5種外來動物疫病并聯(lián)熒光定量PCR檢測方法的研 究

于恒智，劉　曄，程　瑋，張旭東，苗富春，趙　丹，張守峰，劉芳伊，牛文博

（1. 錦州出入境檢驗檢疫局，遼寧錦州　121013；2. 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春　130122； 3. 遼寧省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué) 校，遼寧錦州　121001）

技術(shù)支撐

5種外來動物疫病并聯(lián)熒光定量PCR檢測方法的研 究

于恒智1，劉曄2，程瑋3，張旭東1，苗富春2，趙丹3，張守峰2，劉芳伊1，牛文博1

（1. 錦州出入境檢驗檢疫局，遼寧錦州121013；2. 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春130122； 3. 遼寧省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué) 校，遼寧錦州121001）

根據(jù) GenBank 中發(fā)表的相關(guān)病毒的基因序列，通過分析比較小反芻獸疫病毒（PPRV）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、西尼羅河熱病毒（WNV）、亨德拉病毒（HeV）和尼帕病毒（NiV）的保守區(qū)域（PPRV的N基因、ASFV的P72基因、HeV和NiV的H基因，以及WNV的PrM基因），各設(shè)計篩選出一套特異性引物和Taqman探針，建立了5種外來動物疫病并聯(lián)熒光定量RT-PCR檢測方法。利用該方法，對103份樣本進(jìn)行了臨床檢測，結(jié)果除陽性對照外，其他均為陰性。檢測結(jié)果驗證了本研究建立的Taqman模式并聯(lián)熒光定量PCR檢測方法具有鑒別診斷的特點，可以作為臨床檢測這5種病原體的參考方法。

外來動物疫?。盒》雌c獸疫病毒；非洲豬瘟病毒；西尼羅河熱病毒；亨德拉病毒；尼帕病毒；熒光定量PCR

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）、西尼羅河熱（West Nile fever，WN）、尼帕?。∟ipah）以及亨德拉?。℉endra）在我國境內(nèi)均未發(fā)生過疫情，小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR）近幾年剛傳入我國。這5種外來動物疫病在全球范圍內(nèi)屬于烈性、易感染傳染病，并且具有傳播范圍及宿主范圍不斷擴(kuò)大的趨勢。除ASF和PPR外，其他3種疫病均屬于人獸共患傳染病，不僅對動物，還對人類產(chǎn)生了威脅。非洲豬瘟病毒是非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種蟲媒傳播的DNA病毒，其宿主范圍廣，幾乎能感染所有種類的豬，是目前世界范圍對于養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的病毒之一［1］。西尼羅河熱病毒是黃病毒科、黃病毒屬成員，與日本乙型腦炎病毒、圣路易腦炎病毒、墨累溪谷腦炎病毒等同屬日本腦炎病毒復(fù)合群。西尼羅河熱已先后在非洲、亞洲和歐洲的20多個國家或地區(qū)流行，每次流行都有人類死亡。2012年美國再次發(fā)生大規(guī)模的西尼羅河熱流行，超過4 500人感染，183人死亡［2］。亨德拉病最早于1994年在的澳大利亞昆士蘭布利斯班郊區(qū)的亨德拉鎮(zhèn)被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時有20匹賽馬發(fā)病，13匹死亡，馴馬師和養(yǎng)馬員也被感染，次年9月馴馬師死亡。尼帕病于1998年首次發(fā)現(xiàn)于馬來西亞尼帕小鎮(zhèn)，當(dāng)時發(fā)現(xiàn)豬和人感染此病，人類的死亡率達(dá)40%，絕大多數(shù)患者為養(yǎng)豬場或屠宰場工人。亨德拉病毒和尼帕病毒同屬于副黏病毒科、副黏病毒亞科、亨尼帕病毒屬成員，被稱為新發(fā)烈性人獸共患傳染病。小反芻獸疫病毒最早于1945年發(fā)現(xiàn)于西非的法國殖民地象牙海岸科特迪瓦，感染后的發(fā)病率可達(dá)100%，嚴(yán)重暴發(fā)期致死率可高達(dá)100%［3］。小反芻獸疫病毒是副黏病毒科、麻疹病毒屬，因?qū)π》雌c危害巨大而引起全球重視。

本研究通過GenBank中登錄的相關(guān)病毒的序列，經(jīng)過對比，篩選出保守序列進(jìn)行人工合成，將合成序列插入到pUC57中構(gòu)成重組質(zhì)粒，以此作為熒光定量PCR的模板，使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計引物和Taqman探針，并采用簡并堿基提高檢測范圍，建立了這5種病原Taqman模式的并聯(lián)熒光定量PCR方法。

1　材料與方法

1.1 材料

rTaq及瓊脂糖購自TaKaRa；37 ℃恒溫細(xì)菌搖床購自上海天呈實驗儀器制造有限公司；小提質(zhì)粒試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；臺式離心機(jī)購自德國SIGMA公司；小型低速離心機(jī)購自北京百晶生物科技有限公司；熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

Amp+抗性的LB液體培養(yǎng)基：Tryptone 10 g、Yeast Extract 5 g、NaCl 10 g，加入800 mL去離子水充分?jǐn)嚢枞芙?，滴? N NaOH，調(diào)節(jié)pH至7.0后，定容至1 L，然后高溫高壓滅菌，冷卻至室溫后，加入1 mL Amp+（100 mg/mL）混合均勻后分裝，4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因序列的比對與合成。根據(jù)GeneBank中登錄的小反芻獸疫病毒（PPRV）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、西尼羅河熱病毒（WNV）、亨德拉病毒（HeV）及尼帕病毒（NiV）的基因序列，選擇各自保守的基因序列（PPRV的N蛋白部分基因序列、ASFV P72蛋白部分基因序列、NiV及HeV 的H蛋白部分基因序列和WNV PrM蛋白部分基因序列）由南京進(jìn)瑞斯生物科技有限公司合成，合成序列大小在350～550 bp之間（表1）。

表1　5種主要外來病病毒基因序列合成明細(xì)

1.2.2 引物及探針的設(shè)計與合成。利用Primer Express 3.0軟件，針對各合成基因片段，設(shè)計相應(yīng)的引物及Taqman探針；選擇Tm值相近且較好的引物和Taqman探針，根據(jù)GenBank中登錄的各病毒相關(guān)序列比對結(jié)果，將有差異的序列用簡并堿基替代，以設(shè)計針對多數(shù)病毒株的引物和Taqman探針。每條引物和Taqman探針中最多含有3個簡并堿基，Taqman探針的5' 端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)6-羧基熒光素（6-carboxyfl uorescein，F(xiàn)AM），3' 端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)6-羧基四甲基諾丹明（6-carboxy-N，N，N'，N'-tetramethylrhodamine，TAMRA）。將設(shè)計完成的引物和Taqman探針?biāo)蜕锕具M(jìn)行合成（表2）。

表2　5種主要外來病病毒相關(guān)基因引物及Taqman探針

1.2.3 Taqman模式的并聯(lián)熒光定量PCR條件的優(yōu)化。根據(jù)引物的Tm值調(diào)節(jié)退火溫度，并對退火時間、循環(huán)次數(shù)、引物及探針的量、模板的量、PCR體系和循環(huán)方式進(jìn)行優(yōu)化，選擇擴(kuò)增效果最佳的方法進(jìn)行下一步試驗。

1.2.4 Taqman模式的并聯(lián)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。使用重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行1 0倍的倍比稀釋，以對應(yīng)濃度100～10-4ng/μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行Taqman模式的并聯(lián)熒光定量PCR試驗。其中每個標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度6個重復(fù)。以Cq值為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度為x軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和反應(yīng)相關(guān)系數(shù)。

1.2.5 鑒別診斷試驗。小反芻獸疫病毒屬副黏病毒科成員，故選擇犬瘟熱病毒、雞新城疫病毒來檢測引物及Taqman探針的特異性；同理，非洲豬瘟病毒選擇典型豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬藍(lán)耳病病毒，尼帕病毒和亨德拉病毒以及西尼羅病毒選擇蝙蝠病毒，進(jìn)行相關(guān)引物和Taqman探針的特異性檢測。

1.2.6 靈敏度試驗。將人工合成的小反芻獸疫病毒、非洲豬瘟病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒以及西尼羅病毒的相關(guān)基因所在的質(zhì)粒作為模板，并對其進(jìn)行10倍的倍比稀釋，使其濃度分別為100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/ μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/ μL、10-4ng/μL。在相同條件下對不同濃度的模板量進(jìn)行熒光定量PCR，觀察并分析結(jié)果。

1.2.7 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗。分別對這5種病毒合成基因的Taqman模式的并聯(lián)熒光定量PCR進(jìn)行組間及組內(nèi)的重復(fù)性試驗。組間試驗為分別于1個月、2個月和3個月，從同一管樣品中取出模板，進(jìn)行Taqman模式的并聯(lián)熒光定量PCR；組內(nèi)試驗是每次進(jìn)行Taqman模式的并聯(lián)熒光定量PCR時，每個樣品進(jìn)行6個重復(fù)，觀察并分析結(jié)果。

1.2.8 檢測方法的初步應(yīng)用。從吉林通化、江西等地采集45份食蟲蝙蝠樣品進(jìn)行西尼羅河病毒、亨德拉病毒及尼帕病毒檢測；從吉林、廣東廣州等地采集38份豬樣品進(jìn)行非洲豬瘟病毒檢測；從河北收集20份綿羊和山羊分泌物病料進(jìn)行小反芻獸疫病毒檢測。

2　結(jié)果

2.1 并聯(lián)熒光定量PCR條件優(yōu)化結(jié)果

為獲得引物和Taqman探針的最佳擴(kuò)增效果和最高敏感性，對擴(kuò)增的條件進(jìn)行了摸索和調(diào)整，最終確定了本試驗的擴(kuò)增體系為rTaq 10 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Taqman探針0.5 μL，4dH2O 6.5 μL，總體系20 μL。最佳擴(kuò)增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以100～10-4ng/μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行Taqman模式的并聯(lián)熒光定量PCR試驗。其中每個標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度6個重復(fù)。以Cq值為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度為x軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。ASFV標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.800，反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)為0.947，計算公式為Y= -3.800X+0.947（圖1）；HeV標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-2.968，反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)為0.964，計算公式為Y=-2.968X+0.964（圖2）；NiV標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-2.489，反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)為0.809，計算公式為Y= -2.489X+0.809（圖3）；PPRV標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.572，反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)為0.969，計算公式為Y= -3.572X+0.969（圖4）；WNV標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.698，反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)為0.966，計算公式為Y=3.698X+0.966（圖5）。其中反應(yīng)相關(guān)系數(shù)的計算方式為斜率平方的倒數(shù)。

2.3 鑒別診斷試驗結(jié)果

通過鑒別診斷試驗證明，PPRV、ASFV、HeV的第1對引物和Taqman探針較好，NiV和WNV第2對引物和Taqman探針效果較好（圖6～10）。

2.4 靈敏度試驗結(jié)果

圖1　ASFV標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2　HeV標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3　NiV標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4　PPRV標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5　WNV標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6　ASFV第1套引物和Taqman探針的鑒別診斷試驗試驗

圖7　HeV第1套引物和Taqman探針的特異性試驗

圖8　NiV第2套引物和Taqman探針鑒別診斷試驗試驗

圖9　PPRV第1套引物和Taqman探針鑒別診斷試驗試驗

圖10　WNV第2套引物和Taqman探針鑒別診斷試驗試驗

以PPRV、ASFV、HeV、NiV和WNV相關(guān)基因陽性質(zhì)粒為模板，經(jīng)1～10-6稀釋后進(jìn)行Taqman模式的并聯(lián)熒光定量PCR檢測，以確定此體系的靈敏度。結(jié)果顯示，這5種病毒的檢測靈敏度均可達(dá)到10-3ng/μL（圖11～15）。

2.5 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗

圖11　ASFV第1套引物和Taqman探針靈敏度試驗

圖12　HeV第1套引物和Taqman探針靈敏度試驗

圖13　NiV第2套引物和Taqman探針靈敏度試驗

圖14　PPRV第1套引物和Taqman探針靈敏度試驗

圖15　WNV第2套引物和Taqman探針靈敏度試驗

陽性樣品于-20 ℃保存，分別于1個月、2個月、3個月取出，對其10-5倍稀釋后進(jìn)行Taqman模式的并聯(lián)熒光定量PCR檢測，每個樣品重復(fù)3次。結(jié)果顯示，PPRV的Ct值平均數(shù)為17.27±0.47，ASFV的Ct值平均數(shù)為16.34±0.20，HeV的Ct值平均數(shù)為16.03±0.57，NiV的Ct值平均數(shù)為29.02±0.56，WNV的Ct值平均數(shù)為16.88±0.13。5種病毒的Ct值平均數(shù)差異均不顯著，說明陽性重組質(zhì)粒完整性良好，無降解。

2.6 檢測方法的初步應(yīng)用

用HeV、NiV和WNV的相應(yīng)引物和Taqman探針，對采集的45份蝙蝠樣品的cDNA進(jìn)行檢測，用PPRV的引物和Taqman探針對20份羊分泌物的cDNA樣品進(jìn)行熒光定量PCR的檢測，用ASFV的引物和Taqman探針對38份豬脾、肺、腎樣品DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明，除陽性對照外，其他樣品檢測均為陰性。（圖16～20）

圖16　ASFV樣品檢測

圖17　HeV樣品檢測

圖18　NiV樣品檢測

圖19　PPRV樣品檢測

圖20　WNV樣品檢測

3　討論

目前，對ASFV、PPRV、HeV、NiV和WNV的研究很多，用于檢測這幾種病毒的方法也很多，尤其在有這幾種病毒流行的地區(qū)和國家。無論是針對病原體，還是針對這幾種病原體的抗體，檢測方法一般比較成熟?，F(xiàn)階段，我國除了有PPRV的報道以外，ASFV、HeV、NiV和WNV在我國均未發(fā)生過。為防患于未然，我國科研人員對ASFV、HeV、NiV和WNV建立了很多檢測方法。對ASFV，馬世東［4］開發(fā)了間接ELISA診斷試劑盒，王華等［5］建立了LAMP檢測等方法。對NiV，郭麗霞［6］建立了熒光RT-PCR等方法。對WNV，于萍［7］建立了巢式RTPCR和熒光定量RT-PCR等方法。國內(nèi)對于HeV研究較少?？赡苁且驗樵摬《灸壳皟H在澳大利亞流行，且對人的感染率和死亡率較NiV低，傳入我國的風(fēng)險較小。但不論國內(nèi)還是國外，對于這5種病毒的檢測方法研究多數(shù)僅限于針對單種病毒，還沒有將這5種疾病的檢測方法進(jìn)行并聯(lián)研究。本研究根據(jù)PPRV、ASFV、HeV、NiV和WNV的基因序列，通過NCBI中Blast比對，并結(jié)合他人的研究內(nèi)容，選擇這5種病毒基因組中相對保守的序列進(jìn)行人工合成，并根據(jù)合成序列，利用Primer Express 3.0軟件進(jìn)行引物和Taqman探針的設(shè)計，采用簡并堿基增加其檢測范圍，每條引物和探針使用2～3個簡并堿基，以避免非特異性反應(yīng)的增加。

在這5種病原體中，由于PPRV是我國嚴(yán)格控制的病毒，因此本研究選擇合成病毒的部分基因作為研究內(nèi)容，既避免了病毒的外散，又得到了研究所需資源。ASFV、HeV、NiV和WNV在我國尚未發(fā)現(xiàn)，因此只能人工合成研究所需基因片段與PPRV的基因片段一起進(jìn)行建立并聯(lián)的Taqman模式的熒光定量PCR方法。

在沒有得到確定病毒毒種的情況下，引物和探針的設(shè)計不免具有一定的局限性，特別是對我國目前尚未發(fā)現(xiàn)的病毒。對于這些病毒的研究也只能通過它們的流行史及地區(qū)分布進(jìn)行推測，選擇風(fēng)險較大的毒株作為參考毒株建立檢測方法。本研究所建立的方法均以DNA/cDNA為模板，因此在實際應(yīng)用中需要提取病毒的RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。本研究建立的方法在臨床樣品的初步應(yīng)用中效果良好。除陽性對照外，其他樣品均呈現(xiàn)陰性結(jié)果。以往的檢測方法多針對的是單一病原，檢測范圍較小。本研究采用并聯(lián)熒光定量PCR方法同時檢測多種病毒，建立的方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好及重復(fù)性強(qiáng)的特點，為我國對小反芻獸疫、非洲豬瘟、西尼羅河熱、亨德拉病、尼帕病的檢測提供了一個具有一定參考意義的方法。

［1］ 王功民，田克恭. 非洲豬瘟［M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：236-239.

［2］ 于萍，魏榮，王志亮，等. 西尼羅病毒蚊媒的種類、研究進(jìn)展及監(jiān)控措施［J］.中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2005，16（4）：324-327.

［3］ 李林，吳曉東，包靜月，等. 小反芻獸疫病毒RT-LAMP檢測方法的建立［J］. 中國動物檢疫，2010，27（4）：32-41.

［4］ 馬世東. 非洲豬瘟的間接ELISA診斷試劑盒的研究［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2000.

［5］ 王華，王君瑋，徐天剛，等. 非洲豬瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增診斷方法建立［J］. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2010，40（9）：940-944.

［6］ 郭麗霞，陳繼明，孫承英，等. 尼帕病毒TaqMan熒光RT-PCR檢測方法的建立［C］//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會. 2006學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）. 北京：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會，2006：615-619.

［7］ 于萍. 西尼羅病毒巢式RT-PCR和熒光定量RT-PCR兩種檢測方法的建立［D］. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2005.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Development of Parallel Fluorescene Quantitative PCR for Detection of the Five Exotic Animal Diseases

Yu Hengzhi1，Liu Ye2，Cheng Wei3，Zhang Xudong1，Miao Fuchun2，Zhao Dan3，Zhang Shoufeng2，Liu Fangyi1，Niu Wenbo1
（1. Jinzhou Entry-exit Inspection and Quatantine Bureau，Jinzhou，Liaoning 121013；2. Military Veterinary Research Institute of the Academy of Military Medical Sciences，Changchun，Jilin 130122；3. Agricultural Economy School of Liaoning Province，Jinzhou，Liaoning 121001）

According to the gene sequences of related viruses reported in Genbank，primers and probes were designed based on the conservative region of Peste des petits ruminants virus（PPRV）African swine fever virus（ASFV），West Nile fever virus（WNV），Hendra virus（HeV）and Nipah virus（NiV）（the conservative regions were N gene of PPRV，p72 gene of ASFV，H gene of HEV and NIV，and PRM gene of WNV，respectively）. After screening a set of specifi c primers and a TaqMan probe，a real-time fl uorescene quantitative PCR for detection of the above fi ve exotic animal diseases was established. The clinical detection results of 103 samples used this method showed that all the samples were tested negative except the positive control，which verifi ed the parallel fl uorescene quantitative PCR of Taqman mode established in this study has characterisitics of differential diagnosis. The method can be used as a reference method for clinical detection of above-mentioned fi ve kinds of pathogens.

exotic animal diseases；Peste des petits ruminants virus（PPRV）；African swine fever virus（ASFV）；West Nile fever virus（WNV）；Hendra virus（HeV）；Nipah virus（NiV）；fl uorescene quantitative PCR

S851.3

B

1005-944X（2016）11-0079-07

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.022

遼寧檢驗檢疫局科研計劃項目（LK07-2015）