微波輔助雙水相萃取黃芪莖總皂苷及其抗氧化活性

鐘方麗，王文姣，，王曉林，曹 野

（1. 吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 132022；2. 吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，長春 130012）

微波輔助雙水相萃取黃芪莖總皂苷及其抗氧化活性

鐘方麗1，王文姣1，2，王曉林1，曹 野1

（1. 吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 132022；2. 吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，長春 130012）

采用微波輔助雙水相萃取法研究了黃芪莖總皂苷的萃取工藝條件及其體外抗氧化活性.采用單因素和正交實驗對黃芪莖總皂苷的萃取工藝進行優(yōu)化；通過對超氧陰離子自由基的清除率和還原力對其抗氧化活性進行評價.得到微波輔助雙水相萃取黃芪莖總皂苷的最佳工藝條件：料液比（g∶mL）為1∶30，微波功率為500，W，醇水體積比（mL∶mL）為0.77，萃取時間為10，min，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.24，g/mL；雙水相萃取工藝對黃芪莖總皂苷的富集倍數(shù)為2.39；黃芪莖總皂苷提取液的抗氧化活性隨提取液質(zhì)量濃度的增加而逐漸提高，但其抗氧化活性低于VC.優(yōu)化后的微波輔助雙水相萃取黃芪莖總皂苷的工藝比較穩(wěn)定，黃芪莖總皂苷提取液具有一定的抗氧化活性.

黃芪莖；總皂苷；雙水相萃??；抗氧化活性

黃芪為多年生草本植物，株高1，m左右，主要產(chǎn)自我國東北、華北及西北等地區(qū)，生于林緣、灌叢或疏林下，性喜涼爽，耐寒耐旱，我國各地多有栽培，為常用中藥材之一.黃芪傳統(tǒng)應(yīng)用部位是黃芪的根，廣泛應(yīng)用于藥品、保健食品、功能飲料等工業(yè)中，具有補氣升陽、生津養(yǎng)血、益胃固表之功效［1］.目前，對于黃芪化學(xué)成分、藥理作用的研究越來越多［2-3］，而黃芪莖一直作為廢物被棄掉，其產(chǎn)量遠高于黃芪根［4］.近年來，有關(guān)于黃芪莖的化學(xué)成分、藥理作用的研究工作日漸深入［5-7］，其在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域已開始應(yīng)用［8］，對黃芪莖展開持續(xù)、深入的研究可以使其得到更為廣泛的利用.

雙水相體系是一種具有工藝條件溫和、生物親和性好等優(yōu)點的新型分離技術(shù)，已應(yīng)用于天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)的分離［9］.聚乙二醇-無機鹽體系為傳統(tǒng)的雙水相萃取體系，但聚乙二醇回收利用較困難.而乙醇與無機鹽和水以適當濃度混合時，亦能形成雙水相體系［10］，該雙水相水體系能夠克服傳統(tǒng)雙水相體系相分離時間長的缺點，而且價格低廉，溶劑易于回收利用［11-12］.其中，乙醇-硫酸銨雙水相提取體系已廣泛應(yīng)用于天然植物中活性成分的提?。?3］.而微波輻射能使植物細胞結(jié)構(gòu)松散，對中藥材的細胞產(chǎn)生膨爆作用，可以縮短提取時間、利于目標成分的溶出［14］.本實驗將微波與雙水相體系相結(jié)合［15］用于萃取黃芪莖總皂苷，并考察黃芪莖總皂苷提取液的體外抗氧化活性，旨在為黃芪莖的合理開發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

黃芪莖，吉林省均林中草藥種植有限公司；黃芪甲苷對照品，中國食品藥品檢定研究院；三羥甲基氨基甲烷，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；香草醛，天津市光復(fù)精細化工研究所；水為重蒸餾水；石油醚、冰醋酸、高氯酸、硫酸銨、鐵氰化鉀、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外-可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；MAS-Ⅱ型常壓微波輻射萃取儀，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；FA2004N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ118型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9076A型電熱鼓風干燥器，上海精密實驗設(shè)備有限公司.

1.3 線性關(guān)系考察及樣品中總皂苷含量的測定

精密稱取經(jīng)70，℃減壓干燥至質(zhì)量恒定的黃芪甲苷對照品2.5，mg，置于10，mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度.精密吸取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6，mL黃芪甲苷對照品溶液，分別置于具塞試管中，蒸干，各加入5%香草醛-冰醋酸溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）0.2，mL和高氯酸0.8，mL，65，℃水浴中加熱15，min后取出，冷卻至室溫，各加冰醋酸至5，mL，搖勻，30，min內(nèi)以不加黃芪甲苷對照品溶液的試劑作為空白對照，按照分光光度法，在560，nm處測定吸光度［16］.吸取黃芪莖提取液適量，按上述方法進行顯色，測定其吸光度，計算提取液中總皂苷的含量.

1.4 單因素實驗

1.4.1 醇水體積比對萃取率的影響

設(shè)定雙水相總體積為50，mL，加入硫酸銨13.5，g，分別設(shè)定醇水體積比為0.47、0.57、0.67、

0.77 、0.87 ，形成穩(wěn)定的雙水相體系，加入脫脂的黃芪莖粉2，g，于微波功率500，W提取5，min，過濾，濾液于分液漏斗中靜置分層，上層乙醇相以相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容，下相用無水乙醇析鹽，過濾后以無水乙醇定容至50，mL，吸取上、下相溶液各適量［17］，按1.3方法測定總皂苷含量，計算總皂苷萃取率.

式中：m1為上層乙醇相中總皂苷質(zhì)量，g；m2為下層水相中總皂苷質(zhì)量，g.

1.4.2 硫酸銨質(zhì)量濃度對萃取率的影響

雙水相總體積為50，mL，選擇醇水體積比為0.77，分別加入硫酸銨7.5、10.5、13.5、16.5、19.5，g，硫酸銨質(zhì)量濃度分別為0.15、0.21、0.27、0.33、0.39，g/mL，形成穩(wěn)定的雙水相體系，然后按1.4.1方法計算總皂苷萃取率.

1.4.3 微波萃取時間對萃取率的影響

雙水相總體積為50，mL，選擇醇水體積比為0.77，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.21，g/mL，形成穩(wěn)定的雙水相體系，微波萃取時間分別為1、5、10、15、20、25，min，然后按1.4.1方法計算總皂苷萃取率.

1.4.4 料液比（g∶mL）對萃取率的影響

醇水體積比為0.77，料液比分別設(shè)定為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.21，g/mL，微波功率為500，W，微波萃取10，min，然后按1.4.1方法計算總皂苷萃取率.

1.4.5 微波功率對萃取率的影響

醇水體積比為0.77，料液比為1∶30，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.21，g/mL，形成穩(wěn)定的雙水相體系，設(shè)定微波功率分別為300、400、500、600、700、800，W，微波萃取10，min，按1.4.1方法計算總皂苷萃取率.

1.5 正交實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上選取萃取時間、料液比、硫酸銨質(zhì)量濃度、微波功率4個因素進行L9（34）正交設(shè)計，進一步考察各因素對黃芪莖總皂苷萃取率的影響.

1.6 工藝驗證性實驗

為了考察上述優(yōu)選的微波輔助雙水相萃取工藝的穩(wěn)定性，按優(yōu)化的萃取工藝條件，即醇水體積比為0.77、微波萃取時間10，min、料液比1∶30，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.24，g/mL，微波功率為500，W，重復(fù)實驗3次，計算總皂苷萃取率.同時將上層乙醇相制成干浸膏，測定干浸膏中總皂苷的含量.

1.7 對比實驗

稱取脫脂處理后的黃芪莖粉2，g，以醇水體積比0.77加入乙醇水溶液60，mL，設(shè)定微波功率為500，W，微波輔助提取10，min，過濾，濾液制成干浸膏，測定干浸膏中總皂苷的含量.

1.8 體外抗氧化性實驗

1.8.1 清除超氧陰離子自由基測定

將黃芪莖總皂苷提取液分別配制成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2，mg/mL的供試品溶液，待用.吸取4.0，mL Tris-HCl緩沖液（50，mmoL/L，pH 8.2）分別置于10，mL試管中，于25，℃水浴中預(yù)熱20，min，分別加入2.0，mL不同質(zhì)量濃度的黃芪莖總皂苷提取液和30，mmoL/L鄰苯三酚溶液2.0，mL，混勻后于25，℃水浴中反應(yīng)5，min，加入10，mmoL/L HCl溶液1.0，mL終止反應(yīng)，以Tris-HCl緩沖液為空白，于波長320，nm處測其吸光度A1；其他條件不變，用同體積蒸餾水替代測定A1實驗中的鄰苯三酚溶液，于320，nm波長處測其吸光度A2；其他條件不變，用同體積蒸餾水替代測定A1實驗中的黃芪莖總皂苷提取液，于320，nm波長處測其吸光度A3.

將VC配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6，mg/mL的對照液，同上操作.按照式（2）計算黃芪莖總皂苷提取液、VC溶液對超氧陰離子自由基的清除率［18］.

1.8.2 還原力測定

分別吸取1.8.1節(jié)不同質(zhì)量濃度的黃芪莖總皂苷提取液1.0，mL，置于10，mL具塞試管中，加入磷酸鹽緩沖溶液（0.2，moL/L，pH 6.6）2.5，mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5，mL，混合均勻后將該體系置于50，℃恒溫水浴中恒溫20，min，迅速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液1.0，mL，5，000，r/min 離心10，min，移取2.5，mL上清液于另一試管中，加入2.5，mL 蒸餾水和0.5，mL 0.1% 三氯化鐵溶液，混勻，靜置10，min，以80%的乙醇溶液為空白，在700，nm波長處測定吸光度A［19］.其他條件不變，用蒸餾水替代上步測定吸光度A實驗中的黃芪莖總皂苷提取液，在700，nm波長處測定吸光度A0，A與A0的差值越大表示供試品溶液的還原能力越強.

將VC配制成質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12，mg/mL的對照溶液，同上操作.按照式（3）計算黃芪莖總皂苷提取液、VC溶液的還原力.

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪甲苷的標準曲線

以黃芪甲苷對照品溶液的吸光度為縱坐標，質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為y=3.366x-0.005，5，R2=0.999，1.結(jié)果表明黃芪甲苷在0.05～0.175，mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系.

2.2 單因素實驗

2.2.1 醇水體積比對萃取率的影響

醇水體積比對萃取率的影響結(jié)果如圖1所示.當醇水體積比在0.47～0.87范圍內(nèi)，總皂苷萃取率先隨著醇水體積比的增大而逐漸提高，但萃取率的提高幅度較??；當醇水體積比為0.77時，萃取率達到最高值84.58%，繼續(xù)增加醇水體積比，萃取率開始下降.整體而言，在0.47～0.87范圍內(nèi)醇水體積比對總皂苷萃取率的影響不是很顯著.

圖1 醇水體積比對萃取率的影響Fig. 1Influence of ratio between ethanol and water on extraction efficiency

2.2.2 硫酸銨質(zhì)量濃度對萃取率的影響

硫酸銨質(zhì)量濃度對萃取率的影響如圖2所示.硫酸銨質(zhì)量濃度在0.15～0.39，g/mL范圍內(nèi)，總皂苷萃取率先增大后開始逐漸降低.當硫酸銨質(zhì)量濃度為0.21，g/mL時，總皂苷萃取率達到最高值85.64%；當硫酸銨質(zhì)量濃度超過0.21，g/mL后，可能是水相產(chǎn)生了一定的鹽析效應(yīng)而使萃取率開始下降.

2.2.3 微波萃取時間對萃取率的影響

微波萃取時間對萃取率的影響結(jié)果如圖3所示，隨萃取時間的延長，總皂苷的萃取率先逐漸增大后開始降低，當萃取時間達到10，min 時萃取率達到最高值86.76%.這可能是因為萃取時間短，萃取不完全，從而導(dǎo)致萃取率低；而如果萃取時間過長，某些皂苷類化合物受熱結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致萃取率下降.

圖2 硫酸銨質(zhì)量濃度對萃取率的影響Fig. 2 Influence of mass concentration of ammonium sulfate on extraction efficiency

圖3 萃取時間對萃取率的影響Fig. 3 Influence of extraction time on extraction efficiency

圖4 料液比對萃取率的影響Fig. 4Influence of feed to liquid ratio on extraction efficiency

圖5 微波功率對萃取率的影響Fig. 5Influence of microwave power on extraction efficiency

2.2.4 料液比（g∶mL）對萃取率的影響

料液比對萃取率的影響結(jié)果如圖4所示.當料液比在1∶10～1∶30范圍內(nèi)，總皂苷的萃取率開始隨著料液比的提高而增大，當料液比達到1∶20時，萃取率達到86.07%；繼續(xù)提高料液比，總皂苷的萃取率緩慢增加，當料液比達到1∶30時，萃取率達到最大值88.60%；再繼續(xù)增大料液比，黃芪莖總皂苷的萃取率變化不明顯，且略有下降.這可能是因為隨著料液比的增大，提取溶劑用量增大，溶劑與黃芪莖粉末之間接觸面積增大，利于黃芪莖總皂苷的溶出，導(dǎo)致黃芪莖總皂苷的萃取率逐漸提高.如果繼續(xù)增大料液比，會使提取溶劑用量進一步增大，對總皂苷產(chǎn)生了稀釋作用［20］，從而使黃芪莖總皂苷的萃取率略有下降.

2.2.5 微波功率對萃取率的影響

微波功率對萃取率的影響結(jié)果如圖5所示.開始時黃芪莖總皂苷的萃取率隨著微波功率的增加而逐漸提高，當微波功率為500，W時，萃取率達到最高值88.28%，而后隨著微波功率的增高而逐漸下降.這可能是因為微波功率超過一定值以后，短時間內(nèi)會引起部分皂苷結(jié)構(gòu)被破壞所造成的.

2.3 正交實驗

通過單因素實驗結(jié)果可知，醇水體積比在0.47～0.87范圍內(nèi)，總皂苷萃取率在81.59%～84.58%范圍內(nèi)變化，對萃取率影響較小，所以在正交實驗中選取微波功率（A）、硫酸銨質(zhì)量濃度（B）、料液比（C）、萃取時間（D）進行L9（34）正交實驗，結(jié)果見表1.

表1 正交實驗結(jié)果Tab. 1 Experimental results of orthogonal test

由表1可知，4種因素對黃芪莖總皂苷萃取率的影響為料液比＞硫酸銨質(zhì)量濃度＞萃取時間＞微波功率.黃芪莖總皂苷的最佳萃取工藝條件是A2B3C2D2，即醇水體積比為0.77、微波萃取時間10，min、料液比1∶30，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.24 g/mL，微波功率為500，W.

2.4 工藝驗證實驗

3 次工藝驗證實驗黃芪莖總皂苷的萃取率分別為90.34%、89.73%、90.56%，平均為90.21%，相對標準偏差（RSD）為0.48%，干浸膏中的總皂苷的含量分別為12.80%、12.73%、12.86%，平均為12.80%.實驗結(jié)果表明經(jīng)過單因素及正交實驗優(yōu)選的萃取工藝條件穩(wěn)定，適合規(guī)模化生產(chǎn).

2.5 對比實驗

在不加入分相鹽硫酸銨的條件下，按照1.7節(jié)提取工藝進行微波提取3次，同法制成干浸膏.經(jīng)含量測定可知干浸膏中的總皂苷的含量分別為5.37%、5.33%、5.34%，平均含量為5.35%.而微波輔助雙水相法制得的干浸膏中的總皂苷的含量平均為12.80%.由實驗結(jié)果可知，由于分相鹽硫酸銨的加入，使干浸膏中的總皂苷的含量提高了7.45%，對黃芪莖中的皂苷類成分起到了一定的富集作用，對總皂苷的富集倍數(shù)為2.39.

2.6 體外抗氧化性實驗

2.6.1 清除超氧陰離子自由基實驗

黃芪莖總皂苷提取液和VC溶液清除超氧陰離子自由基的能力結(jié)果如圖6所示.

圖6 黃芪莖總皂苷提取液、VC溶液清除超氧陰離子自由基的能力Fig. 6 Scavenging activities of Astragalus stem extraction and VC solution for superoxide anion free radical

黃芪莖總皂苷提取液和VC溶液對超氧陰離子自由基的清除率隨著其質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，當質(zhì)量濃度為0.6，mg/mL時，黃芪莖總皂苷提取液和VC溶液對超氧陰離子自由基的清除率分別為43.76%、98.85%.

研究結(jié)果表明，黃芪莖總皂苷提取液對超氧陰離子自由基具有一定的清除能力，但其清除能力低于VC溶液.

2.6.2 還原力實驗

黃芪莖總皂苷提取液和VC溶液的還原力實驗結(jié)果如圖7所示.黃芪莖總皂苷提取液和VC溶液的還原力隨著其質(zhì)量濃度的增加而越來越強，但黃芪莖總皂苷提取液的還原力低于VC溶液的.研究表明，黃芪莖總皂苷提取液具有一定的還原作用，但還原能力較弱.

圖7 黃芪莖總皂苷提取液、VC溶液的還原力Fig. 7The reducing power of Astragalus stem extraction and VC solution

3 結(jié) 論

（1）通過單因素和正交實驗對黃芪莖總皂苷的微波輔助雙水相萃取工藝進行優(yōu)化，結(jié)果表明黃芪莖總皂苷的最佳萃取工藝條件是：醇水體積比0.77，料液比1∶30（g∶mL），微波萃取時間10，min，硫酸銨質(zhì)量濃度0.24，g/mL，微波功率500，W.

（2）在微波輔助雙水相最佳提取工藝下得到的黃芪莖總皂苷提取溶液，制成干浸膏的總皂苷純度為12.80%；而在不加入分相鹽硫酸銨的微波提取條件下得到的黃芪莖總皂苷提取溶液，制成干浸膏的總皂苷純度為5.35%，由于分相鹽的加入，干浸膏的總皂苷純度提高了7.45%，對總皂苷的富集倍數(shù)為2.39.

（3）黃芪莖總皂苷提取液的還原力和對超氧自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高.結(jié)果說明黃芪莖總皂苷提取液具有一定的抗氧化能力，但其抗氧化能力明顯弱于VC.

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責任編輯：郎婧

Microwave Assisted Aqueous Two-phase Extraction of Total Saponins
from Astragalus Stem and the Antioxidant Activity of the Extracts

ZHONG Fangli1，WANG Wenjiao1，2，WANG Xiaolin1，CAO Ye1
（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China；2.School of Chemistry，Jilin University，Changchun 130012，China）

Microwave assisted aqueous two-phase extraction was applied to extract the total saponins in Astragalus stems and the antioxidant ability of the extracts in vitro was also investigated.Both single factor and orthogonal tests were employed to optimize the extraction technology.The antioxidant ability of the extraction solution was evaluated according to its scavenging activity and reducing power for superoxide anion free radical.The optimal feed liquid ratio，the microwave power，the ratio between ethanol and water，extraction time and mass concentration of ammonium sulfate were 1∶30（g∶mL），500，W，0.77（mL∶mL），10，min and 0.24，g/mL，respectively.The concentration of the total saponins in Astragalus stems was enriched 2.39，times with aqueous two-phase extraction.The antioxidant activity was gradually enhanced with the increase of mass concentration of extract solution，but it was inferior to that of VC solution.This new technology is stable and the extraction solution has certain antioxidant activity.

Astragalus stems；total saponins；aqueous two-phase；antioxidant activity

R927.2

A

1672-6510（2016）05-0025-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150192

2015-11-05；

2016-01-07

鐘方麗（1970—），女，山東安丘人，教授；通信作者：王曉林，副教授，wangxiaolin69@eyou.com.