堿性蛋白酶的異源表達(dá)及其在制備CPP中的應(yīng)用

凌 敏，董自星，李 玉，葉 松，王正祥，路福平

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院；2. 天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457）

堿性蛋白酶的異源表達(dá)及其在制備CPP中的應(yīng)用

凌 敏1，董自星2，李 玉1，葉 松1，王正祥2，路福平1

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院；2. 天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津 300457）

堿性蛋白酶是現(xiàn)代工業(yè)酶制劑中最重要的酶類之一，在人類日常生活中扮演著非常重要的角色.本研究以嗜堿芽胞桿菌（B. alcalophilus）TCCC11006基因組為模板，從中擴(kuò)增出堿性蛋白酶基因apr，并構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pHY-apr，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入蛋白酶基因缺失的地衣芽胞桿菌（B. licheniformis）H115中，實(shí)現(xiàn)了堿性蛋白酶的分泌表達(dá).重組菌在LB培養(yǎng)基中最高酶活力達(dá)到3，199，U/mL，是出發(fā)菌株酶活力的1.82倍，發(fā)酵周期縮短了8，h.然后通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)重組堿性蛋白酶水解酪蛋白的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳水解溫度、pH和酶添加量分別為50，℃、9.5和4，000，U/g.在最佳水解條件下，通過鋇-乙醇沉淀的方法制備生物活性肽——酪蛋白磷酸肽（CPP），其得率和氮磷物質(zhì)的量比分別為14.8%和8.47.這為堿性蛋白酶在功能性食品制造方面的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ).

堿性蛋白酶；異源表達(dá)；水解；酪蛋白磷酸肽

堿性蛋白酶是指在pH偏堿性范圍內(nèi)水解蛋白質(zhì)肽鍵的一大類酶類，是目前工業(yè)中用量較多的酶之一［1］，其每年銷售額占全世界酶類銷售額的60%［2］.隨著人們對(duì)堿性蛋白酶應(yīng)用研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在洗滌劑、食品加工、醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)、皮革制造、絲綢制造等行業(yè)都有十分重要的作用［3-9］.其中，地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌是我國(guó)堿性蛋白酶的主要生產(chǎn)菌，但地衣芽胞桿菌具有比枯草芽胞桿菌更強(qiáng)的分泌表達(dá)系統(tǒng)，大約是枯草芽胞桿菌分泌能力的2倍，且地衣芽胞桿菌生長(zhǎng)較慢，有利于剛分泌的蛋白充分折疊和運(yùn)輸［10］.另外，利用微生物源堿性蛋白酶制備酪蛋白磷酸肽（CPP）已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn).被譽(yù)為“礦物質(zhì)載體”的酪蛋白磷酸肽具有促進(jìn)鈣、鐵、鋅、硒離子的吸收和利用的功能，也是目前促進(jìn)鈣吸收較好的生物活性劑，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域［11］.現(xiàn)階段，CPP的生產(chǎn)通常采用價(jià)格較高的胰蛋白酶［12］，這在很大程度上限制了CPP的應(yīng)用.因此，國(guó)內(nèi)外許多專家學(xué)者都在尋找一種價(jià)格較為低廉的微生物源蛋白酶代替胰蛋白酶來制備CPP.而篩選高表達(dá)蛋白酶的新菌種、菌種誘變和構(gòu)建高表達(dá)的重組菌是解決這個(gè)問題的主要方法.

目前，利用芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白酶來制備CPP的研究較少.本研究通過重組DNA的手段實(shí)現(xiàn)嗜堿芽胞桿菌來源的堿性蛋白酶在地衣芽胞桿菌中的分泌表達(dá)，提高其表達(dá)量并縮短了發(fā)酵周期.利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化重組堿性蛋白酶水解酪蛋白的工藝參數(shù)，提高產(chǎn)品中CPP的純度.旨在為堿性蛋白酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及其替代胰蛋白酶制備CPP等方面奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

嗜堿芽胞桿菌（B.alcalophilus）TCCC11006、地衣芽胞桿菌（B.licheniformis）H115（蛋白酶基因缺失菌株）宿主菌和表達(dá)載體pHY等均由本研究室保藏.

1.1.2 培養(yǎng)基

嗜堿芽胞桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏 8，酵母浸粉 2，多聚蛋白胨 5，NaCl 2，瓊脂 17，酪蛋白 4，K2HPO418，pH自然.

嗜堿芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉 17，棉籽餅粉 30，麥芽糊精 100，檸檬酸鈉 3，氯化鈣2.6，K2HPO418，pH自然.

地衣芽胞桿菌H115生長(zhǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10.

干酪素篩選培養(yǎng)基（g/L）：干酪素 8，酵母抽提物2，K2HPO414，KH2PO46，（NH4）2SO42，瓊脂粉20，pH 7.2～7.4.

1.1.3 主要試劑

Pyrobest DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4，DNA連接酶、DNA Marker和瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa公司；卡那霉素、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、小量DNA產(chǎn)物純化試劑盒、福林酚和酪蛋白等均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；其他分析純?cè)噭┚杀本﹪?guó)藥集團(tuán)有限公司提供.

1.2 方法

1.2.1 堿性蛋白酶基因的擴(kuò)增

參照GenBank報(bào)道的嗜堿芽胞桿菌TCCC11006菌株堿性蛋白酶apr基因序列（GenBank登錄號(hào)：FJ940727.1）設(shè)計(jì)引物.上游引物為5′-CGC GGATCC GCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATAT-3′；下游引物為5′-TCCCCCGGGTTAGCGTGTTGCCGC TTCT-3′.其中在上游引物和下游引物中分別加入BamHⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn).PCR反應(yīng)體系為PyrobestTMDNA聚合酶0.25，μL、10×Pyrobest bufferⅡ（Mg2+Plus）5，μL、dNTP Mixture（2.5，mmol/L）4，μL、模板1，μL、上游引物和下游引物各1，μL、超純水37.75，μL；PCR反應(yīng)條件為94，℃ 5，min，94，℃ 30，s，55，℃ 30，s，72，℃ 60，s，72，℃ 10，min，15，℃ 60，min.嗜堿芽胞桿菌基因組DNA的提取、質(zhì)粒DNA的制備等方法參考文獻(xiàn)［13］.

1.2.2 重組質(zhì)粒pHY-apr的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證

將擴(kuò)增出來的堿性蛋白酶基因片段與質(zhì)粒pHY分別進(jìn)行酶切、純化，再進(jìn)行連接.采用電轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入地衣芽胞桿菌H115中，并在含有20，μg/mL卡那霉素的酪素篩選培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選、驗(yàn)證.

1.2.3 重組菌的驗(yàn)證

在含有20，μg/mL卡那霉素的酪素篩選培養(yǎng)基上對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行點(diǎn)接.觀察有無透明圈形成.

1.2.4 重組菌堿性蛋白酶的表達(dá)

將驗(yàn)證正確的重組菌接種到含有20，μg/mL卡那霉素的30，mL LB液體培養(yǎng)基中，37，℃、200，r/min培養(yǎng)過夜后，按照2%的接種量轉(zhuǎn)接到50，mL LB發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，每隔8，h取樣，取樣后將發(fā)酵液12，000，r/min離心10，min，測(cè)定上清液酶活力.

1.2.5 堿性蛋白酶活力的測(cè)定

按照GB/T 23527—2009［14］測(cè)定酶活力，1個(gè)酶活力單位（U）是1，mL酶液在40，℃、pH 10.5條件下反應(yīng)1，min產(chǎn)生1，μg酪氨酸所需要的酶量.

1.2.6 重組堿性蛋白酶水解酪蛋白工藝參數(shù)的確定

酪蛋白水解度的測(cè)定采用茚三酮比色法［15］.酪蛋白溶液總氮含量的測(cè)定采用微量凱氏定氮法［16］.水解度（DH）按照式（1）進(jìn)行計(jì)算.

式中：c為樣品中氨基的含量，μmol/mL；ρ為底物溶液中總氮含量，mg/mL，6.25×ρ為水解物中蛋白的含量，mg/mL；Htot為1，g原料蛋白質(zhì)的肽鍵總數(shù)，酪蛋白的Htot為8.2，mmol/g.

（1）時(shí)間的變化對(duì)水解度的影響：用pH為10.5的硼砂-氫氧化鈉緩沖液配制100，mL 2%的酪蛋白溶液，按照2，000，U/g添加重組堿性蛋白酶，在40，℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行水解反應(yīng)，每隔30，min取樣，研究時(shí)間對(duì)酪蛋白水解度的影響.

（2）溫度的變化對(duì)水解度的影響：pH，10.5的條件下水解2%酪蛋白溶液，重組堿性蛋白酶的添加量為2，000，U/g，水解2，h，測(cè)定不同溫度下的水解度.

（3）pH的變化對(duì)水解度的影響：在水解溫度為50，℃條件下水解2%酪蛋白溶液，重組堿性蛋白酶的添加量為2，000，U/g，水解2，h，測(cè)定不同pH下酪蛋白溶液水解度.

（4）酶添加量的變化對(duì)水解度的影響：在pH，10.5、水解溫度50，℃的條件下水解2%酪蛋白溶液，水解2，h，測(cè)定不同酶添加量下酪蛋白溶液水解度.

（5）正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化：在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇水解溫度、pH和酶添加量3個(gè)因素，分別取3個(gè)水平，并以L9（33）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，通過方差分析篩選出關(guān)鍵因素，從而確定最優(yōu)水解條件組合.其中，正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和分析采用軟件正交實(shí)驗(yàn)助手Ⅱ 3.1.1進(jìn)行.

1.2.7 酪蛋白磷酸肽的制備與理化性質(zhì)檢測(cè)

在最佳水解條件下，采用鋇-乙醇沉淀法［17］制備CPP.總磷含量的測(cè)定參照GB/T 5009.87—2003［18］的鉬藍(lán)比色法.測(cè)定鋇-乙醇沉淀得到的粗品質(zhì)量（m1）和初始酪蛋白質(zhì)量（m2），按照式（2）計(jì)算酪蛋白磷酸肽得率.分別測(cè)定氮、磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（wN和wP），按照式（3）計(jì)算氮磷物質(zhì)的量比.

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶基因apr的擴(kuò)增

提取嗜堿芽胞桿菌TCCC11006染色體DNA，以此為模板，apr-F和apr-R為引物PCR擴(kuò)增堿性蛋白酶基因apr.所擴(kuò)增片段的大小為1，100，bp左右，與理論值（1，060，bp）相符（圖1）.

圖1 嗜堿芽胞桿菌TCCC11006，apr基因的PCR擴(kuò)增Fig. 1Amplification of apr gene encoded alkaline protease from B. alcalophilus TCCC11006

2.2 重組質(zhì)粒pHY-apr的構(gòu)建

將PCR獲得的片段經(jīng)過BamHⅠ酶切后，與經(jīng)過BamHⅠ和SmaⅠ酶切的表達(dá)載體pHY連接，采用電擊轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素的干酪素平板上篩選轉(zhuǎn)化子.其中，重組載體pHY-apr的構(gòu)建方案如圖2所示.

圖2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖Fig. 2Diagram of the construction of the recombined plasmid

2.3 重組菌的篩選和鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切后得到兩條大小分別為4.6，kbp和1.1，kbp的條帶（圖3），表明目的基因已經(jīng)插入到pHY載體上，將該重組子命名為pHY-apr.

圖3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 3 Identification of recombined plasmid through double digestion with BamHⅠ and SmaⅠ

2.4 重組菌驗(yàn)證

將含有目的基因的載體與不含目的基因片段的空載轉(zhuǎn)入地衣芽胞桿菌后，得到的轉(zhuǎn)化子分別在酪素篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行點(diǎn)接，培養(yǎng)32，h，結(jié)果如圖4所示.

圖4 重組菌鑒定Fig. 4 Identification of the recombined bacteria

2.5 重組菌與出發(fā)菌株的產(chǎn)酶水平比較

在發(fā)酵過程中，每隔8，h進(jìn)行取樣，測(cè)定上清液酶活力.重組菌H115/pHY-apr在LB發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵56，h時(shí)，酶活力達(dá)到最大，為3，199，U/mL；而出發(fā)菌株TCCC11006在發(fā)酵64，h時(shí)酶活力僅為1，758，U/mL（圖5）.

圖5 重組菌與出發(fā)菌株發(fā)酵酶活的比較Fig. 5 Comparison of the activities of alkaline proteases from the recombined strain and the starting strain

2.6 重組堿性蛋白酶水解酪蛋白工藝條件的確定

2.6.1 時(shí)間的變化對(duì)水解度的影響

重組堿性蛋白酶水解2%酪蛋白溶液時(shí)，其水解度（DH）隨著時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖6所示.由圖6可知，水解時(shí)間為0.5～2，h，水解度隨著時(shí)間的增加而變大.當(dāng)水解時(shí)間為2，h時(shí)，水解度達(dá)到15.6%.繼續(xù)增加水解時(shí)間，水解度保持不變.

圖6 不同時(shí)間段酪蛋白水解度比較Fig. 6 Effects of time on the hydrolysis of casein

2.6.2 溫度對(duì)水解度的影響

不同溫度下，酪蛋白水解度的變化如圖7所示.在35～50，℃的溫度范圍內(nèi)，酪蛋白的水解度隨著溫度的增高而變大.當(dāng)溫度達(dá)到50，℃時(shí)，蛋白酶的水解度達(dá)到17.9%.繼續(xù)增加溫度，水解度反而降低.

圖7 溫度對(duì)水解度的影響Fig. 7 Effects of temperature on the degree of hydrolysis

2.6.3 pH對(duì)水解度的影響

不同pH對(duì)水解度的影響如圖8所示.當(dāng)反應(yīng)pH達(dá)到9.5時(shí)，其水解度最大，為17.6%.但是，隨著反應(yīng)pH增大或減小，其水解度均逐漸變小.

2.6.4 酶添加量對(duì)水解度的影響

不同酶添加量對(duì)水解度的影響結(jié)果如圖9所示.在一定量的酶添加量的范圍內(nèi)，酪蛋白的水解度隨著酶量的增加而變大.添加量在1，000～4，000，U/g范圍內(nèi)，水解度變化較明顯，但是繼續(xù)增加酶的添加量時(shí)，其水解度基本保持不變.

圖8 pH對(duì)水解度的影響Fig. 8 Effects of pH on the degree of hydrolysis

圖9 酶添加量對(duì)水解度的影響Fig. 9 Effects of the amount of enzyme on the degree of hydrolysis

2.6.5 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取溫度（A）、pH（B）、酶添加量（C）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步考察各因素對(duì)酪蛋白水解度的影響.正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.

表1 水解度正交實(shí)驗(yàn)的因素水平和結(jié)果Tab. 1 Factors，levels and results of orthogonal experiment of the degree of hydrolysis

由表1可知，影響酪蛋白水解度的顯著性大小的順序?yàn)锳＞C＞B.通過正交實(shí)驗(yàn)確定了最佳水解條件為：水解溫度50，℃，pH，9.5，酶添加量4，000，U/g.

2.7 酪蛋白磷酸肽的制備

2.7.1 酪蛋白磷酸肽得率

參照鋇-乙醇沉淀法制備酪蛋白磷酸肽，用2，g固體酪蛋白經(jīng)過重組堿性蛋白酶在其最佳水解條件下進(jìn)行水解，經(jīng)過烘干后，得到酪蛋白磷酸肽粗品的質(zhì)量為0.296，g，得率為14.8%.

2.7.2 酪蛋白磷酸肽氮磷物質(zhì)的量比

按照酪蛋白磷酸肽含氮量和含磷量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，酪蛋白磷酸肽中氮含量為11.9%，磷含量為3.11%，氮磷物質(zhì)的量比為8.47.

3 討 論

本研究將堿性蛋白酶基因apr成功導(dǎo)入地衣芽胞桿菌H115中，并實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，在LB液體培養(yǎng)基（50，mL/250，mL）中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，其最大酶活力為3，199，U/mL，是出發(fā)菌株酶活的1.82倍，同時(shí)發(fā)酵周期較出發(fā)菌株縮短了8，h，為堿性蛋白酶的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ).

酪蛋白磷酸肽作為功能性食品的添加劑，日益受到人們的關(guān)注.目前，CPP的生產(chǎn)主要依賴于動(dòng)物源的胰蛋白酶，但是價(jià)格昂貴、提取較復(fù)雜、得率較低等一系列因素［19］，使得胰蛋白酶在CPP的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用方面受到限制.本研究中，利用微生物源的蛋白酶制備CPP，其中，用重組堿性蛋白酶水解2%酪蛋白溶液時(shí)，隨著水解時(shí)間的逐漸增加，其水解度也不斷增加，當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到2，h后，其水解度基本維持在15.8%左右；由于蛋白酶對(duì)溫度和pH比較敏感，研究發(fā)現(xiàn)，重組堿性蛋白酶在50，℃、pH為9.5時(shí)，其水解度較大，可能原因是重組堿性蛋白酶在溫度和pH不適宜的環(huán)境下，其穩(wěn)定性差有所降低，使重組酶受到不同程度的影響，導(dǎo)致水解度的降低［20］；另外，由于酶與底物的結(jié)合是有一定限制的，所以對(duì)其酶添加量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，酶添加量在4，000，U/g時(shí)，其水解度達(dá)到最大，所以本研究最終獲得的最佳水解條件是水解時(shí)間2，h，水解溫度50，℃，水解pH為9.5，酶添加量為4，000，U/g.

利用重組堿性蛋白酶在其最優(yōu)水解條件下水解酪蛋白制備CPP，CPP的得率為14.8%，氮磷物質(zhì)的量比為8.47，雖然得率與胰蛋白酶的17%相比稍有差距［19］.但是，本研究利用微生物源蛋白酶制備的CPP，具有更低的氮磷物質(zhì)的量比，純度更高，磷酸絲氨酸基團(tuán)更容易得到富集，使得其結(jié)合鈣離子的能力越強(qiáng)，阻止鈣離子沉淀的效果越好.這為其替代胰蛋白酶制備CPP以及在其他功能性食品的制造方面打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

［1］ Rao M，Tanksale A M，Ghatge M S，et al. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998，62（3）：597-635.

［2］ Reng G，Beg Q K，Lorenz P. Bacterial alkaline proteases：Molecular approaches and industrial applications［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2002，59（1）：15-32.

［3］ Deng A，Wu J，Zhang Y. Purification and characterization of a surfactant-stable high-alkaline protease from Bacillus sp. B001［J］. Bioresource Technology，2010，101（18）：7111-7117.

［4］ Liu Y H，Zhang T，Zhang Z M. Improvement of cold adaptation of Bacillus alcalophilus alkaline protease by directed evolution［J］. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2014，106：117-123.

［5］ Bhaskar N，Sudeepa E S，Rashmi H N，et al. Partial purification and characterization of protease of Bacillus proteolyticus CFR3001 isolated from fish processing waste and its antibacterial activities［J］. Bioresource Technology，2007，98（14）：2758-2764.

［6］ Sareen R，Mishra P. Purification and characterization of organic solvent stable protease from Bacillus licheniformis RSP-09-37［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，79（3）：399-405.

［7］ Rathod M，Pathak A P，Rathod M G，et al. Wealth from waste：Optimized alkaline protease production from agroindustrial residues by Bacillus alcalophilus LW8 and its biotechnological applications［J］. Journal of Taibah University for Science，2014，8（4）：307-314.

［8］ Grebeskova R. Using alkaline protease to intensify the processing of leather raw material［J］. Biotechnology，2007，6（4）：788-791.

［9］ Phadatare S U，Deshpande V V，Srinivasan M C. High activity alkaline protease from Conidioboulus coronatus：enzyme production and compatibility with commercial detergents［J］. Enzyme and Microbial Technology，1993，15（1）：72-76.

［10］ 黃文晶. 高產(chǎn)堿性蛋白酶重組菌及其發(fā)酵性能［D］. 無錫：江南大學(xué)，2012.

［11］ Ketnawa S，Martínez-Alvarez O，Benjakul S，et al. Gelatin hydrolysates from farmed Giant catfish skin using alkaline proteases and its antioxidative function of simulated gastro-intestinal digestion［J］. Food Chemistry，2015，192：34-42.

［12］ Korhonen H，Pihlanto A. Bioactive peptides：Production and functionality［J］. International Dairy Journal，2006，16（9）：945-960.

［13］ Dikshit K，Dikshit R P，Webster D A. Study of Vitreoscilla globin（vgb）gene expression and promoter activity in E. coli through transcriptional fusion［J］. Nucleic Acids Research，1990，18（14）：4149-4155.

［14］ 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 23527—2009蛋白酶制劑［S］. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

［15］ 楊文博，張英華. 蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定方法研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，2014（3）：88-90.

［16］ 寧正祥. 食品成分分析手冊(cè)［M］. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998.

［17］ 陳雪香，羅珍，劉飛，等. 酪蛋白磷酸肽的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法研究［J］. 食品工業(yè)科技，2012，33（8）：75-77.

［18］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 5009. 87—2003食品中磷的測(cè)定［S］. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［19］ 馮穎杰，宗紅，諸葛斌，等. 一種米曲霉蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)及其在酪蛋白磷酸肽制備中的應(yīng)用［J］. 微生物學(xué)通報(bào)，2015，11（3）：35-42.

［20］ Liu W，Wang M，Shao W，et al. A novel model to determine the dipeptides responsible for optimum temperature in F/10 xylanase［J］. Process Biochemistry，2005，40（3/4）：1389-1394.

責(zé)任編輯：郎婧

Heterologous Expression and Application of Gene Encoded Alkaline Protease in Preparation of CPP

LING Min1，DONG Zixing2，LI Yu1，YE Song1，WANG Zhengxiang2，LU Fuping1
（1. College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；
2.College of Chemical Engineering and Materials Science，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Alkaline protease is one of the most important enzymes in industrial enzymes.It plays a very important role in human daily life.Alkaline protease encoded gene（apr）was amplified from B.alcalophilus TCCC11006，genome.Then the recombined expression vector pHY-apr was successfully constructed and transformed into protease-deficient strain B.licheniformis H115.The alkaline protease gene was expressed in the recombined B.licheniformis H115.The highest alkaline protease activity was 3，199，U/mL in LB medium，which was 1.82，times of that of the starting strain.The fermentation cycle was decreased by 8，h.Then the hydrolyzing casein paramenters of recombined alkaline protease were optimized with single factor and orthogonal experiments.The optimum hydrolyzing time，temperature，pH and the amount of the enzyme were found to be 2，h，50，℃，9.5，and 4，000，U/g substrate.Under the optimal hydrolysis conditions，the yield and N/P mole ratio of the casein peptide phosphate（CPPs）prepared were 14.8% and 8.47，respectively.Knowledge gained in the research can be a solid foundation for the application of alkaline protease in the manufacturing of functional food.

alkaline protease；cloning expression；hydrolysis；CPP

TQ920.6

A

1672-6510（2016）05-0008-06

10.13364/j.issn.1672-6510.20150217

2015-11-25；

2016-02-05

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）資助項(xiàng)目（2013AA102106-07）

凌 敏（1990—），男，安徽合肥人，碩士研究生；通信作者：路福平，教授，lfp@tust.edu.cn.

數(shù)字出版日期：2016-05-19；數(shù)字出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20160519.1033.008.html.