胞免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)血管變態(tài)反應(yīng)等造成機(jī)體損害，尤其與手足口病的神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重并發(fā)癥密切相關(guān)，較其他病毒株更易導(dǎo)致出現(xiàn)重癥、甚至死亡病例，故抗EV71是防治手足口病的研究重點(diǎn)。目前用于手足口病抗病毒的藥品種類較少，缺乏特異高效的抗病毒藥物，常選用阿昔洛韋、更昔洛韋、利巴韋林等，臨床效果并不理想。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為手足口病屬 “時(shí)疫”“春溫”“濕溫”等范疇，甘露消毒丹清熱解毒、利濕化濁，為治療手足口病常用選方之一，臨床療效得到廣泛肯定，但甘露消毒丹抗手足口病病毒的機(jī)制尚不明確。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)甘露消毒丹有很強(qiáng)的抗EV71作用，并且其抗EV71效應(yīng)體現(xiàn)在影響EV71復(fù)制的多個(gè)環(huán)節(jié)［2-3］，本研究在該基礎(chǔ)上繼續(xù)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，以參與免疫炎癥反應(yīng)的重要miRNA中的miR-155［4-5］為觀察指標(biāo)，從基因水平觀察甘露消毒丹對(duì)手足口病免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)對(duì)甘露消毒丹進(jìn)行拆方研究，以期有助于闡明其配伍原理及作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒 人惡性胚胎橫紋肌瘤細(xì)胞 （RD細(xì)胞），美國(guó)ATCC公司產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)液（含10%牛血清）培養(yǎng)，連續(xù)傳代3次。細(xì)胞維持液為含1%雙抗（青霉素、鏈霉素）、2%新生牛血清的DMEM；消化液為0.25%胰蛋白酶溶液。EV71病毒由武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所提供，EV71接種于單層RD細(xì)胞上，加維持液后置入35℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待出現(xiàn)75%以上的病變時(shí)收獲，凍融3次后吹打離心，4000 r/min，10 min，取上清，分裝后-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器 主要試劑:DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)HyClone公司，批號(hào)SH30243.01B；胎牛血清，美國(guó)Hy-Clone公司，批號(hào)SV30087.02；胰蛋白酶消化液，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)11476232；DMSO（二甲基亞砜），上海生工生物工程公司，批號(hào)2924B239；MTT（甲基偶氮唑藍(lán)），上海生工生物工程公司，批號(hào)TB0799；DnaseI購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；SYBR Premix-ExTaqTM購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自加拿大Fermentas公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；引物由寶生物工程（大連）有限公司代為設(shè)計(jì)、合成。主要儀器:生物安全柜，Haier公司產(chǎn)品；超微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge5415R），德國(guó)eppendorf公司產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀（7900HT），美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，北京賽百奧科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 藥物及制備 甘露消毒丹（以下簡(jiǎn)稱“甘全方”）:劑量參照《方劑學(xué)》［7］記載:飛滑石15 g，綿茵陳11 g，淡黃芩10 g，石菖蒲6 g，木通5 g，川貝母5 g，藿香4 g，白蔻仁4 g，連翹4 g，射干4 g，薄荷4 g。甘露消毒丹清熱解毒殘方（以下簡(jiǎn)稱“清殘方”）:淡黃芩10 g，薄荷4 g，連翹4 g，川貝母5 g，射干4 g。甘露消毒丹化濁利濕殘方（以下簡(jiǎn)稱“利殘方”）:飛滑石15 g，綿茵陳11 g，木通5 g，白蔻仁4 g，石菖蒲6 g，藿香4 g。以上藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供，請(qǐng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)潘清平教授鑒定。按中藥常規(guī)煎煮法煎煮2次，合并2次藥液，制備成藥液（含生藥0.25 g/mL），用濾紙過(guò)濾后再以0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，4℃保存。利巴韋林注射液:規(guī)格100 mg/mL，江蘇蘇星制藥有限公司產(chǎn)品（批號(hào)0110409），以蒸餾水配制成3 mg/mL溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測(cè)方法 1）病毒毒力測(cè)定。計(jì)算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量 TCID50 （Reed-Muench法），實(shí)驗(yàn)采用100TCID50。具體測(cè)定步驟見(jiàn)課題組前期研究［2-3］。2）藥物細(xì)胞毒性測(cè)定（MTT法）。計(jì)算其細(xì)胞存活率（以不同濃度藥物的OD值計(jì)算），以細(xì)胞存活率（%）為縱坐標(biāo)、藥物濃度為橫坐標(biāo)（g/mL）繪非線性回歸曲線。以90%細(xì)胞存活率濃度為各藥的實(shí)驗(yàn)濃度。具體步驟見(jiàn)課題組前期研究［2-3］。3）藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)。取RD細(xì)胞接種于無(wú)菌6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，置入35℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后吸棄培養(yǎng)液，每孔接種病毒液50 μL，輕混，待吸附1.5 h后吸棄病毒液，將90%細(xì)胞存活率濃度的甘全方、清殘方、利殘方、利巴韋林藥液50 μL與50 μL維持液混合，分別加到RD細(xì)胞上，各設(shè)4復(fù)孔，另每孔均設(shè)模型對(duì)照組、正常細(xì)胞對(duì)照組，正常細(xì)胞對(duì)照組孔內(nèi)加維持液100 μL，病毒對(duì)照孔內(nèi)接種病毒液50 μL，吸附1.5 h后吸棄病毒液，加入維持液100 μL。第24小時(shí)收集細(xì)胞，加入TRIzol，待RT-PCR法檢測(cè)miRNA-155的相對(duì)表達(dá)。4）RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miRNA-155的相對(duì)定量值（RQ）。采用TRIzol法分別提取甘全方組、清殘方組、利殘方組、利巴韋林組、模型對(duì)照組、正常細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞總RNA，將所提取的總RNA用超微量紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定260 nm和280 nm處吸光度（A）值，計(jì)算各組OD260/OD280值，若樣品純度符合實(shí)驗(yàn)要求，則進(jìn)行基因檢測(cè)。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒與miRNA-155與U6反轉(zhuǎn)錄酶引物，以37℃30 min，65℃10 min，42℃60 min，70℃5 min進(jìn)行孵育合成cRNA，-20℃保存。采用miR-155及U6的SYBR Premix Ex Taq進(jìn)行擴(kuò)增，總體系30 μL，分三重復(fù)孔，95℃30 s，95℃5 s，60℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)（熒光定量PCR）。采用2-△△Ct方法，以第1個(gè)樣為1，計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)定量值（RQ）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。各檢測(cè)RQ值換算成（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，若方差齊性則進(jìn)一步組間兩兩比較用t檢驗(yàn)。若方差不齊，則用非參數(shù)檢驗(yàn)的Tamhane′s T2法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病毒毒力測(cè)定 根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算得出TCID50=10-2.89/mL，詳細(xì)數(shù)值報(bào)告見(jiàn)前期研究［2-3］。

2.2 藥物細(xì)胞毒性測(cè)定 根據(jù)各藥物不同濃度的OD值，以細(xì)胞存活率（%）為縱坐標(biāo)、藥物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（g/mL）繪出非線性回歸曲線，通過(guò)回歸曲線獲得各實(shí)驗(yàn)用藥90%細(xì)胞存活率質(zhì)量濃度分別為:甘露消毒丹0.0037 g/mL，清殘方0.0020 g/mL，利殘方0.0081 g/mL，利巴韋林0.64 mg/mL。回歸曲線圖見(jiàn)前期研究［2-3］。

2.3 RNA電泳圖 見(jiàn)圖1。

圖1 RNA電泳圖

2.4 RNA鑒定 見(jiàn)表1。OD260/OD280比值均在1.8～2.0之間，說(shuō)明RNA純度符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.5 各組細(xì)胞中miRNA-155相對(duì)定量值 miR-155和U6的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2～圖3。按照2-△△Ct方法，以第一個(gè)樣為1，計(jì)算miR-155的相對(duì)定量值（RQ），結(jié)果見(jiàn)表2。模型對(duì)照組、甘全方組、清殘方組、利巴韋林組miRNA-155表達(dá)均比正常對(duì)照組低 （P＜0.05或P＜0.01），而利殘方組比正常細(xì)胞對(duì)照組高（P＜0.01）；甘全方組、清殘方組、利殘方組miRNA-155的表達(dá)均比模型對(duì)照組高（P＜0.05或P＜0.01），病毒唑組與模型對(duì)照組差異不明顯；清殘方組、利殘方組miRNA-155表達(dá)比甘全方組升高（P＜0.05或P＜0.01），利殘方組的表達(dá)比清殘方組高（P＜0.01）；病毒唑組的表達(dá)則比甘全方組、清殘方組與利殘方組低 （P＜0.05或P＜0.01）。

表1 RNA鑒定結(jié)果

圖2 miR-155擴(kuò)增曲線（n=3）

圖3 U6擴(kuò)增曲線

表2 各組miR-155 RQ值（±s）

表2 各組miR-155 RQ值（±s）

與正常細(xì)胞對(duì)照組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與甘全方組比較，○P＜0.05，○○P＜0.01；與清殘方組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01；與利殘方組比較，＆P＜0.01。

組別 n miR-155模型對(duì)照組 3 1.00±0.15□□正常細(xì)胞對(duì)照組 3 1.55±0.05甘全方組 3 1.28±0.07□△利殘方組 3 1.42±0.04□△△○清殘方組 3 1.93±0.19□□△△○○※※利巴韋林組 3 1.06±0.05□□○※※＆

3 討 論

EV71感染造成機(jī)體損害主要是其引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)血管變態(tài)反應(yīng)和組織炎癥病變。有研究對(duì)手足口病死亡患者進(jìn)行尸檢發(fā)現(xiàn)腦干和脊髓存在廣泛炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，合并肺水腫的手足口病患者輔助T淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）明顯低于無(wú)肺水腫的患者，而輕型手足口病與重型手足口病比較，體液免疫中的中和抗體無(wú)明顯差異［7］，這些都提示手足口病時(shí)機(jī)體出現(xiàn)明顯的免疫反應(yīng)，其中造成機(jī)體損害的主要是細(xì)胞免疫。

microRNA是內(nèi)源性非編碼RNA，其靶基因十分廣泛，可以調(diào)節(jié)代謝、免疫、增殖、分化和癌變等多種生物學(xué)過(guò)程，其中miR-155是可以同時(shí)被細(xì)菌和病毒激活的miRNA，它可參與B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的分化、活化，是維持正常免疫功能必須的因子，能在病毒和細(xì)菌感染的初始免疫中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)炎癥應(yīng)激狀態(tài)下由于TLR配體和前炎癥因子的作用，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞miR-155表達(dá)增高［8-10］，而miR-155基因敲除鼠T細(xì)胞依賴的抗體反應(yīng)以及細(xì)胞因子產(chǎn)生減少［11］，同時(shí)樹(shù)突細(xì)胞的抗原呈遞功能受限［12］等，都說(shuō)明miR-155參與調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥過(guò)程［13］。

中藥治療病毒感染性疾病除了直接抗病毒外也有間接調(diào)節(jié)作用，主要是調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫防御系統(tǒng)，如增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫、增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性等。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)甘露消毒丹及其殘方能直接抗EV71［2-3］，那么它們是否也能通過(guò)調(diào)節(jié)micro RNA來(lái)調(diào)節(jié)EV71感染后的機(jī)體免疫？為此我們進(jìn)一步開(kāi)展本實(shí)驗(yàn)，觀察甘露消毒丹及其殘方對(duì)miR-155表達(dá)的影響。但是研究結(jié)果卻顯示RD細(xì)胞在感染EV71后miR-155表達(dá)下降。有文獻(xiàn)報(bào)道用脂多糖刺激小鼠THP-1細(xì)胞或巨噬細(xì)胞后，miR-155表達(dá)增加［14］，體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)單核/巨噬細(xì)胞在炎癥因子作用下誘導(dǎo)miR-155高表達(dá)［4］等，與我們觀察到的EV71感染機(jī)體后miR-155下降的趨勢(shì)相反，這也許是因?yàn)椴煌≡⑸锔腥竞蟮淖R(shí)別受體與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不同，也可能與microRNA的表達(dá)具有組織和細(xì)胞特異性相關(guān)，正如有研究發(fā)現(xiàn)脂多糖刺激THP-1細(xì)胞后miR-146a/b表達(dá)升高［15］，而刺激B細(xì)胞和T細(xì)胞后miR-146a/b表達(dá)減少［16］，這或許也提示miRNA調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的機(jī)制并非單一線性機(jī)制。

同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)甘露消毒丹及其殘方均能以不同程度上調(diào)miR-155的表達(dá)，這提示甘露消毒丹及其殘方可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-155而調(diào)控免疫反應(yīng)，而病毒唑則未能表現(xiàn)出相似的調(diào)控作用。我們前一部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘露消毒丹能從EV71復(fù)制的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮抗EV71的作用［2-3］，而本部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘露消毒丹能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-155來(lái)調(diào)節(jié)免疫，可見(jiàn)甘露消毒丹治療EV71感染的作用是多重的，這也正好體現(xiàn)了中醫(yī)復(fù)方多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)特點(diǎn)。

但RD細(xì)胞感染EV71后miR-155為什么是下降，miR-155下降后是通過(guò)哪條途徑來(lái)影響EV71感染引起的免疫反應(yīng)、效應(yīng)如何，甘全方、清殘方、利殘方又是通過(guò)怎樣的通路上調(diào)miR-155、如何發(fā)揮良性治療作用，這些在本實(shí)驗(yàn)中都無(wú)法作出說(shuō)明，還須更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

此外，甘全方、清殘方、利殘方3方之中，利殘方調(diào)節(jié)miR-155作用最明顯，甘全方的調(diào)節(jié)作用最弱，這與前一部分實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的甘全方抗病毒作用反而弱于清殘方［2］有相似之處，這提示我們無(wú)論在抗EV71方面還是在免疫調(diào)節(jié)方面，利殘方與清殘方之間都可能存在相互拮抗的關(guān)系，若對(duì)這種拮抗關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步研究，對(duì)揭示中醫(yī)復(fù)方配伍的奧秘將會(huì)是一件非常有意義的事。

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Effects of Ganlu Xiaodu Decoction on the Expression of MiR-155 in EV71 Infected Cells

HE Yirong，HEYoushun，CAO Rong，et al. Institute of Traditional Chinese Medicine of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410000，China.

Objective:To observe Ganlu Xiaodu decoction and its incomplete prescriptions'effects on MiR-155's expression in RD cells infected by EV71.Methods:With technique of cell culturing，Ganlu Xiaodu decoction therapy group，incomplete Qing prescription therapy group，incomplete Li prescription therapy group，normal cells control group，model control group and ribavirin control group were set，and then the expressions of miR-155 in these groups after intervention with drugs in 24 hours were detected by RT-PCR.Results:1）Compared with normal cells control group，expression of miR-155 of model control group，Ganlu Xiaodu decoction therapy group，incomplete Qing prescription therapy group and ribavirin control group all decreased，but that of incomplete Li prescription therapy group increased.2）Levels of miR-155 in Ganlu Xiaodu decoction therapy group，incomplete Qing prescription therapy group and incomplete Li prescription therapy group were higher than model control group，but ribavirin control group had no significant difference with model control group.3）Levels of miR-155 in Ganlu Xiaodu decoction therapy group，incomplete Qing prescription therapy group and incomplete Li prescription therapy group were higher than ribavirin control group，and levels of miR-155 in incomplete Qing prescription therapy group and incomplete Li prescription therapy group were higher than Ganlu Xiaodu decoction therapy group，and level of miR-155 in incomplete Li prescription therapy group was the highest.Conclusion:Expression of miR-155 in EV71-infected RD cells decreases；the result is not consistent with what other literature reported，which indicates that expression of miR-155 may have cell specificity.Ganlu Xiaodu decoction，its incomplete Qing prescription and incomplete Li prescription all can regulate the immune reactions caused by infection of EV71 by increasing miR-155′s expression.And there probably are antagonism effects between incomplete Qingprescription and incomplete Li prescription.

Ganlu Xiaodu decoction；Incomplete prescription；EV71；MicroRNA-155

·研究報(bào)告·

R512.5

A

1004-745X（2016）10-1840-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.10.003

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173188）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)“中醫(yī)經(jīng)典理論與經(jīng)方應(yīng)用研究”科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

△（電子郵箱：cz_abc0719@163.com）

（2016-02-15）