雙層細(xì)菌纖維素基組織工程尿道支架的設(shè)計與初步構(gòu)建

李喆　呂向國　王寶秀　馮超　陳仕艷　顏志勇　王華平

雙層細(xì)菌纖維素基組織工程尿道支架的設(shè)計與初步構(gòu)建

李喆呂向國王寶秀馮超陳仕艷顏志勇王華平

目的設(shè)計并構(gòu)筑具有模擬尿道組織微環(huán)境的三維微/納支架材料。方法通過對尿道脫細(xì)胞基質(zhì)多尺度結(jié)構(gòu)分析，設(shè)計仿尿道組織的雙層細(xì)菌纖維素（Baterial cellulose，BC）基微/納組織工程尿道支架。采用模板合成法，以明膠多孔支架為模板，在其上靜態(tài)培養(yǎng)制備兼具微米多孔與納米纖維的雙層BC基微/納支架材料。結(jié)果雙層BC基微/納支架材料的致密層為細(xì)菌纖維素膜，疏松層為相互連通的多孔結(jié)構(gòu)，平均孔徑為（167±56）μm，同時在其微米級孔壁表面修飾著模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix，ECM）結(jié)構(gòu)的納米纖維網(wǎng)絡(luò)，納米纖維直徑為（20～40）nm。結(jié)論采用模板合成法，成功構(gòu)建出了兼具宏觀雙層結(jié)構(gòu)、微米級多孔和納米級纖維的雙層BC微/納組織工程尿道支架。

尿道組織工程脫細(xì)胞基質(zhì)細(xì)菌纖維素多尺度結(jié)構(gòu)

組織工程支架的設(shè)計初衷就是模擬細(xì)胞的體內(nèi)微環(huán)境，包括介觀尺度、微米尺度以及納米尺度的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，能夠影響細(xì)胞的生長[1]。由天然組織經(jīng)脫細(xì)胞處理得到的脫細(xì)胞基質(zhì)是由相互交錯的納米纖維構(gòu)成的兼具微米多孔與納米纖維的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這一微/納結(jié)構(gòu)能夠支持細(xì)胞并且影響細(xì)胞行為，持續(xù)影響細(xì)胞形成組織及器官[2-4]。因此，從結(jié)構(gòu)角度出發(fā)，模擬細(xì)胞體內(nèi)微環(huán)境，選擇合適的材料構(gòu)建從納米尺度到微觀尺度可控的，具有三維微/納多孔結(jié)構(gòu)的支架材料，是組織工程支架發(fā)展的趨勢[5]。

我們通過模擬尿道組織微環(huán)境，系統(tǒng)研究了尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的多尺度結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步設(shè)計、構(gòu)建了仿尿道組織結(jié)構(gòu)的雙層微/納組織工程尿道支架。以多孔明膠支架材料為骨架，復(fù)合能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)三維納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素（Bacterial Cellulose，BC），最終形成“上致密下疏松”的雙層BC基微/納支架。

1　材料與方法

1.1實驗試劑和儀器

木葡糖酸醋桿菌1.1812（中國科學(xué)院微生物研究所）；葡萄糖，蛋白胨，檸檬酸，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，酵母膏，氫氧化鈉，戊二醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；明膠，氫氧化銨，Triton X-100（Sigma公司，美國）。

超純水制備系統(tǒng)（Siemens公司，德國）；場發(fā)射掃描電鏡（Hitachi公司，日本）。

1.2尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的制備

從陰莖全切手術(shù)中獲得正常人體的球部尿道標(biāo)本1例，尿道組織浸泡在含有1%Triton X-100和0.1%氫氧化銨的脫細(xì)胞液中，37℃下震蕩14 d，每3天換1次液。然后用超純水清洗震蕩5 d，放入-20℃冰箱冷凍12 h，將樣品冷凍干燥24 h，得到尿道脫細(xì)胞基質(zhì)。

1.3雙層微/納組織工程尿道支架的制備

菌種：木葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacterxylinus）1.1812；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%，蛋白胨0.5%，檸檬酸0.1%，磷酸氫二鈉0.2%，磷酸二氫鉀0.1%，酵母膏0.5%，氫氧化鈉調(diào)至pH 5.0，并在121℃、0.1MPa下滅菌30 min[6]。多孔明膠支架：由2%明膠溶液經(jīng)冷凍干燥，戊二醛（2%）交聯(lián)得到。

將多孔明膠支架浸入75%乙醇中，室溫消毒1 h，然后用發(fā)酵培養(yǎng)液清洗3次。平頭鑷子緩慢擠壓明膠模板，并將壓出的培養(yǎng)液用無菌濾紙吸取。將多孔明膠支架放入方型培養(yǎng)皿中，取40 mL含有G.xylinus菌種的發(fā)酵培養(yǎng)液緩慢滴加在明膠模板上，然后將方型培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，30℃發(fā)酵培養(yǎng)7 d，滅菌、清洗去除復(fù)合物中的殘余培養(yǎng)基和細(xì)菌殘骸，得到雙層BC基組織工程尿道支架（BC-Gel/ BC）。

1.4評價方法

樣品的微觀形貌結(jié)構(gòu)采用Hitachi S-4800場發(fā)射掃描電鏡（FE-SEM）進(jìn)行觀察。將冷凍干燥后的測試樣品表面經(jīng)離子濺射儀噴金鍍膜后，用FESEM觀察樣品上、下表面及截面結(jié)構(gòu)。用圖像處理軟件Image J測量FE-SEM照片中微孔孔徑與納米纖維直徑，并用Origin軟件統(tǒng)計、分析平均微孔孔徑、孔徑分布、納米纖維直徑及直徑分布（n=200）。

采用液體排除法測量孔隙率。將冷凍干燥后的樣品浸入超純水中48 h，用公式P(%)=(W2-W1)/ (ρ×V)計算樣品的孔隙率。其中W 1為浸水前干燥樣品重量，W 2為浸水后重量，V為樣品體積，ρ為超純水密度。

2　結(jié)果

2.1尿道脫細(xì)胞基質(zhì)微/納結(jié)構(gòu)分析

首先對尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了大體觀察。尿道組織為中空管狀，由內(nèi)到外依次為尿道腔、黏膜層和海綿體層，其中上皮層與海綿體層之間存在著黏膜下層（基底層），整個尿道組織被漿膜層所包裹（圖1A）。尿道組織經(jīng)脫細(xì)胞處理后得到尿道脫細(xì)胞基質(zhì)，其宏觀形狀為中空管狀體，內(nèi)部呈多孔海綿狀（圖1B）。進(jìn)一步通過FE-SEM觀察發(fā)現(xiàn)，尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的管壁厚度為（3.5±0.8）mm，較薄處厚度僅為（2～3）mm，較厚處達(dá)（4～5）mm。管壁主要為疏松多孔結(jié)構(gòu)（組織結(jié)構(gòu)主要為海綿體層），其孔徑在（100～300）μm，內(nèi)側(cè)管壁為致密結(jié)構(gòu)（上皮層）。

圖1　尿道組織結(jié)構(gòu)示意圖（A）及尿道脫細(xì)胞基質(zhì)大體形貌（B）、FE-SEM圖像（C）Fig.1 Schem atic structure of urethral tissue(A),digital photographs(B)and FE-SEM(C)images of urethral acellularmatrix

對于尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的多孔疏松區(qū)域形貌分析，在微米尺度上，我們發(fā)現(xiàn)其截面均為多孔海綿結(jié)構(gòu)，整個多孔海綿結(jié)構(gòu)是由微米級的大孔，孔孔連接而成（圖2）?？妆谏嫌幸欢ǖ拇植诟?，并且在孔孔連接處及部分孔壁處觀察到細(xì)小纖維狀結(jié)構(gòu)。通過分析得出微米級孔洞的平均孔徑為（146±30）μm。進(jìn)一步觀察其超微米級結(jié)構(gòu)（圖3 A1-A3），我們發(fā)現(xiàn)上述的細(xì)小纖維狀結(jié)構(gòu)均是由細(xì)胞外基質(zhì)的納米級纖維構(gòu)成的。同時，對微米級多孔的孔壁進(jìn)一步觀察也可看到相對致密的納米纖維（圖3 B1-B3）。也就是說，尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的多孔疏松層完全是在納米網(wǎng)狀纖維基礎(chǔ)上組裝而成的微米級多孔結(jié)構(gòu)，經(jīng)測量其納米纖維平均直徑為（30.2±6.6）nm（表1）。

圖2　尿道脫細(xì)胞基質(zhì)多孔疏松區(qū)的FE-SEM圖像（A-C）及微孔孔徑分布（D）Fig.2 FE-SEM images(A-C)and themicropore diameter distribution(D)of urethral acellular matrix in porous section

圖3　尿道脫細(xì)胞基質(zhì)多孔疏松區(qū)不同倍率的FE-SEM圖像（A 1-3，B1-3）及納米纖維直徑分布（C）Fig.3 FE-SEM im ages of urethral acellular m atrix in porous section with differentmagnifications(A1-3,B1-3)and the nanofiber diameter distribution(C)

對尿道脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)側(cè)管壁的致密結(jié)構(gòu)（上皮層）進(jìn)行觀察（圖4），發(fā)現(xiàn)內(nèi)側(cè)管壁的微米級結(jié)構(gòu)較為平整、光滑，未觀察到類似疏松層的細(xì)小纖維狀結(jié)構(gòu)，厚度約為20μm左右。對致密層結(jié)構(gòu)分級放大觀察，最終發(fā)現(xiàn)尿道脫細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)側(cè)管壁也是由平均直徑為（24.6±5.0）nm的納米纖維密集交錯排列而形成的，且納米纖維密度非常高，纖維與纖維之間幾乎看不到微孔，其最大孔洞低于50 nm（表1）。

圖4　尿道脫細(xì)胞基質(zhì)致密層的FE-SEM圖像（A-C）與納米纖維直徑分布（D）Fig.4 FE-SEM images(A-C)and the nanofiber diameter distribution(D)of urethralacellularmatrix in com pactsurface

表1　雙層BC-Gel/BC支架和尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析Table 1 Structure analysis of BC-Gel/BC bilayer scaffolds and urethral acellularmatrix

2.2雙層細(xì)菌纖維素微/納組織工程尿道支架制備

采用模板合成法，選擇平均孔徑為（179±69）μm、孔隙率為84.5%的明膠多孔支架為模板。將5 mm厚度明膠多孔支架放置在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)7 d，最終得到具有“上致密下疏松”結(jié)構(gòu)的雙層BC微/納支架（BC-Gel/BC）。支架截面FE-SEM圖像可以清楚觀察到，其上表面有一層平均厚度為（985±141）μm的BC納米纖維膜，并且形貌與單純BC膜形貌相似，都是由纖維素的納米纖維網(wǎng)層層堆積而成的多層形貌，說明形成了較為致密的BC纖維層（圖5A1-A3），孔隙率約為83%，略低于明膠模板和尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的孔隙率，這可能是致密層較厚引起的。進(jìn)一步觀察雙層支架的多孔疏松層，發(fā)現(xiàn)在明膠多孔支架的孔壁上均勻分布著BC納米纖維。觀察BC-Gel/ BC支架大孔中BC納米纖維的形貌發(fā)現(xiàn)（圖5B1-B3），其納米纖維結(jié)構(gòu)與單純BC相似，是由較高長徑比納米纖維隨意交織形成類似天然ECM的三維納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其平均納米纖維直徑為（20～40）nm。

圖5　雙層BC微/納支架致密層（A1-A3）和疏松多孔層（B1-B3）的截面FE-SEM圖像Fig.5 FE-SEM images of BC-Gel/BC bilayer scaffolds in dense layer(A 1-A3)and porous layer(B1-B3)

3　討論

構(gòu)筑具有模擬尿道組織微環(huán)境的支架材料，是尿道組織工程支架材料的主要設(shè)計出發(fā)點[7-8]。為了更好地了解尿道組織中各細(xì)胞生長所在的微環(huán)境，我們首先將正常尿道組織進(jìn)行了脫細(xì)胞處理，采用FE-SEM觀察，并系統(tǒng)分析了脫細(xì)胞基質(zhì)的微/納結(jié)構(gòu)。由此得知，尿道脫細(xì)胞基質(zhì)為非對稱雙層結(jié)構(gòu)，其內(nèi)壁為厚20μm左右的黏膜層，由較高密度納米纖維組成，納米纖維平均直徑為（24.6±5.0）nm；外壁為納米網(wǎng)狀纖維組裝而成的微米級多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為（146±30）μm，組成其微米級大孔的納米纖維平均直徑為（30.2±6.6）nm；尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的整體壁厚為（4～5）mm，孔隙率為85%。同時，我們研究發(fā)現(xiàn)，尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)的基本微/納結(jié)構(gòu)尺度變化不大。

理想的組織工程支架除需要具備搭載細(xì)胞、提供力學(xué)支撐等作用外，還需要高度擬合不同組織的細(xì)胞外基質(zhì)特定的空間結(jié)構(gòu)，并擁有能夠選擇性促進(jìn)細(xì)胞黏附、影響細(xì)胞增殖與分化、引導(dǎo)細(xì)胞定向爬行和促進(jìn)組織快速血管化的作用。在組織工程尿道重建中，通常采用卷管尿道成形術(shù)，將片狀材料卷繞在硅膠導(dǎo)尿管上形成管狀以達(dá)到組織修復(fù)的目的。因此，對于組織工程尿道支架，需要構(gòu)筑高度擬合尿道脫細(xì)胞基質(zhì)所特有的致密-多孔疏松的微/納結(jié)構(gòu)，制備雙層片狀材料：在微米尺度的整體結(jié)構(gòu)設(shè)計上必須盡可能與尿道實際組織學(xué)結(jié)構(gòu)相近，其致密層（Dense layer）需要設(shè)計較小孔徑的納米纖維層，以達(dá)到承載上皮細(xì)胞并擔(dān)當(dāng)尿液屏障的功能；而多孔疏松層（Porous layer）的海綿體結(jié)構(gòu)，應(yīng)當(dāng)設(shè)計兼具表面納米纖維與微米多孔的三維微/納結(jié)構(gòu)，具有足夠的微米級孔徑以保證細(xì)胞、氧分、代謝產(chǎn)物和生物活性因子的滲透，同時表面黏附的納米纖維能夠提高表面蛋白吸附能力，從而促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖并引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入支架內(nèi)部，促進(jìn)血管化形成，即雙層微/納結(jié)構(gòu)支架（圖6）。

圖6　雙層BC微/納組織工程支架（A）及材料卷繞于導(dǎo)尿管的示意圖（B）Fig.6 Schematic illustration of BC-Gel/BC bilayer scaffolds for tissue-engineeing urethra(A)and the bilayer scaffold tubularized by suturing an urethral catheter(B)

前期研究中，我們通過模板合成法，以多孔支架材料為骨架，使菌種在其上進(jìn)行自組裝，形成BC納米纖維網(wǎng)絡(luò)，最終形成兼具三維多孔及納米纖維網(wǎng)絡(luò)的三維BC微/納支架[9]。制備的BC微/納支架（Gel/ BC支架）兼具三維微米級多孔和納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并可對其微米級尺度、納米級尺度結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控，從而進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞黏附、影響細(xì)胞增殖、引導(dǎo)細(xì)胞定向爬行以及促進(jìn)組織快速血管化。微米尺度上，多孔模板可以根據(jù)需要對宏觀形貌、孔徑大小、孔徑分布等結(jié)構(gòu)進(jìn)行制備；納米尺度上，BC納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、纖維直徑與尿道脫細(xì)胞基質(zhì)中的纖維非常接近，并且可以通過發(fā)酵培養(yǎng)條件，調(diào)節(jié)BC纖維直徑密度與形貌。因此，為了制備雙層BC微/納組織工程尿道支架，我們設(shè)計將Gel/BC支架作為雙層組織工程支架的多孔疏松層；同時利用單純BC相對致密的結(jié)構(gòu)特點，將單純BC作為雙層組織工程支架的致密層。最終設(shè)計的雙層組織工程支架（圖6A），上層為致密層，由單純BC膜構(gòu)成；下層為多孔疏松層，以明膠多孔支架為模板，制備兼具三維多孔及納米纖維網(wǎng)絡(luò)的三維BC微/納支架（Gel/BC）。在組織修復(fù)中，可將雙層支架卷繞在導(dǎo)尿管上，形成類似于尿道脫細(xì)胞基質(zhì)的管狀結(jié)構(gòu)（圖6-B）。所設(shè)計的組織工程尿道支架材料是由單純BC膜作為致密層，其厚度約為50μm（最佳為20μm左右），組成其結(jié)構(gòu)的BC納米纖維直徑應(yīng)在（20～40）nm；明膠多孔支架為模板，制備Gel/BC微/納支架作為多孔疏松層，其中明膠模板平均孔徑150μm左右，BC納米纖維直徑30 nm左右；整體支架厚度5 mm左右。

采用模板合成法，選擇平均孔徑（179±69）μm，孔隙率84.5%的明膠多孔支架為模板。將5mm厚度明膠多孔支架放置在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)時間為7 d，最終得到具有“上致密下疏松”結(jié)構(gòu)的雙層BC微/納支架（BC-Gel/BC）。致密層為納米纖維構(gòu)成的BC膜，疏松層為兼具微米多孔及納米纖維網(wǎng)絡(luò)的多孔Gel/BC支架，其中微孔孔徑為（167±56）μm，納米纖維直徑為（20～40）nm。這種微/納結(jié)構(gòu)，能夠提高明膠孔壁的比表面積與表面粗糙度，將有效提升支架材料的生物學(xué)性能。研究證實，納米級纖維與多孔結(jié)構(gòu)能夠顯著影響細(xì)胞與材料之間的相互作用，從而進(jìn)一步影響細(xì)胞行為[10-11]。下一步我們將嘗試對雙層支架的致密層厚度進(jìn)行調(diào)控，使其控制在50μm左右，并進(jìn)一步對支架的力學(xué)性能、細(xì)胞相容性、增殖情況等進(jìn)行評估，以期最終應(yīng)用于尿道組織的修復(fù)與重建中。

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Design and Fabrication of Abacterial Cellulose Bilayer Scaffold for Urethral Tissue Engineering

LI Zhe1,2,LV Xiangguo3,WANG Baoxiu1,FENG Chao3,CHEN Shiyan1,YAN Zhiyong2,WANG Huaping1.1 State Key Laboratory for Modification of Chem ical Fibers and Polymer Materials,College of Materials Science and Engineering,Donghua University, Shanghai 201620,China;2 Materials and Textile Engineering College,Jiaxing University,Jiaxing 314001,China;3 Department of Urology,Affiliated Sixth Peop le's Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 201620,China. Corresponding author:WANG Huaping(E-mail:wanghp@dhu.edu.cn).

Objective To design and fabrication of the 3D scaffolds that exhibit biomimetic multi-scale structures composed ofmicroporous structure with nanofibers for urethral tissue.Methods By analyzing themulti-scale structures of urethral acellularmatrix,a bilayer scaffold composed ofmicroporous section and nanofibrous dense section to biomimetic urethral tissue was designed.Template biosynthesis was used to fabricate 3D microporous nanofibrous gelatin/BC bilayer scaffolds(BC-Gel/BC)by stationary cultivation usingmicroporous gelatin scaffold as a template.Results The BC-Gel/BC bilayer scaffold composed of dense section of BC nanofibrils network and microporous section of Gel/BC.Themicroporous section with highly interconnected micropore(167±56)μm and surface decorated on themicropore wall by BC nanofibers (20-40)nm were fabricated,which were remarkably similar structure to the native extracellularmatrix(ECM).Conclusion Using the template biosynthesis method,the BC-Gel/BC bilayer scaffold for urethral tissue engineering can be successfully constructed,which has the bilayer structure,m icro porous and nanofibrous network to biom imetic urethral tissue.

Urethral tissue engineering;Acellularmatrix;Bacterial cellulose;Multi-scale structure

Q813.1+2

A

1673－0364（2016）05－0276－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.05.002

博士創(chuàng)新基金（CUSF-DH-D-2015029）；國家自然科學(xué)基金（51573024）。

201620上海市東華大學(xué)材料學(xué)與工程學(xué)院纖維材料改性國家重點實驗室（李喆，王寶秀，陳仕艷，王華平）；314001浙江省嘉興市嘉興學(xué)院材料與紡織工程學(xué)院（李喆，顏志勇）；200233上海市上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科（呂向國，馮超）。

王華平（E-mail：wanghp@dhu.edu.cn）。

（2016年5月20日；

2016年7月2日）