軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)-Ⅱ型膠原納米支架復(fù)合BMSC修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

蔣婷　楊澤龍　李小兵

軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)-Ⅱ型膠原納米支架復(fù)合BMSC修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

蔣婷楊澤龍李小兵

目的觀察軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)（Cartilage acellular extracellularmatrix，CAEM）-Ⅱ型膠原（CollagenⅡ，COLⅡ）納米支架，復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（B onemarrow stem cells，BMSCs）修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。方法CAEM和COLⅡ按質(zhì)量比1∶1混合，通過靜電紡絲技術(shù)制備組織工程納米支架。將第二代BMSCs種植到該支架上，培養(yǎng)箱內(nèi)靜置2 h。12只日本大耳白兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，將細(xì)胞支架復(fù)合物植入實(shí)驗(yàn)組兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處，對(duì)照組僅行膝關(guān)節(jié)軟骨缺損建模。12周后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材，大體觀察修復(fù)效果，并行HE染色、Ⅱ型膠原染色觀察。結(jié)果大體觀察見實(shí)驗(yàn)組軟骨缺損修復(fù)良好，對(duì)照組軟骨缺損處由肉芽樣組織充填。HE染色顯示，實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨缺損處可見軟骨陷窩形成，對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨缺損處僅有纖維組織充填。實(shí)驗(yàn)組修復(fù)區(qū)Ⅱ型膠原染色為陽性，對(duì)照組為陰性。結(jié)論CAEM-COLⅡ納米支架復(fù)合BMSC，對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損具有較好的修復(fù)能力，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

組織工程Ⅱ型膠原軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)軟骨缺損骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)一直是臨床的難題。目前常用的修復(fù)方法主要包括軟骨組織移植、骨膜或軟骨膜移植、軟骨細(xì)胞注射移植、組織工程軟骨及干細(xì)胞移植等，但沒有一種理想的修復(fù)方法能廣泛地應(yīng)用于臨床。種子細(xì)胞、支架及誘導(dǎo)因子是組織工程的三大關(guān)鍵因素。本研究以軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)-Ⅱ型膠原為原料，通過靜電紡絲技術(shù)制備組織工程軟骨納米支架，再將BMSCs種植于支架上并移植于兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處，觀察該支架細(xì)胞復(fù)合物修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的效果。

1　材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

成年日本大耳兔12只，1周齡日本大耳兔2只，由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均通過川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

三氟乙醇（成都貝斯特試劑有限公司），Trition X-100（北京化學(xué)試劑公司），胃蛋白酶（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司），Tris-HCl、高壓電源（天津東文公司），恒流注射泵（保定蘭格公司），乙二胺四乙酸（EDTA）、碳化二亞胺、DNase、RNase、鹽酸胍（Sigma公司，美國(guó)）。

掃描電鏡（Hitachi公司，日本），CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國(guó)），真空干燥箱（上海一恒科技有限公司），F(xiàn)D-1冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康），Biofuge Primo R低溫離心機(jī)（Thermo Scientific，美國(guó)）。

1.2方法

1.2.1脫細(xì)胞基質(zhì)及支架材料的制備

[1]的方法進(jìn)行支架制備，將獲得的支架剪成直徑5 mm圓形，環(huán)氧乙烷消毒備用（圖1）。

圖1　軟骨外基質(zhì)的提取物及納米支架材料Fig.1 Cartilage acellular extracellular matrix and nanofiber scaffold

1.2.2BMSCs的分離培養(yǎng)

10 m L注射器吸入含肝素的生理鹽水2m L，于實(shí)驗(yàn)兔股骨髁處穿刺入股骨髓腔，反復(fù)緩慢輕揉沖洗髓腔，獲取含BMSCs的混懸液。按BMSCs常規(guī)分離培養(yǎng)方法，獲得第2代BMSCs備用。

1.2.3細(xì)胞－材料復(fù)合物移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損

將0.5 m L細(xì)胞密度為2×106cells/mL的BMSCs接種于一個(gè)支架材料上，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。12只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。麻醉后，膝關(guān)節(jié)消毒，膝關(guān)節(jié)外側(cè)髕骨外緣作3 cm切口，分離至關(guān)節(jié)囊，縱行切開關(guān)節(jié)囊，將髕骨向內(nèi)側(cè)脫位，屈曲膝關(guān)節(jié)，顯露股骨髁關(guān)節(jié)面。于股骨髁間處用電鉆作直徑5 mm、深度為3mm大小的圓形全層關(guān)節(jié)軟骨缺損，肉眼見缺損處軟骨下層微出血及無軟骨組織殘余即可。實(shí)驗(yàn)組將細(xì)胞支架復(fù)合物移植于關(guān)節(jié)軟骨缺損處。對(duì)照組行關(guān)節(jié)鉆孔后縫合傷口即可。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素200萬單位預(yù)防感染，每天2次，分籠飼養(yǎng)，自由活動(dòng)。于術(shù)后12周取材檢測(cè)（圖2）。

圖2　修復(fù)缺損模型Fig.2 Repair defectsmodel

取材時(shí)，截取股骨遠(yuǎn)端，觀察關(guān)節(jié)缺損修復(fù)情況。4%多聚甲醛將標(biāo)本固定24 h，脫鈣液脫鈣2周，每周更換脫鈣液2次。常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，分別行HE、CollagenⅡ免疫組化染色，觀察修復(fù)效果。

2　結(jié)果

2.1大體觀察

對(duì)照組兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處可見少量肉芽組織充填，肉芽組織增生水腫，缺損未完全充填；實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)軟骨缺損經(jīng)修復(fù)后關(guān)節(jié)面光滑平整，缺損處由軟骨樣組織完全覆蓋，修復(fù)組織的色澤接近正常關(guān)節(jié)軟骨面，軟骨缺損處完全被充填，塑形良好（圖3）。

圖3　軟骨缺損修復(fù)（箭頭處）大體觀察Fig.3 Gross observation of the defect area(the arrow)

2.2HE染色

對(duì)照組軟骨缺損區(qū)被新生組織充填，以纖維結(jié)締組織，結(jié)構(gòu)紊亂不清，無軟骨樣組織形成；實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)域被新生軟骨樣組織充填，缺損處修復(fù)較平整，其間可見散在軟骨樣細(xì)胞分布，軟骨陷凹形成明顯，基本達(dá)到組織學(xué)修復(fù)（圖4）。

圖4　缺損修復(fù)區(qū)域（箭頭處）HE染色（100×）Fig.4 HE Staining of the defect area(the arrow,100×)

2.3CollagenⅡ免疫組化染色

對(duì)照組修復(fù)組織中CollagenⅡ免疫組化染色不明顯，周圍正常組織區(qū)域CollagenⅡ免疫組化染色呈陽性。實(shí)驗(yàn)組缺損修復(fù)較平整，缺損區(qū)域被修復(fù)組織充填，修復(fù)組織區(qū)域CollagenⅡ免疫組化染色陽性，染色均勻，接近周圍正常軟骨區(qū)域，其間有散在的軟骨陷凹形成及軟骨細(xì)胞分布，與正常的關(guān)節(jié)軟骨相似（圖5）。

圖5　缺損修復(fù)區(qū)域（箭頭處）CollagenⅡ免疫組化染色（100×）Fig.5 Collagen II imm unohistochem ical staining of the defect area(the arrow,100×)

3　討論

由于正常軟骨沒有神經(jīng)血管組織，主要依靠周圍組織滲透或從分泌的滑液中攝取營(yíng)養(yǎng)。軟骨細(xì)胞代謝緩慢，在正常成熟軟骨中幾乎不能見到其有絲分裂。軟骨缺損不超過鈣化層時(shí)，其修復(fù)主要依靠周圍軟骨細(xì)胞的增殖，其增殖速度非常緩慢且有限，其最終結(jié)局為缺損長(zhǎng)期存在,或由于磨損使缺損越來越大。一旦缺損超過鈣化層，會(huì)導(dǎo)致軟骨下骨質(zhì)被損傷，其下方松質(zhì)骨內(nèi)存在的未分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入缺損區(qū)域增殖分化，逐漸形成纖維及軟骨混合組織修復(fù)缺損區(qū)域。但這種機(jī)制不能使軟骨缺損完全修復(fù)，尤其當(dāng)缺損直徑超過4mm時(shí)，將導(dǎo)致永久性病變[2]。

3.1種子細(xì)胞

目前組織工程軟骨重建常用的種子細(xì)胞有BMSC、ADSC、軟骨細(xì)胞等，由于軟骨細(xì)胞自身取材問題，用于組織工程關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)受到明顯的限制。而其他干細(xì)胞，如ADSC，可以通過誘導(dǎo)因子或共培養(yǎng)的方式向軟骨表型細(xì)胞分化增殖[3]，已有用于軟骨缺損修復(fù)獲得成功的報(bào)道[4-6]，但需通過抽吸、手術(shù)等方式獲取。我們選擇BMSC作為種子細(xì)胞，是因?yàn)椋孩貰MSC研究相對(duì)較多，培養(yǎng)技術(shù)成熟；②自體取材方便，可以避免排斥反應(yīng)，臨床應(yīng)用可能性大；③BMSC相對(duì)易于誘導(dǎo)成軟骨樣細(xì)胞，對(duì)軟骨缺損的修復(fù)比較可靠[7-9]。本研究的結(jié)果提示，通過軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)、Ⅱ型膠原制備的支架及關(guān)節(jié)局部的微環(huán)境，將缺損處移植的BMSC成功地誘導(dǎo)成軟骨樣細(xì)胞，并能長(zhǎng)期維持其表型，使其分泌特異性的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，成功修復(fù)了關(guān)節(jié)軟骨缺損。

3.2支架

支架不僅是種子細(xì)胞代謝的場(chǎng)所，還決定著重建組織器官的基本形態(tài)和功能。目前，組織工程支架主要分為天然生物材料、人工合成材料及兩者的混合材料。應(yīng)用人工合成材料，如PGA、PLA、PLGA等復(fù)合種子細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)缺損獲得成功[10-12]。這些材料的生物學(xué)性能可通過化學(xué)、物理修飾進(jìn)行調(diào)節(jié)，具備良好的機(jī)械強(qiáng)度。不過其缺乏細(xì)胞生長(zhǎng)黏附的表面性狀，在體內(nèi)降解后產(chǎn)生的一些低聚物和小分子片段會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不同程度的損傷，并具有一定的細(xì)胞毒性[13-14]，而且降解速度與組織工程化軟骨的形成時(shí)間難以良好匹配，如聚乙酸和聚-α-羥基酯是高親水的聚合物，在5周內(nèi)就有明顯的降解；PLGA具備良好的機(jī)械性能，但其是疏水材料，降解速度緩慢，在體內(nèi)3年后仍有殘留[15]。以天然原料制備的組織工程支架，具有很高的親水性、良好的三維立體纖維結(jié)構(gòu)和特有的表面物質(zhì)，利于軟骨細(xì)胞的黏附和增殖。細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸和氨基聚糖及其衍生物材料具有良好的生物相容性，能支持軟骨細(xì)胞黏附定植，并表達(dá)軟骨特異性蛋白，保持組織工程軟骨結(jié)構(gòu)的完整性。蔣婷等[16]利用Ⅱ型膠原、透明質(zhì)酸、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，通過低溫冷凍干燥法制備的組織工程支架，具有良好的理化及生物學(xué)性能。本研究所采用的軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)及Ⅱ型膠原，較完整地保留了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的生物學(xué)信息，能為BMSC向軟骨樣細(xì)胞方向誘導(dǎo)及表型的維持，提供良好的細(xì)胞外環(huán)境。通過靜電紡絲技術(shù)制備的納米支架，相對(duì)其他制備方法而言，更符合軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的形態(tài)學(xué)構(gòu)架，為細(xì)胞黏附及增殖提供更加廣泛的接觸面積，其細(xì)胞載荷能力顯著提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該支架能有效地誘導(dǎo)及維持軟骨細(xì)胞表型，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。但是該支架的機(jī)械性能相對(duì)不足，需要在以后的研究中進(jìn)一步改進(jìn)。

4　結(jié)論

CAEM-COLⅡ納米支架在兔膝關(guān)節(jié)缺損處能有效地誘導(dǎo)BMSC向軟骨樣細(xì)胞分化,并能較長(zhǎng)時(shí)間維持其表型，使誘導(dǎo)后的細(xì)胞能形成軟骨陷凹。該支架復(fù)合BMSC對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損具有較好的修復(fù)能力，在組織工程軟骨缺損修復(fù)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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CAEM-COLⅡN anofibe r Scaffolds Com posite w ith BM SCs in Repairing Ar ticular Car tilage Defect of Rabbits

JIANG Ting1,YANG Zelong2,LIXiaobin1.1 Department of Burn and Plastic Surgery;2 Department of Orthopaedic Surgery, Nanchong Central Hospital,The Second Clinical College of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,China.

Objective To observe the effect of CAEM-COLⅡnanofiber scaffolds composite with BMSCs in repairing articular cartilage defectof rabbits.Methods Cartilage acellular extracellularmatrix(CAEM)and collagenⅡ(COLⅡ)were mixed according to the ratio of 1∶1,nanofiber scaffolds were prepared by electrostatic spinning for cartilage tissue engineering.The second generations of bonemarrow stem cells(BMSCs)were inoculated onto the scaffolds.The cell scaffold composite was placed in the incubator for two hours.12 Japanese white rabbitswere randomly divided into the experimental group and the control group.In the experimental group,the cell scaffold composite was implanted into the articular cartilage defects of rabbits.In the control group,only the knee joint cartilage defects weremade.After 12 weeks,the animals were sacrificed and the repair effect was observed by gross appearance,HE staining and collagen typeⅡstaining.Resu lts General shape observation showed that cartilage defects in the experimental group were repaired well,and were filled with granulation tissue in the control group.HE staining showed that cartilage cavities formed in articular cartilage defects in the experimental group,and fibrous tissues were filled in the control group.In the repair area,collagen typeⅡstaining was positive in the experimental group,and negative in the control group.Conclusion The CAEM-COLⅡnanofiber scaffolds composite with BMSCs could well repair the articular cartilage defects of rabbits,and have potential of application in tissue engineering cartilage.

Tissue engineering;CollagenⅡ;Mixing cartilage acellular extracellularmatrix;Cartilage defect; Bonemarrow stem cells

Q813.1+2

A

1673－0364（2016）05－0281－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.05.003

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（81301568）；川北醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金（CBY15-QD03）。

637000四川省南充市南充市中心醫(yī)院，川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院燒傷整形美容外科（蔣婷，李小兵），骨科（楊澤龍）。

（2016年4月12日；

2016年5月29日）