葦蘑液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

趙安 王翟 班立桐 黃海東 楊陽 黃亮

摘 要：通過葦蘑菌絲體液體培養(yǎng)的單因素試驗，初步確定葦蘑的較適生長條件：pH值為5～7；溫度 25 ℃；轉速 100～200 r·min-1；裝液量50～90 mL。再經正交試驗對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得出葦蘑的最適制種工藝為：初始pH值為6；溫度恒定為25 ℃；轉速保持150 r·min-1；裝液量為90 mL/250 mL。在該培養(yǎng)條件下，葦蘑的菌絲干質量可達到19.4 g·L-1。在通氣量為4.5 L·min-1條件下進行葦蘑液體菌種的5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，在44 h即達峰值19.9 g·L-1。

關鍵詞：葦蘑；液體培養(yǎng)；菌絲干質量

中圖分類號：Q93-335 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.09.033

Abstract： The optimum growth condition of liquid culture for Weimo was studied by the way of single factor test， including pH， temperature， rotating speed and liquid volume. The results showed that the range of growth conditions of Weimo are as follows： pH 5～7， temperature 25 ℃， rotating speed 100～200 r·min-1 and liquid volume 50～90 mL. Then the optimal spawn-making for Weimo was concluded by three factors three levels orthogonal experiment， and they are pH 6， temperature 25 ℃， rotating speed 150 r·min-1 and liquid volume 90 mL. Under the optimal growth condition， the dry weight of Weimo could reach 19.4 g·L -1. And Weimo spawns grew to a peak value 19.9 g·L -1 after cultured by 5 L fermenter， 4.5 L·min-1 ventilation， 44 h.

Key words： Weimo；liquid culture；mycelium dry weight

葦蘑為蠟傘科（Hygrophoropsidaceae）、擬蠟傘屬（Hygrophoropsis）蘑菇[1]，產于天津市寧河縣七里海地區(qū)蘆葦地。蘆林葦海中多年敗葉腐草厚積成為獨特的葦蘑生長基質，在悶熱的夏季形成特定濕度、溫度和光照環(huán)境，葦蘑才破土而出。葦蘑味道極其鮮美，香味濃郁，遠勝于其他蘑菇，當地人們采集后鮮食或曬干食用。近些年來，由于自然生態(tài)環(huán)境的變化，蘆葦長勢大不如前，葦地里形不成陰暗潮濕的環(huán)境，葦蘑等也就很少見到[2]。

目前國內外關于葦蘑的研究報道較少，班立桐等[3]初步研究了葦蘑不同溶劑粗提物組分的抗氧化活性，發(fā)現總提取物的抗氧化力最好，除總提取物外，葦蘑的乙酸乙酯可溶性組分總抗氧化力最高，葦蘑的脂溶性組分對超氧陰離子（O2-）清除能力低于水溶性組分，而對羥自由基（·OH）的清除能力相差不多。為了更好地保護這一珍貴的蘑菇品種，本課題組在獲得葦蘑快速生長的液體培養(yǎng)基后，進一步研究葦蘑液體培養(yǎng)的最適生長條件，為更好地開發(fā)利用葦蘑提供依據。

1 材料和方法

1.1 菌 種

葦蘑（Weimo）由天津農學院農學與資源環(huán)境學院生物技術系保藏。

1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基的制備[4-5]。取600 g草炭土，在一定量的清水中煮沸20～30 min，用4層紗布過濾，得濾液。向濾液中加入硫酸鎂、磷酸二氫鉀、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂，待藥品溶化后，補足水分，分裝試管。

（2）液體培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖 15 g，乳糖 15 g，酵母膏 6 g，115 ℃滅菌20 min。

1.3 方 法

1.3.1 葦蘑培養(yǎng)條件的單因素試驗 （1）設置pH梯度為4、5、6、7、8、9，按照最適培養(yǎng)基的配方，每組配制6個搖瓶，每瓶裝液量為70 mL的培養(yǎng)基。接種完成后分別放入溫度為20，25，30 ℃的恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)，并觀察記錄。（2）將接種完成的三角瓶分別放入不同轉速（100，150，200 r·min-1）的恒溫搖床中培養(yǎng)7 d。錐形瓶中長出很多淡黃色的小菌球為最佳[3]。

1.3.2 葦蘑液體培養(yǎng)的正交試驗 以葦蘑單因素試驗結果為基礎設計了3因素3水平正交試驗，以確定葦蘑的最適生長條件。正交試驗因素水平見表1[4]。

1.3.3 分析方法 待各試驗組生長出大量淡黃色小菌球時，取5 mL菌液稀釋檢測各組菌球數，并取等體積（50 mL）菌液測干質量和多糖[6]。干質量為離心后用蒸餾水沖洗菌絲3次置50 ℃烘箱中烘至恒質量測得，多糖測定采用苯酚硫酸法。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)溫度對葦蘑生長的影響

通過在20，25，30 ℃ 3種不同溫度、150 r·min-1條件下培養(yǎng)葦蘑，7 d后各培養(yǎng)基中均長出淡黃色的葦蘑菌球，檢測各組菌球數和干質量，結果見圖1。

在不同溫度條件下的pH為6的試驗組中菌絲干質量分別為5，7.8，5.6 g·L-1，可以看出25 ℃下，菌絲干質量最多。對比3個溫度環(huán)境下的各組試驗，可知25 ℃有利于葦蘑生長。

2.2 搖床轉速對葦蘑生長的影響

葦蘑接種到在搖床轉速100，150，200 r·min-1條件下分別進行培養(yǎng)7 d后，測得的菌絲干質量見圖2。

對比不同轉速下的培養(yǎng)，可以推測出葦蘑的生長需要一定的溶氧，轉速太低不利于葦蘑的生長，150 r·min-1菌絲干質量最高，而200 r·min-1比150 r·min-1條件下的菌絲干質量略低，可見轉速太快不一定有利于葦蘑生長。

2.3 初始pH對葦蘑生長的影響

通過圖3可以看出，在同一溫度條件下pH值為6的試驗組中菌球數、干質量、多糖含量明顯高于其他試驗組，并且各指標變化趨勢基本相同。從圖3可以看出，pH趨于堿性時，葦蘑的干質量逐漸減小，多糖含量及菌絲球數變化趨勢相同，可見葦蘑為一種酸性食用菌，但過酸和過堿均不利于菌體的生長[7]。結果表明其最適生長pH值在6左右，與羊肚菌液體發(fā)酵所需最適pH值相同[8]，而與適于樺褐孔菌液體發(fā)酵所需堿性pH值剛好相反[9]。

2.4 正交試驗結果

2.4.1 極差分析 葦蘑經過7 d的液體菌絲培養(yǎng)后進行離心測菌體干質量并進行統(tǒng)計分析，結果見表2。經單因素試驗發(fā)現，菌絲球數及多糖含量與菌體干質量正相關，故此處只列出各試驗組的菌絲干質量。

由表2中的極差R可以看出， 初始pH對葦蘑生長的影響最大，其次為裝液量及轉速。從表中得出最優(yōu)組合為A2B3C2，即pH 6，裝液量 90 mL，轉速 150 r·min-1。這與試驗組中的最大值6號組合A2B3C1不一致，有必要進行一次驗證試驗，以確定葦蘑的最適生長條件。

2.4.2 驗證試驗 將正交試驗極差分析的最優(yōu)組合A2B3C2和試驗組合A2B3C1進行重復試驗，每組接種4瓶，經7 d培養(yǎng)后對菌絲干質量進行記錄、分析，結果見表3。

由表3可知，試驗組合A2B3C2條件下的葦蘑菌絲干質量均值高于試驗組合A2B3C1，即A2B3C2條件更適合葦蘑生長，葦蘑的最適液體培養(yǎng)條件是：pH 值為6、溫度 25 ℃、裝液量 90 mL、轉速150 r·min-1。

2.4 通氣量對葦蘑液體培養(yǎng)的影響

以10%的接種量進行葦蘑液體菌種的5 L發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)，設定通氣量為3，4.5，6 L·min-1進行比較試驗，過程曲線見圖4。

由圖4可見，葦蘑的發(fā)酵罐培養(yǎng)后的干質量在44～48 h即達到峰值，時間遠遠短于搖瓶培養(yǎng)，可見發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)于搖瓶。不同的通氣量條件下，葦蘑的生長情況差異比較大，通氣量由3 L·min-1增大至4.5 L·min-1后，菌體的干質量得到了大幅度提升，而進一步增大至6 L·min-1后，菌體干質量反而出現下降趨勢。通氣量可控制發(fā)酵罐中的溶氧處于合適的范圍，進而促進菌體的快速增長及生長得率的增加[10]，葦蘑的液體菌種培養(yǎng)在適量的通氣量條件下生長，于44 h可達峰值19.91 g·L -1，達峰值的時間遠低于常見的珍稀食藥用菌如杏鮑菇、桑黃、荷葉離褶傘等的6～8 d[11-13]。

3 結論與討論

葦蘑為具有天津“肺葉”之稱的七里海濕地的特色資源，其產出不僅需要特定的地理環(huán)境，還需要獨特的氣候條件。野生葦蘑生長于茂密的蘆葦根部，采集非常困難，采集者有時在密集的蘆葦叢中尋覓幾小時而不得一子實體，而且葦蘑不一定每年均有產出，氣候條件的變化導致幾年都采集不到是常有的事。葦蘑的稀少及獨特的味道促使這一野生資源2015年售價達4 000元·kg-1，而且往往價高而貨缺。

七里海是華北大地渤海之濱的一顆璀璨明珠，七里海因南北寬 7 華里而得名，又名七里淀，古屬神州九十九淀之一。古稱七里海為“七里煙波”，屬寧河八景之一。它在 20 世紀 60 年代以前曾有過幾千年輝煌的歷史，是津京唐三角地帶極其難得的一片綠洲，是天津濱海地區(qū)既大又美的后花園，是我國第一個也是唯一的古海岸與濕地同處一地的國家級自然保護區(qū)，還是世界著名三大古海岸之一[14]。從20 世紀70 年代開始，由于濕地生態(tài)系統(tǒng)的脆弱性，加上人們在對濕地資源的開發(fā)中存在著許多不合理，極大地影響了濕地生態(tài)環(huán)境，破壞了生態(tài)平衡。七里海濕地的面積不斷縮小，水源逐漸枯竭，植物群落嚴重衰頹。尤其是蘆葦，在充足的熱量和水分條件組合下，長勢良好，植株高大，莖桿粗壯，生長茂密，曾覆蓋了70%～80%的沼澤面積，形成綠色的蘆林葦海[15]。由于沼澤面積縮小、土質退化和干旱無水，蘆葦的長勢也嚴重衰退，棲身蘆葦地的葦蘑也逐年減少。此外，人為采集的增加，導致幼齡菇未完成生理成熟期即夭折，長此以往，蘆葦地由于缺乏葦蘑孢子的存集，葦蘑將面臨滅絕的危險。

為延續(xù)葦蘑的資源再生，多年來很多學者一直在研究人工栽培葦蘑技術，目前未有成功。筆者所在研究室長期研究葦蘑，以期通過液體發(fā)酵模式開發(fā)葦蘑產品，并對七里海地區(qū)的物種保護作一份貢獻。在不同pH值、溫度、轉速、裝液量下對葦蘑進行搖瓶振蕩恒溫培養(yǎng)，通過正交試驗對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，確定出葦蘑的最適合液體制種工藝。在該工藝條件下，葦蘑的菌絲干質量達到最大值：19.4 g·L -1，是未優(yōu)化前的3.9倍。通氣量為4.5 L·min-1條件下進行葦蘑液體菌種的5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，在44 h即達峰值，制種時間可大幅度縮短。

參考文獻：

[1]楊紅澎，黃亮，班立桐，等.天津七里海野生葦蘑科屬研究[J].天津農業(yè)科學，2013，19（5）：51-52.

[2]梁枝榮.葦蘑的分離與馴化栽培[J].新技術，2009，70（9）：62-67.

[3]班立桐，楊紅澎，吳疆，等.野生葦蘑不同活性組分的體外抗氧化作用研究[J].食用菌，2010，32（3）：72-73.

[4] 邸鴻儒.棕色蘑菇母種培養(yǎng)基及覆土材料優(yōu)化[D].天津：天津農學院，2011.

[5]陳帥君，黃亮，王玉，等.棕色蘑菇菌絲液體培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].北方園藝，2015 （8）：150-152.

[6] 王瑞娟，郭倩，李玉，等.一種灰樹花液體菌種及用其栽培灰樹花的方法：中國，200910201986[P].2009-01-01.

[7]李情敏，何名芳，張鳳英，等.枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵的研究[J].中國釀造，2016，35（2）：43-47.

[8]楊建，張光宇，杜秀娟，等.羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].中國釀造，2013，32（10）：113-116.

[9]胡濤，劉萍，王亞亞，等.樺褐孔菌深層發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究[J].中國釀造，2012，31（1）：26-29.

[10]朱會霞，孫金旭.樟芝真菌深層培養(yǎng)條件研究[J].中國釀造，2009 （1）：115-117.

[11]祝明思，王應男，張公亮，等.桑黃菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究[J].中國釀造，2010 （11）：88-91.

[12]張漢燚，王治江，席亞麗，等.荷葉離褶傘中試發(fā)酵條件與培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J].中國釀造，2012，31（1）：96-99.

[13]王艷萍，趙娜，付麗紅，等.杏鮑菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的初步研究[J].中國釀造，2012，31（5）：30-35.

[14]張丹.濕地生態(tài)旅游開發(fā)機制與路徑研究——以天津七里海濕地為例[D].天津：天津商業(yè)大學，2010.

[15]呂紹生，李兆江.論天津七里海濕地的歷史演變過程和教訓[J].歷史地理，2003（19）：125-126.