種植體聯(lián)合骨組織工程技術(shù)修復(fù)犬下頜骨節(jié)段缺損的實(shí)驗(yàn)研究

李東　毛豪麗　白珊珊　袁捷　韋敏　張文杰　劉偉　曹誼林

種植體聯(lián)合骨組織工程技術(shù)修復(fù)犬下頜骨節(jié)段缺損的實(shí)驗(yàn)研究

李東毛豪麗白珊珊袁捷韋敏張文杰劉偉曹誼林

目的觀察應(yīng)用種植體聯(lián)合骨組織工程技術(shù)，修復(fù)犬下頜骨節(jié)段缺損的效果。方法體外擴(kuò)增培養(yǎng)、成骨誘導(dǎo)犬BMSCs。將第2代細(xì)胞復(fù)合珊瑚后修復(fù)犬自體右側(cè)下頜骨3 cm的節(jié)段缺損，術(shù)后32周植入種植體（實(shí)驗(yàn)組n=3）；同時(shí)，以鄰近正常骨植入種植體作為對照（n=3）。植入4周、12周、26周后，分別通過影像學(xué)、大體形態(tài)觀察、組織學(xué)和生物力學(xué)等方法，檢測骨缺損的修復(fù)效果。結(jié)果植入后26周，X線片和CT均顯示種植體與實(shí)驗(yàn)組及對照組骨質(zhì)為良好骨性愈合，實(shí)驗(yàn)組種植體周圍新生骨密度較高。Micro-CT顯示，實(shí)驗(yàn)組骨密度和對照組間無顯著性差別（P＞0.05）。大體觀察見種植體與組織工程骨和正常骨均形成緊密連接。組織學(xué)顯示，實(shí)驗(yàn)組與對照組均有較多成熟骨結(jié)構(gòu)。生物力學(xué)測試結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與正常下頜骨力學(xué)強(qiáng)度無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論自體成骨誘導(dǎo)BMSCs復(fù)合珊瑚形成的組織工程化骨，可較好地修復(fù)犬下頜骨節(jié)段缺損，植入種植體后可進(jìn)一步促進(jìn)骨成熟。

種植體下頜骨修復(fù)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞珊瑚

創(chuàng)傷、感染、腫瘤或先天畸形可導(dǎo)致下頜骨缺損，自體骨移植是目前療效最佳的治療手段，但患者需承受自身供區(qū)的明顯損傷[1-2]，且供區(qū)來源有限，尋求更好的治療方法一直是關(guān)注的焦點(diǎn)[3-6]。組織工程技術(shù)為修復(fù)下頜骨缺損提供了新的思路，Schliephake等[7]利用煅燒牛骨支架，復(fù)合自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bonemarrow stromal cells，BMSC），修復(fù)了羊下頜骨節(jié)段缺損，證明了BMSC作為骨組織工程種子細(xì)胞的可行性，但煅燒骨降解很慢，不完全符合組織工程支架材料的要求。珊瑚一直是臨床廣泛應(yīng)用的骨替代材料，具有良好的骨傳導(dǎo)作用，還有較好的降解性能和力學(xué)強(qiáng)度[8]。我們的前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，成骨誘導(dǎo)的自體BMSC復(fù)合珊瑚構(gòu)建組織工程化骨，可較好地修復(fù)犬下頜骨3 cm的節(jié)段缺損[9]。

由于下頜骨特殊的解剖位置，在臨床以自體骨移植進(jìn)行骨修復(fù)時(shí)，還需考慮恢復(fù)正常的咬牙合關(guān)系，即種植體治療的介入，后者提供了皮質(zhì)骨成熟所要的應(yīng)力環(huán)境，且兩者互為依托。因此，引入種植體技術(shù)對組織工程下頜骨修復(fù)的促進(jìn)作用值得探究。

本研究采用自體BMSCs經(jīng)體外擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化后與珊瑚復(fù)合，修復(fù)犬下頜骨3 cm的標(biāo)準(zhǔn)節(jié)段缺損，32周后植入種植體，評估其對組織工程下頜骨成熟的影響，并對新生骨組織的生物學(xué)特性進(jìn)行檢測，為今后的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

地塞米松、β-磷酸甘油鈉和2-磷酸抗壞血酸（美國，Sigma公司）；雜交犬（上海農(nóng)學(xué)院）；珊瑚（海南三亞產(chǎn)濱珊瑚）；固定鈦板、鈦釘（常州康輝醫(yī)療器有限責(zé)任公司）；種植體（韓國，Implantium公司）。

1.2細(xì)胞-材料復(fù)合物制備

從比格犬髂骨抽取骨髓，離心，獲原代BMSCs，培養(yǎng)純化至第3代后，以1.5×107cells/cm3的密度接種于珊瑚，體外培養(yǎng)后，移植到體內(nèi)下頜骨缺損處。

1.3手術(shù)方法

3只成年雜交犬，體質(zhì)量18～25 K g，術(shù)前8周拔除右側(cè)上下全部前磨牙及第一磨牙，預(yù)防感染。同時(shí)，拔除左側(cè)上下全部前磨牙及第一磨牙（圖1A），作為生物力學(xué)測試的正常下頜骨。5%的戊巴比妥鈉（0.5 ml/kg）麻醉，術(shù)中靜脈滴注青霉素160萬單位抗炎。右側(cè)臥位，頜下皮膚切開進(jìn)入，暴露下頜骨體，置入鈦板，近遠(yuǎn)中各3枚鈦釘固定，線鋸離斷，形成3 cm節(jié)段缺損（圖1B），去除骨膜，局部骨蠟填塞止血。隨后將誘導(dǎo)細(xì)胞BMSC-珊瑚復(fù)合物置入缺損處，逐層關(guān)閉（圖1C）。術(shù)后隔日起青霉素80萬單位肌注（每天2次，3 d），防止感染，流質(zhì)/半流質(zhì)飼養(yǎng)。術(shù)后22周全部拆除鈦板。術(shù)后32周重新作口內(nèi)切口，分別在組織工程骨（實(shí)驗(yàn)組）及其鄰近正常骨（對照組）處隨機(jī)植入種植體，然后關(guān)閉創(chuàng)面（圖1D），術(shù)后抗感染治療同前，進(jìn)半流質(zhì)/普食飼養(yǎng)。

圖1　手術(shù)步驟Fig.1 Operation description

1.4影像學(xué)觀察

植入術(shù)后4周、12周、26周行X線攝片，觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組種植體與骨質(zhì)愈合情況；植入術(shù)后26周，采用GE Lightspeed Ultra 16 CT儀，掃描厚度0.625 mm，攝取犬顱頜面斷層影象，并行三維骨結(jié)構(gòu)重建。隨后鋸下雙側(cè)下頜骨標(biāo)本，采用Micro-CT測定標(biāo)本局部組織的骨密度，實(shí)驗(yàn)組和對照組采用DUNCAN方法進(jìn)行比較，SAS 6.12行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.5大體形態(tài)結(jié)構(gòu)及組織學(xué)檢測

植入術(shù)后26周，取材觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組大體形態(tài)結(jié)構(gòu)。取1只下頜骨標(biāo)本，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，以聚甲基丙烯酸甲脂包埋，行包括連接處縱切面的硬組織切片，厚度50μm；隨后行苦味酸-品紅Van Gieson染色，觀察新骨形成和材料降解情況，以及種植體與骨質(zhì)愈合情況。

1.6生物力學(xué)檢測

植入術(shù)后26周，取右側(cè)（實(shí)驗(yàn)組+對照組）及左側(cè)正常下頜骨標(biāo)本各3個(gè)，以75%乙醇擦凈、吹干后，采用SHIMADZU AG-1生物力學(xué)測試儀行整骨咬牙合向三點(diǎn)彎曲測試，跨距為30mm，受力截面積設(shè)為長方形，位于植入物中部，加載速度0.5 mm/min。所得數(shù)據(jù)采用配對t檢驗(yàn)，SAS 6.12行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2　結(jié)果

所有犬種植體植入術(shù)后傷口無感染，術(shù)后2 d開始進(jìn)食半流質(zhì)，1周后進(jìn)普食。

2.1影像學(xué)觀察

植入術(shù)后4周、12周、26周，X線片可見種植體與實(shí)驗(yàn)組及對照組骨質(zhì)均為良好的骨性愈合（圖2），而實(shí)驗(yàn)組自12周始種植體局部可見有明顯骨痂形成，26周時(shí)種植體周圍新生骨密度增高。

植入后26周，CT三維重建見種植體與實(shí)驗(yàn)組、對照組骨質(zhì)均愈合，連接緊密無松動（圖3A）。Micro-CT示實(shí)驗(yàn)組骨密度為（630.09±45.57）mg HA/cm3，對照組為（573.71±43.77）mg HA/cm3，實(shí)驗(yàn)組和對照組無明顯差異（P＞0.05），表明實(shí)驗(yàn)組種植體與組織工程骨已愈合，相較種植體與正常骨的愈合無明顯差別。

2.2組織學(xué)檢測

術(shù)后26周，取材可見實(shí)驗(yàn)組種植體均已與組織工程骨形成緊密的骨樣連接；同樣對照組也可見種植體與骨質(zhì)良好結(jié)合（圖3B）。組織學(xué)Van Gieson染色示，實(shí)驗(yàn)組與對照組均有較多哈弗氏系統(tǒng)骨結(jié)構(gòu)，種植體與組織工程骨或正常骨間均為緊密骨性連接，實(shí)驗(yàn)組未見明顯材料殘余（圖4）。

2.3生物力學(xué)檢測

種植體植入術(shù)后26周，實(shí)驗(yàn)組和對照組中央處硬組織的厚度（咬牙合向）和寬度（頰舌向）均無顯著性差別（P＞0.05），兩組所有力學(xué)性能也無顯著性差別（P＞0.05），且最大載荷和最大彎曲強(qiáng)度分別達(dá)到正常下頜骨組（左側(cè)）的89.57%±10.54%（實(shí)驗(yàn)組）和95.35%±12.01%（對照組）。植入種植體前分別為正常下頜骨組（左側(cè)）的（86.37%±12.03%）和（90.80%± 18.81%）[5]，表明組織工程下頜骨力學(xué)強(qiáng)度在種植體植入術(shù)后26周有進(jìn)一步增強(qiáng)（表1）。

圖2　種植體植入后X線片F(xiàn)ig.2 X-Ray after the im plantation

圖3　種植體植入26周標(biāo)本觀察Fig.3 Isolated sample of the canine 26 weeks after im plantation

圖4　術(shù)后26周樣本Van Gieson染色Fig.4 Van Gieson's staining of specimen 26 weeks post-im plantation

表1　下頜骨缺損修復(fù)后相關(guān)生物數(shù)據(jù)（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 1 Biomechanical data of the repaired mandibular defects(x±s)

3　討論

創(chuàng)傷、感染、腫瘤切除等導(dǎo)致的下頜骨缺損較為常見，自體骨移植是目前療效最佳的治療方法[3]，但存在創(chuàng)口感染、血腫形成、神經(jīng)損傷、取骨區(qū)疼痛及繼發(fā)骨折等諸多并發(fā)癥[1-2]。組織工程技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn)，如良好恢復(fù)損傷組織正常結(jié)構(gòu)和功能，支架材料可任意塑形且對供體部位損傷小。所以，研究應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)承力下頜骨缺損有重要意義。

組織工程骨在獲取種子細(xì)胞時(shí)對機(jī)體損傷小，培養(yǎng)擴(kuò)增后數(shù)量充足，易向成骨方向誘導(dǎo)分化，最終復(fù)合可降解支架材料后可形成新生組織工程骨，是目前主要的研究方向[10]。Petite等[11]利用BMSCs復(fù)合珊瑚修復(fù)了羊跖骨節(jié)段缺損，本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用BMSCs復(fù)合珊瑚也成功修復(fù)了羊股骨節(jié)段缺損[8]，表明BMSCs-珊瑚修復(fù)各類節(jié)段骨缺損是可行的。

在此基礎(chǔ)上，我們成功應(yīng)用BMSCs-珊瑚組織工程骨修復(fù)了犬下頜骨3cm的標(biāo)準(zhǔn)節(jié)段缺損[5]，32周時(shí)實(shí)驗(yàn)組骨缺損均已修復(fù)，組織學(xué)證明有成熟板層骨形成，實(shí)驗(yàn)組骨密度和力學(xué)強(qiáng)度與正常組無顯著差別，而考慮到口腔特殊環(huán)境，仍需恢復(fù)并重建下頜骨咬牙合功能。

Boyne等[12]在應(yīng)用BMP-2復(fù)合膠原+鈦網(wǎng)固定修復(fù)靈長類動物半側(cè)下頜骨缺損時(shí)，發(fā)現(xiàn)術(shù)后6個(gè)月局部骨缺損完全修復(fù)，此時(shí)在修復(fù)處植入鈦種植體，再接受8個(gè)月的咬牙合力刺激，觀察到骨密度有顯著提高，且未造成局部骨吸收。這提示我們也可引入種植體修復(fù)技術(shù)來進(jìn)一步促進(jìn)骨成熟。

Chen等[13]先將鈦種植體插入圓柱形的珊瑚支架內(nèi)，后從新西蘭大白兔的髂骨骨髓中分離出BMSCs，再將細(xì)胞種植體支架復(fù)合物移植到裸鼠背部。盡管種植體僅需一步就可成功固定在組織工程骨上，但咬牙合力刺激是否會導(dǎo)致種植體松動仍有爭議。我們認(rèn)為，首先應(yīng)該構(gòu)建組織工程骨，然后植入種植體，這樣種植體才可穩(wěn)定地促進(jìn)組織工程骨的成熟。

本實(shí)驗(yàn)在BMSCs-珊瑚組織工程骨修復(fù)犬下頜骨標(biāo)準(zhǔn)節(jié)段缺損32周后，植入種植體改善咬牙合。植入后26周，X線片和CT顯示，種植體與實(shí)驗(yàn)組及對照組骨性愈合均良好，且實(shí)驗(yàn)組種植體周圍新生骨密度較高。種植體基臺的穩(wěn)定性可能在骨吸收的早期預(yù)測中有非常重要的作用[14]，但在我們的研究中，實(shí)驗(yàn)組和對照組均未觀察到骨吸收，這表明種植體和組織工程骨及正常骨貼合緊密。

實(shí)驗(yàn)組骨密度（630.09±45.57 mg HA/cm3）和對照組間無顯著性差別。大體標(biāo)本見種植體與組織工程骨和正常骨均形成緊密連接。組織學(xué)顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組均有較多哈弗氏系統(tǒng)骨結(jié)構(gòu)，未見明顯材料殘余。生物力學(xué)測試顯示，實(shí)驗(yàn)組與左側(cè)正常下頜骨力學(xué)強(qiáng)度無顯著性差異，且最大彎曲強(qiáng)度達(dá)到左側(cè)正常下頜骨的89.57%±10.54%，高于無咬牙合修復(fù)的組織工程骨（無種植體植入為正常下頜骨的86.37%±12.03%），表明組織工程下頜骨在種植體植入術(shù)后26周成熟度增加，力學(xué)強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)。

本研究證明了BMSCs復(fù)合珊瑚后可較好地修復(fù)犬下頜骨標(biāo)準(zhǔn)節(jié)段缺損，同時(shí)植入種植體后可進(jìn)一步促進(jìn)骨成熟，生物力學(xué)強(qiáng)度增加，我們認(rèn)為此變化可能是咬牙合力刺激所致。

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Research of Repairing Canine Segmental M andibular Bone Defects by Using Im p lant Combining w ith Bone Tissue Engineering

LIDong1,2,MAO Haoli3,BAIShanshan1,YUAN Jie1,WEIMin1,ZHANGWenjie1,2,LIUWei1,2,CAO Yilin1,2. 1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery;2 Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering;3 Department of Anesthesiology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011, China.Corresponding author:YUAN Jie(E-mail:jaman1@126.com);ZHANGWenjie(E-mail:wenjieboshi@yahoo.com.cn).

Objective To investigate the effect of repairing canine segmentalmandibular bone defects by using implant combining with bone tissue engineering.M ethods A 3 cm segmentalmandibular defect was created,and the defect was repaired with cell-scaffold constructs formed by in vitro expanded and osteogenically induced BMSCs(P2)and coral. Implantswere embedded into themandible 32 weeks post-operation(n=3);the samewas disposed for the adjacentmandible as control(n=3).Imaging,gross view,histological and biomechanicalmethodswere taken to detect the repairing effects of the bone defect at 4 weeks,12 weeks,26 weeks respectively after implantation.Results A well implant-osseous healing was identified in both experimental group and control group by X-ray and computed tomography(CT)26 weeks after implantation,while the experimental group showed a higher neogenetic bone density around the implant.Micro-CT indicated no significant density difference between the experimental group and the control group(P＞0.05).Closely connection were formed between the implant and the normal bone as well as the tissue engineered bone.Histologically,lots ofmature bone trabecula was showed in both groups.No significant mechanical-strength difference was found in mandible between thebiomechanical testing group and the normal group(P＞0.05).Conclusion The tissue-engineered bone formed by autologous osteogenic induction of BMSCs and coral can be a favorable remediation of the caninemandible.Additionally,the implanted implant can further promote bonematuration.

Implant;Mandibular reparation;Bonemarrow stromal cells;Coral

Q813.1+2

A

1673－0364（2016）05－0285－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.05.004

國家自然科學(xué)基金（81471886）；上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目（134119a2000）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（李東，白珊珊，袁捷，韋敏，張文杰，劉偉，曹誼林）；200011上海市上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（李東，張文杰，劉偉，曹誼林）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院麻醉科（毛豪麗）。

袁捷（E-mail：jaman1@126.com）；張文杰（E-mail：wenjieboshi@yahoo.com.cn）。

注：李東，毛豪麗為共同第一作者。

（2016年7月24日；

2016年9月10日）