黑豆油水酶法提取工藝及其脂肪酸組成分析

尹潞海，余 佶，余兆碩，呂雯姣，唐謙為，麻成金，吳竹青

（1.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點實驗室，湖南吉首 416000；2.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首 416000）

黑豆油水酶法提取工藝及其脂肪酸組成分析

尹潞海1，2，余 佶1，2，余兆碩2，呂雯姣2，唐謙為2，麻成金1，2，*吳竹青1，2

（1.吉首大學(xué)植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點實驗室，湖南吉首 416000；2.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首 416000）

以黑豆為原料，探討水酶法及超聲波輔助水酶法提取黑豆油工藝條件，對酶解條件和超聲波預(yù)處理條件進(jìn)行研究。通過單因素試驗和正交試驗，確定水酶法提取的最適條件為料液比1∶8（g∶mL），堿性蛋白酶用量2.0%，酶解pH值8.5，酶解溫度55℃，酶解時間5 h，在此條件下黑豆油提取率為89.2%。超聲波輔助處理可有效提高黑豆油提取率，在超聲功率420 W下處理20 min可將黑豆油提取率提高至94.5%，比未經(jīng)超聲波預(yù)處理的高出5.3%。對黑豆油進(jìn)行GC-MS分析，其主要脂肪酸有棕櫚酸19.33%，亞油酸46.17%，油酸18.73%和硬脂酸7.18%等10種脂肪酸，其不飽和脂肪酸相對含量達(dá)68.34%。

黑豆油；超聲波輔助提??；水酶法；脂肪酸組成

0 引言

黑豆為豆科植物大豆的黑色種子（Glycinemax L. merr），又叫黑大豆、烏豆等。我國黑豆資源豐富，已形成規(guī)模化種植［1］。黑豆粗脂肪含量為20%左右，富含油酸和亞油酸，具有較高的營養(yǎng)價值［2-3］；黑豆還含有異黃酮等活性成分，具有抗氧化和抗腫瘤等多種功效［4］。

植物油脂提取方法主要有壓榨法、溶劑萃取法、水酶法、超臨界流體萃取法等［5］，尤其是超聲波、微波等輔助技術(shù)的應(yīng)用，有助于提高油脂提取率。目前，國內(nèi)外對豆類油脂的水酶法提取研究已有文獻(xiàn)報道［6-10］，但未見水酶法提取黑豆油脂的相關(guān)報道。本試驗以黑豆為原料，對黑豆油脂提取工藝中料液比、堿性蛋白酶用量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時間，以及超聲功率、超聲時間等工藝參數(shù)進(jìn)行探討，并對其脂肪酸組成進(jìn)行GC-MS分析，旨在為黑豆油的提取和應(yīng)用提供試驗參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司產(chǎn)品；LXJ-IIB型離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；101-2AB型鼓風(fēng)恒溫干燥箱，天津泰斯特公司產(chǎn)品；FA2004型電子天平，上海舜宇恒平科儀公司產(chǎn)品；JY92-ⅡDN型超聲波細(xì)胞粉碎機，寧波新芝生物科技公司產(chǎn)品；PH-2型酸度計，上?？苾x公司產(chǎn)品；FW-100型高速萬能粉碎機，天津泰斯特公司產(chǎn)品；HJ-3數(shù)型顯恒溫磁力攪拌器，常州澳華儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S2型恒溫水浴鍋，金壇市成輝儀器廠產(chǎn)品；MDF-192型超低溫冰箱，日本三洋公司產(chǎn)品。

1.2 原料與試劑

黑豆，購于湖南吉首市農(nóng)貿(mào)市場；堿性蛋白酶，江蘇銳陽生物科技有限公司產(chǎn)品，最適溫度50～60℃，最適pH值8.5～10.5；氫氧化鈉、氫氧化鉀、鹽酸，均為國產(chǎn)分析純；甲醇、正己烷，為國產(chǎn)色譜純。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品處理

將烘干后的黑豆粉碎，過40目篩，備用。

1.3.2 黑豆粗脂肪含量測定

采用索氏提取法（GB/T 5009.6—2003），測得其粗脂肪含量平均值為20.15%。

1.3.3 工藝流程

水酶法提取：黑豆粉→調(diào)漿→超聲波預(yù)處理→調(diào)節(jié)溫度、pH值→酶解→離心分離→破乳→干燥→黑豆毛油。

1.3.4 操作要點

準(zhǔn)確稱取10 g黑豆粉，裝于燒杯中，加入一定容積的蒸餾水，混勻，用超聲波預(yù)處理后調(diào)整pH值，加入一定量堿性蛋白酶，恒溫攪拌反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心分離20 min，收集上層乳狀液，在-20℃冷凍處理12 h，然后在35℃解凍2 h，離心分離，收集上層游離油，測定并計算黑豆油提取率。

1.3.5 黑豆油提取率計算Y=×100%.

式中：Y——黑豆油提取率，%；m1——黑豆粗脂肪含量，g；m2——提取黑豆油質(zhì)量，g。

1.3.6 單因素試驗

在其他條件相同的情況下，分別探討水酶法提取黑豆油試驗中料液比、堿性蛋白酶用量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時間等因素對黑豆油提取率的影響，以及超聲波輔助處理時超聲功率、超聲時間對黑豆油提取率的影響。

1.3.7 提取工藝條件優(yōu)化試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，對料液比、堿性蛋白酶用量、酶解pH值、酶解溫度4個因素進(jìn)行正交試驗設(shè)計，并對酶解條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.8 黑豆油脂肪酸組成分析

（1）甲酯化方法。稱取1 g（精確到0.000 1 g）水酶法提取所得黑豆油油樣，置于具塞錐形瓶中，加入0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液10 mL，混勻后置于70℃下水浴超聲波輔助處理1 h，冷卻至室溫，用20 mL色譜純正己烷萃取，靜置分層取上層液，用蒸餾水洗滌2～3次，加入無水硫酸鎂干燥脫水，最后以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心10 min，取上層清液置于瓶中待測。

（2）儀器MS條件。四級桿溫度150℃，EI離子源溫度230℃，溶劑延時4 min，電子能量70 eV，掃描范圍30～500 u。

（3） 儀器GC條件。HP-5MSAgilent 190191S-433型石英毛細(xì)管柱（325℃，30 m×250 μm）；載氣為高純氦氣（99.999%）；柱前壓69.8 kPa；柱內(nèi)載氣流量2 mL/min；80℃保持2 min，以10℃/min升溫到160℃，保持2 min，再以5℃/min升溫到250℃保持5 min；樣品進(jìn)樣量1 μL；分流比80∶1。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解條件對黑豆油提取率影響的單因素試驗

2.1.1 料液比對黑豆油提取率的影響

在未經(jīng)超聲波預(yù)處理，堿性蛋白酶用量2.0%，酶解溫度50℃，酶解時間4 h，酶解pH值9.0的條件下，考察料液比對黑豆油提取率的影響。

料液比對黑豆油提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對黑豆油提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增加，黑豆油提取率快速上升，在料液比1∶8（g∶mL）時達(dá)到最高。當(dāng)料液比較低時，由于漿料黏稠度大，酶與底物接觸不充分，酶解效果較差；隨著料液比增加，酶與底物接觸面積增大，作用效果明顯提高；但料液比過大時，底物濃度較低，減弱了酶解效果，黑豆油提取率反而下降。

2.1.2 堿性蛋白酶用量對黑豆油提取率的影響

在未經(jīng)超聲波預(yù)處理，料液比1∶8（g∶mL），酶解溫度50℃，酶解時間4 h，酶解pH值9.0的條件下，考察堿性蛋白酶用量對黑豆油提取率的影響。堿性蛋白酶用量對黑豆油提取率的影響見圖2。

圖2 堿性蛋白酶用量對黑豆油提取率的影響

由圖2可知，隨著堿性蛋白酶用量的增加，黑豆油提取率不斷升高；當(dāng)堿性蛋白酶用量超過2.5%時，黑豆油提取率增加緩慢，這是因為酶對底物作用飽和所致。因此，堿性蛋白酶用量以2.5%左右為宜。

2.1.3 酶解pH值對黑豆油提取率的影響

在未經(jīng)超聲波預(yù)處理，堿性蛋白酶用量2.0%，料液比1∶8（g∶mL），酶解溫度50℃，酶解時間4 h的條件下，考察酶解pH值對黑豆油提取率的影響。

酶解pH值對黑豆油提取率的影響見圖3。

圖3 酶解pH值對黑豆油提取率的影響

由圖3可知，黑豆油提取率隨著酶解pH值的升高而迅速增加，在酶解pH值9.0時達(dá)到最高；但當(dāng)酶解pH值超過9.0時，提取率隨酶解pH值的升高而下降。因此，選擇酶解pH值9.0為宜。

2.1.4 酶解溫度對黑豆油提取率的影響

在未經(jīng)超聲波預(yù)處理，料液比1∶8（g∶mL），堿性蛋白酶用量2.0%，酶解pH值9.0，酶解時間4 h的條件下，考察酶解溫度對黑豆油提取率的影響。

酶解溫度對黑豆油提取率的影響見圖4。

由圖4可知，隨著酶解溫度升高，黑豆油提取率不斷上升，在55℃時達(dá)到最高；超過55℃時，隨著酶解溫度升高，黑豆油提取率迅速下降，這與堿性蛋白酶的最適作用溫度有關(guān)。

2.1.5 酶解時間對黑豆油提取率的影響

在未經(jīng)超聲波預(yù)處理，料液比1∶8（g∶mL），堿性蛋白酶用量2.0%，酶解溫度50℃，酶解pH值9.0的條件下，考察酶解時間對黑豆油提取率的影響。

酶解時間對黑豆油提取率的影響見圖5。

圖5 酶解時間對黑豆油提取率的影響

由圖5可知，隨著酶解時間的延長，黑豆油提取率逐漸上升；當(dāng)酶解時間超過5 h時，黑豆油提取率趨于穩(wěn)定。因此，酶解時間選擇5 h即可。

2.2 水酶法提取黑豆油酶解條件優(yōu)化試驗

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以黑豆油提取率為評價指標(biāo)，選用L9（34）正交試驗設(shè)計對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1，正交試驗結(jié)果與分析見表2。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

由表2可知，各因素影響酶解效果的主次順序為料液比＞酶解溫度＞酶解pH值＞堿性蛋白酶用量，最優(yōu)水平組合為A2B2C1D2，即料液比1∶8（g∶mL），堿性蛋白酶用量2.0%，酶解pH值8.5，酶解溫度55℃。在此條件下進(jìn)行3組驗證試驗，黑豆油提取率平均值為89.2%。

2.3 超聲波輔助處理對黑豆油提取率的影響

在優(yōu)化的酶解條件下，探討超聲功率和超聲時間對黑豆油提取率的影響。

2.3.1 超聲功率對黑豆油提取率的影響

固定超聲時間10 min，在優(yōu)化酶解條件下考察超聲功率對黑豆油提取率的影響。

超聲功率對黑豆油提取率的影響見圖6。

圖6 超聲功率對黑豆油提取率的影響

由圖6可知，隨著超聲功率增大，黑豆油提取率相應(yīng)提高，因為超聲功率420 W時提取率最高，達(dá)到92.2%。超聲波功率越大，空化作用和機械作用越強烈，分子擴(kuò)散速度也就越大，油脂滲出就越多［3］。但在超聲功率超過420 W后，黑豆油提取率反而略有減小，這可能是由于功率大，超聲波瞬間熱效應(yīng)過于明顯，使得局部溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，影響酶解效果，從而影響油脂溶出。

2.3.2 超聲時間對黑豆油提取率的影響

固定超聲功率420 W，在優(yōu)化酶解條件下考察超聲時間對黑豆油提取率的影響。

超聲時間對黑豆油提取率的影響見圖7。

圖7 超聲時間對黑豆油提取率的影響

由圖7可知，黑豆油提取率隨超聲時間延長而升高，20 min達(dá)到94.5%，之后漸趨于穩(wěn)定。因此，選擇超聲時間20 min即可。

2.4 黑豆油脂肪酸組成分析

黑豆油經(jīng)甲酯化處理后進(jìn)行GC-MS分析，形成的色譜峰通過NIST 05標(biāo)準(zhǔn)譜庫逐個進(jìn)行檢索，解析出各峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖，并利用不做校正的峰面積歸一法確定各組分的相對含量。

黑豆油中脂肪酸組分及相對含量見表4。

表4 黑豆油中脂肪酸組分及相對含量

由表4可知，黑豆油中主要含有棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸等10種脂肪酸，其中亞油酸相對含量最高，達(dá)46.17%；亞油酸、油酸、8-十八烷酸等不飽和脂肪酸含量達(dá)到68.34%。

3 結(jié)論

以黑豆為原料，研究水酶法提取油脂工藝條件，測定黑豆原料粗脂肪含量為20.15%，通過單因素試驗及正交試驗，確定水酶法提取黑豆油的優(yōu)化酶解條件為料液比1∶8（g∶mL），堿性蛋白酶用量2.0%，酶解pH值 8.5，酶解溫度55℃，酶解時間5 h，此

時黑豆油提取率為89.2%。采用超聲波輔助處理，可有效提高黑豆油提取率，在超聲功率420 W下處理20 min可使黑豆油提取率提高至94.5%，比未經(jīng)超聲波預(yù)處理的高出5.3%。提取所得黑豆油經(jīng)GC-MS分析，其主要脂肪酸組成為棕櫚酸、亞油酸、油酸和硬脂酸等10種脂肪酸，不飽和脂肪酸含量高達(dá)68.34%，具有較高的應(yīng)用價值。

［1］王璇，田少君，張喆，等.超聲波輔助酶解黑豆蛋白工藝優(yōu)化 ［J］.糧食與油脂，2011（12）：39-42.

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［10］金婷，譚勝兵.水酶法提取石榴籽油工藝條件探究 ［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2014（10）：42-44.◇牛肉干中的水分由內(nèi)外同時蒸發(fā)，干燥速度快，干燥較徹底，干燥后的牛肉干含水量低。

3.2.2 蛋白質(zhì)

傳統(tǒng)牛肉干由于2次煮制處理，導(dǎo)致部分鹽溶性蛋白和其他可溶性營養(yǎng)物質(zhì)流失，影響了產(chǎn)品的風(fēng)味和營養(yǎng)價值。

Aqueous Enzymatic Extraction of Black Soybean Oil and Analysis of Fatty Acid Composition

YIN Luhai1，2，YU Ji1，2，YU Zhaoshuo2，LV Wenjiao2，TANG Qianwei2，MA Chengjin1，2，*WU Zhuqing1，2
（1.Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Utilization，Jishou Univerusity，Jishou，Hu'nan 416000，China；2.Institute of Food Science，Jishou University，Jishou，Hu'nan 416000，China）

Aqueous enzymatic extraction of black soybean oil from black soybean assisted by ultrasound is studied.Effects of enzymatic hydrolysis conditions and ultrasonic pretreatment conditions on the extraction rate are explored，the optimum extraction condition is obtained as follows：ratio of stuff to water 1∶8（g∶mL），dosage of alcalase 2.0%，pH 8.5，temperature 55℃，time 5 hours.Under this optimal conditions，the oil extraction efficiency reached 89.2%.The ultrasound irradiation at 420 W for 20 min followed by aqueous enzymatic extraction could increase the oil extraction efficiency to 94.5%，which is 5.3%higher than that of non-irradiation with ultrasound.GC-MS is employed to analyze the components of fatty acid of black soybean oil.The main components of black soybean oil are ten kinds of fatty acid suchas palmitic acid 19.33%，linoleic acid 46.17%，oleic acid 18.73%，stearic acid 7.18%，total content of unsaturated fatty acids is 68.34%.

black soybean oil；ultrasonic-assisted extraction；aqueous enzymatic extraction；fatty acid composition

TS224.4

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.01.007

2015-10-23

吉首大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練中心資助項目（JDCX2013-24）。

尹潞海（1993— ），男，在讀本科，研究方向為食物資源研究與利用。

*通訊作者：吳竹青（1964— ），女，高級實驗師，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。