穴位埋線對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠的治療作用及部分機(jī)制研究

胡 林 敬勝男 賴志紅

成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 四川 成都 610075

穴位埋線對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠的治療作用及部分機(jī)制研究

胡 林 敬勝男 賴志紅

成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 四川 成都 610075

穴位埋線 非酒精性脂肪肝 大鼠 脂聯(lián)素

腫瘤壞死因子-α近年來非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）發(fā)病率呈“井噴式”增長，且發(fā)病趨于低齡化，已成為全球肝病相關(guān)發(fā)病率和死亡率的主要原因。筆者采用穴位埋線治療本病取得一定療效，本研究通過觀察NAFLD大鼠穴位埋線治療后相關(guān)指標(biāo)的變化，探討穴位埋線對(duì)NAFLD可能的作用機(jī)制，特報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：同批次健康SDF級(jí)雌性大鼠30只，體質(zhì)量200±20g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，合格證號(hào)0002906，生產(chǎn)許可證SCXK（川）2008-24。

1.2 試劑及設(shè)備：KRYOSTAT 1720型冰凍切片機(jī)：德國Leitz公司；BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)：常州中威電子儀器廠；PHY-Ⅲ病理組織漂烘處理儀：常州中威電子儀器廠；多功能酶標(biāo)儀（Thermo公司KRYOSTAT 1720型冰凍切片機(jī)）；日立7170a全自動(dòng)生化分析儀：日立公司；Chemi-Doc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)、PCR儀：BioRad公司；大鼠脂聯(lián)素（ADP）檢測(cè)試劑盒（RD，貨號(hào)：201503）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測(cè)試劑盒（RD，貨號(hào)：201502）。

1.3 分組及造模：實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，標(biāo)記后隨機(jī)將大鼠分為空白組11只和造模組21只。空白組飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料，造模組飼以高脂飼料（標(biāo)準(zhǔn)飼料88%+膽固醇2%+豬油10%）來復(fù)制非酒精性脂肪肝大鼠模型，各組大鼠均自由飲水。連續(xù)飼養(yǎng)10周，第10周末各組隨機(jī)抽取大鼠1只處死取材，做肝臟病理組織血檢查證實(shí)脂肪肝已形成[1-2]。

將造模成功的20只大鼠隨機(jī)分為穴位埋線組和假埋線組，各10只。穴位埋線組參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》進(jìn)行穴位定位[3]，埋線方法：取大鼠足三里、中脘、天樞、氣海、豐隆，碘酒常規(guī)消毒大鼠穴位皮膚，用消毒鑷子將0.5cm生物可降解線置入一次性埋線針具套管內(nèi)，斜向大鼠脊柱方向快速刺入上述穴位皮下，針拔出后用消毒棉簽按壓針孔數(shù)秒，創(chuàng)口無需其他特殊處理即完成1次穴位埋線操作，14天后重復(fù)，共4次，療程為8周。假埋線組不埋入生物可降解線，余操作步驟同治療組。

治療8周后，大鼠禁食不禁飲12h后，次日清晨稱重，用3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔麻醉。腹主動(dòng)脈取血8ml，3000r/min離心血清5min，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｃ擃i椎處死大鼠，迅速摘取肝臟，稱重。4℃ 0.9%氯化鈉溶液沖洗，在距肝邊緣5mm處取相同部位肝左葉組織若干塊，大小約1.5cm×1.5cm×0.5cm，-80℃冷凍保存，做常規(guī)油紅0染色病理切片。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)：①肝指數(shù)：分別稱重大鼠體重及摘取的全肝臟，計(jì)算肝指數(shù)。②肝臟組織病理：取肝左葉冰凍切片，常規(guī)油紅O法染色，采用Ridit法計(jì)算各組療效的Ridit平均值以分級(jí)評(píng)價(jià)各組大鼠肝脂肪變性程度。③血清生化指標(biāo)：采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定，由成都中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)科協(xié)助檢測(cè)血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）。④脂聯(lián)素（ADP）與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）：采用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)靜脈上清中的ADP與TNF-α。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用Ridit分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)比較：見表1。假埋線組及穴位埋線組大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)明顯高于空白組，表明造模成功；治療8周后，穴位埋線組大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)明顯低于假埋線組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 穴位埋線對(duì)大鼠體重及肝重變化的影響（±s）

表1 穴位埋線對(duì)大鼠體重及肝重變化的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與假埋線組比較，#P＜0.01。

肝指數(shù)（%）組別 只數(shù) 體重（g） 肝濕重（g）空白組假埋線組穴位埋線組3.08±0.59 4.09±0.49*3.48±0.46#10 10 10 310.56±55.97 410.08±47.46*337.78±18.30#9.54±2.33 16.65±1.42*12.00±3.10#

2.2 分級(jí)評(píng)價(jià)各組大鼠肝脂肪變性程度：見表2。正常組大鼠肝組織光鏡下未見明顯異常，假埋線組大鼠肝組織可見中到重度彌漫性肝細(xì)胞脂肪變，穴位埋線組大鼠肝細(xì)胞脂肪變以輕到中度為主。與假埋線組比較，穴位埋線組肝臟脂肪變程度輕，Ridit平均值明顯降低（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較：見表3。假埋線組、穴位埋線組大鼠血清中TC、TG、ALT、AST水平較空白組均升高；穴位埋線組大鼠血清TC、TG含量與空白組比較，差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；穴位埋線組血清TC、TG、ALT、AST明顯低于假埋線組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 大鼠肝脂肪變性程度分級(jí)評(píng)價(jià)情況

表3 穴位埋線對(duì)大鼠生化指標(biāo)的影響（±s）

表3 穴位埋線對(duì)大鼠生化指標(biāo)的影響（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.01；與假埋線組比較，*P＜0.01。

組別空白組假埋線組穴位埋線組AST（U/L）36.45±10.17 112.33±17.69#68.56±15.46#*只數(shù)10 10 10 ALT（U/L）36.83±18.23 80.67±18.01#42.17±4.67*TC（mmol/L）1.34±0.12 2.35±0.32#1.45±0.23#*TG（mmol/L）0.21±0.06 0.49±0.12#0.22±0.07#*

2.4 穴位埋線對(duì)大鼠ADP與TNF-α的影響：見表4。

表4 穴位埋線對(duì)大鼠血清ADP、TNF-α的影響（±s）

表4 穴位埋線對(duì)大鼠血清ADP、TNF-α的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假埋線組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

TNF-α（ng/L）13.04±1.45 23.23±1.23**14.98±1.45**##組別空白組假埋線組穴位埋線組只數(shù)10 10 10 ADP（mg/L）21.58±0.82 12.98±5.56**18.61±2.03*#

3 討論

NAFLD屬中醫(yī)學(xué)“脅痛”“肝著”“積聚”等范疇，其發(fā)病多由于先天稟賦不足，腎精虧虛，水不涵木；或過食肥甘厚味、飲食不節(jié)，或嗜酒過度致脾失健運(yùn)，飲食脂濁積聚，濕濁內(nèi)生，聚而成痰，留滯肝絡(luò)；或情志勞倦內(nèi)傷等致肝失疏泄，氣滯血瘀。故臨床采用行氣、利濕、祛痰、化瘀的治療原則[4]。穴位埋線是針灸和埋線療法的延伸，“長效針感”保留針灸的持續(xù)作用，加強(qiáng)治療效果。中脘為胃之募穴，可調(diào)胃和中，補(bǔ)虛納氣，降逆化滯；配大腸之募穴天樞，能疏調(diào)臟腑，行氣消食導(dǎo)滯，活血化瘀；與豐隆相配，能加強(qiáng)利濕化痰、疏通經(jīng)絡(luò)、消脂降濁功效。氣海、足三里為補(bǔ)虛之要穴，固腎益精，補(bǔ)中益氣，改善臟腑功能。天樞、中脘、氣海均位于腹部，持續(xù)刺激能減少脂肪組織在腹部的積聚。諸穴合用，共奏健脾消食行氣、祛痰化瘀之功。

目前認(rèn)為NAFLD的發(fā)病與胰島素抵抗（IR）、脂肪酸代謝紊亂、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子等因素相關(guān)。IR被認(rèn)為是中心環(huán)節(jié)，脂質(zhì)過多癥和高胰島素血癥導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積，而異常的肝細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低，加重IR。脂肪變肝細(xì)胞和脂肪組織分泌多種細(xì)胞因子，各種原因誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化不平衡及炎癥反應(yīng)使肝細(xì)胞再次受到損傷。此過程中，谷胱甘肽水平降低導(dǎo)致JNK信號(hào)傳導(dǎo)過度活化，促炎癥因子TNF-α的分泌增加，通過多信號(hào)傳導(dǎo)通路產(chǎn)生并加重IR，形成惡性循環(huán)。且肝臟是TNF-α的重要靶器官，TNF-α可抑制外周脂肪組織分解，并通過與肝細(xì)胞膜上的TNF受體結(jié)合，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡和壞死[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ADP是影響肝臟細(xì)胞脂肪變性以及炎癥的獨(dú)立影響因素，低ADP與IR的肝脂肪聚集有密切關(guān)系[6]。本研究結(jié)果表明：穴位埋線能升高脂聯(lián)素含量而降低TNF-α的含量，改善肝組織脂肪變性程度，降低大鼠血清TC、TG、ALT、AST水平，推測(cè)穴位埋線通過影響血清ADP及TNF-α含量對(duì)NAFLD產(chǎn)生一定的干預(yù)作用，其療效可能與改善IR有關(guān)。

[1]陳劍明，王丙信，伏愛國，等.高脂飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2016，34（11）：2709-2712.

[2]徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1351.

[3]李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：329-332.

[4]王小奇，劉慶生，桑怡，等.理氣化痰祛瘀方治療非酒精性脂肪肝34例臨床研究[J].浙江中醫(yī)雜志，2012，47（9）：637-638.

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2017-06-08