生物抗氧化劑電化學(xué)檢測技術(shù)進(jìn)展

劉繼鋒，張 強(qiáng)，屠青霞，韓愛玲

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

生物抗氧化劑電化學(xué)檢測技術(shù)進(jìn)展

劉繼鋒，張 強(qiáng)，屠青霞，韓愛玲

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

生物體內(nèi)的氧化與抗氧化機(jī)制是生命科學(xué)研究較廣泛的課題.在氧化代謝過程中，活性氧物質(zhì)或自由基（ROS）逐漸積累，當(dāng)ROS相對于生物抗氧化劑（AO）過量時，會破壞生物大分子和細(xì)胞，并導(dǎo)致人體組織的功能損傷.因此，對AO的研究在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域具有重要的意義.傳統(tǒng)的AO檢測一般采用自由基反應(yīng)檢測，熱引發(fā)的ROS與AO進(jìn)行氧化還原競爭反應(yīng)，或者使用具有光學(xué)吸收或熒光特性的氧化劑，根據(jù)體系的光學(xué)吸收或熒光信號可以對AO進(jìn)行定量分析.我們發(fā)展了幾種ROS 淬滅型電化學(xué)檢測AO的方法，并且給出了相應(yīng)的動力學(xué)模型.AO電化學(xué)檢測技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是采用了電化學(xué)原位產(chǎn)生的ROS（H2O2、·OH等）作為AO分析的氧化性物質(zhì)，這些AO接近于人體內(nèi)源型ROS，因此得到的氧化還原動力學(xué)數(shù)據(jù)更加接近于人體實際發(fā)生的狀態(tài).

生物抗氧化劑；活性氧物質(zhì)；電化學(xué)檢測；光電化學(xué)檢測

在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，生物抗氧化劑（AO）包括酶或其他有機(jī)物，如維生素E、胡蘿卜素以及其他能夠抑制和減少動物組織氧化損傷的物質(zhì).在食品領(lǐng)域AO包括自由基鏈反應(yīng)抑制劑、金屬螯合劑、氧化酶抑制劑和抗氧化輔酶［1］.相對生物分子而言，AO在較低的濃度條件下可保護(hù)、防止或減少生物分子的氧化損傷［2］.

與AO相對應(yīng)的一個概念就是活性氧物質(zhì)（ROS），ROS通常是由氣態(tài)的氧直接或者間接轉(zhuǎn)化過來的，是比分子態(tài)氧反應(yīng)活性更高的分子或者含氧的自由基等具有活性基團(tuán)的總稱［3］.根據(jù)人體衰老與疾病發(fā)生的自由基理論［4］，人體衰老和疾病發(fā)生是一個氧化自由基不斷損傷核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、機(jī)體組織的過程，也是一個ROS氧化產(chǎn)物不斷積累的過程；AO能夠保護(hù)人體較少受到損傷，延緩衰老和抑制疾病的發(fā)生.氧化應(yīng)激是基于人體衰老與疾病的自由基理論提出的概念，是指破壞了ROS和AO水平的平衡導(dǎo)致的潛在傷害狀態(tài)，意味著AO水平低下或生物體的氧化損傷修復(fù)機(jī)能低下.人體內(nèi)的ROS主要是在呼吸鏈的能量傳遞過程（氧化磷酸化反應(yīng)為機(jī)體提供ATP）中產(chǎn)生的，攝入的氧分子在酶催化下，不是同時傳遞4個電子生成水，而是得到1個電子生成超氧陰離子自由基（），未參加呼吸鏈電子傳遞.人體呼吸的1%～3%的氧氣轉(zhuǎn)化成，占氧自由基來源約90%.是生成其他ROS、氮自由基的前軀體，通過系列反應(yīng)，生成更多的強(qiáng)氧化性的氧、氮自由基，例如：過氧化氫（H2O2）、一氧化氮（NO）、過氧亞硝基（ONOO-）、次鹵酸以及氧化破壞能力更強(qiáng)的羥基自由基（·OH）等.在人體代謝過程中不斷產(chǎn)生這些ROS，這些氧化性物質(zhì)在人體中的含量非?？捎^，例如人體內(nèi)每年大概生成2，kg H2O2［2］.另外，ROS和其他活性衍生物（如O2）［1］以及脂類分子（LH）過氧化的產(chǎn)物（如LO˙、LOO˙及LOOH）不斷地通過非酶反應(yīng)與酶反應(yīng)產(chǎn)生，這些自由基與生物體的代謝活動有著密切的聯(lián)系［5］.它們在生物代謝過程中扮演著雙重角色，對人體既有有利的一面，也有不利的一面.ROS含量較低或適度時能幫助人體調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)對缺氧、易感染的狀態(tài)，并起到細(xì)胞間信息傳導(dǎo)的作用，引發(fā)細(xì)胞有絲分裂過程.但是當(dāng)含量過高，ROS損害脂類、蛋白質(zhì)、DNA，并抑制生物大分子的功能.例如一個細(xì)胞中的DNA每天遭到500，000次氧、氮自由基，以及輻射、有毒藥物、突變引發(fā)劑的攻擊.正常情況下?lián)p傷的分子可以得到修復(fù)、置換、降解代謝和重新合成，因此不會造成ROS對機(jī)體的損傷.但當(dāng)人體長時間處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，ROS和AO的失衡導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生增多或機(jī)體清除能力減弱，最終導(dǎo)致組織損傷并引發(fā)疾病.例如DNA氧化損傷后功能改變，導(dǎo)致基因的過表達(dá)或產(chǎn)物蛋白活性增強(qiáng)，使細(xì)胞過度增殖形成腫瘤.所以人體長時間處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，ROS和AO的失衡導(dǎo)致一系列的生物氧化反應(yīng)，引發(fā)人體衰老和一系列疾病，例如神經(jīng)退行性疾?。ㄅ两鹕Y、阿茲海默氏癥等）、心腦血管疾病、糖尿病等.

人體內(nèi)的抗氧化機(jī)制分為酶和非酶兩大類.前者包括一些分解氧化物種的酶，例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，催化分解ROS的過程如下：

后者包括轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白、血清白蛋白等，這類AO結(jié)合金屬離子，降低Fenton反應(yīng)（Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH）生成羥基自由基（·OH）的幾率.非酶AO還包括維生素E、尿酸、谷胱甘肽等小分子，其作用機(jī)理主要是清除自由基［2］.

盡管人體中存在上述的抗氧化保護(hù)機(jī)制，但是仍然會有一些ROS逃過這個保護(hù)體系，造成氧化損傷.這時通過食物獲取的AO可以起到額外的保護(hù)作用.AO目前大多是從植物中提取出來的抗氧化劑，開發(fā)和利用天然AO已經(jīng)成為當(dāng)今食品科學(xué)的發(fā)展趨勢.大多數(shù)植物食品中都含有豐富的具有天然生物活性的AO，如蔬菜、水果和谷物，它們能夠降低人體的癌癥和慢性疾病的發(fā)生幾率［6，9-14］.

人們通常很關(guān)注所消費(fèi)食物的組成和抗氧化能力.由于食物構(gòu)成的復(fù)雜性，分離每一種抗氧化成分并對其進(jìn)行分別檢測成本較高且效率很低，而且食品中的AO可能具有協(xié)同作用，因此發(fā)展快速、定量分析AO總?cè)萘康募夹g(shù)，提高檢測食品以及人體組織中的AO水平有助于民眾選擇健康的飲食，及時了解身體的健康狀態(tài)，并可以有效預(yù)防疾病的發(fā)生.

目前常用的AO檢測方法主要有紫外-可見吸收光譜和熒光光譜方法，其中基于化學(xué)反應(yīng)一般分為兩種分析方法［1］：（1）基于氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）機(jī)理（圖1），AO作為H原子給體，與光學(xué)性質(zhì)的分子探針競爭與ROS的反應(yīng)，反應(yīng)式如下：

其中代表性檢測方法包括過氧自由基吸收能力方法（ORAC）［15］和自由基捕獲抗氧化綜合參數(shù)（TRAP）［16］.（2）基于電子轉(zhuǎn)移（ET）的反應(yīng)，即利用氧化還原反應(yīng)，氧化劑同時作為反應(yīng)進(jìn)行過程的顏色指示劑，反應(yīng)式如下：

代表性檢測方法包括：二苯代苦味酰肼自由基淬滅法（DPPH）［17］，主要應(yīng)用于植物藥物的分析；Trolox當(dāng)量抗氧化容量法（TEAC）［18］，用于非生物活性AO的分析，區(qū)分抗氧化添加或協(xié)同效應(yīng)；還原鐵離子（Fe（Ⅲ））的方法（FRAP）等［19］.這些方法主要側(cè)重于食品中總體AO、AO混合物以及協(xié)同效應(yīng)的檢測，無法很好地作到在線、活體、原位檢測生物體內(nèi)AO水平，也無法區(qū)別不同AO的抗氧化能力.在需氧生物體內(nèi)，導(dǎo)致AO水平變化的因素很多，目前還尚未開發(fā)出有效的針對具體組分的活體在線檢測技術(shù).針對目前分析方法中存在的問題，如果能在已有研究工作的基礎(chǔ)上，開發(fā)使用簡單、能夠產(chǎn)生人體內(nèi)源型ROS、選擇性好、線性工作范圍寬、便于實現(xiàn)活體在線AO檢測技術(shù)對于維護(hù)人體健康和疾病的早期預(yù)警具有很好的理論研究和應(yīng)用價值.

圖1 基于氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）抗氧化機(jī)理Fig. 1 Schema of antioxidant mechanism of hydrogen atom transfer（HAT）

電化學(xué)方法檢測AO是近期發(fā)展起來的新技術(shù)，較有代表性的是Campanella 小組開展過電化學(xué)檢測AO的研究工作，采用過氧化物歧化酶修飾電極的方法，依據(jù)的原理是AO存在時降低的濃度，因此檢測生成H2O2的電流信號大小，從而定量AO的抗氧化活性［20-21］.

本課題組已經(jīng)開展了AO檢測新技術(shù)的研究，先后設(shè)計了多種基于電化學(xué)的AO傳感器檢測方法，都是利用AO與其他可被氧化的物種競爭與體系中產(chǎn)生的ROS氧化反應(yīng)，但是不同的方法采用的ROS以及產(chǎn)生方式各有差別.AO的檢測線性范圍一般介于1×10-5～1×10-2mol/L，以下對相關(guān)方法逐一評述.

1 DNA/TiO2/ITO導(dǎo)電玻璃修飾電極檢測AO［22］——·OH淬滅型檢測

DNA/TiO2/ITO導(dǎo)電玻璃修飾電極的制備方法和工作原理如圖2所示［22］.這是利用 DNA修飾電極作為AO電化學(xué)傳感器的方法，該方法的關(guān)鍵是光催化TiO2生成·OH.TiCl4水解在ITO表面形成一層TiO2納米薄膜，作為吸附DNA的基底.在UV（365，nm）照射下，TiO2產(chǎn)生·OH氧化損傷DNA.使用具有電化學(xué)活性的DNA嵌入染料（亞甲基藍(lán)，MB）作為DNA氧化損傷的電化學(xué)探針.顯然，DNA骨架或者堿基序列損壞程度越大，染料嵌入量越少，電化學(xué)信號就越低.因此使用電化學(xué)信號作為DNA損傷的定量依據(jù).

圖2 DNA/TiO2/ITO導(dǎo)電玻璃修飾電極的制備方法和工作原理Fig. 2Preparation and working principle of DNA/TiO2/ ITO conductive glass modified electrode

電極表面的反應(yīng)過程如下：

當(dāng)體系中存在待檢測AO時，AO對·OH的淬滅反應(yīng)如下：

根據(jù)AO存在與否電極電流的差別定量分析AO.這種傳感器檢測AO的優(yōu)點(diǎn)是利用了人體內(nèi)源型的ROS和DNA作為與AO的競爭反應(yīng)條件，因此得到的AO抗氧化活性數(shù)據(jù)可以很好模擬人體內(nèi)的實際情況.缺點(diǎn)是傳感器的制備較為復(fù)雜，尤其是TiO2納米涂層制備和DNA吸附層需要專業(yè)人員操作，還需要一定UV照射時間（30，min），增加了檢測時長.

2 金屬納米顆粒修飾電極檢測AO［23］——·OH淬滅型檢測

該方法是利用氧分子在金屬納米顆粒催化下，在電極表面還原生成的H2O2中間體解離生成·OH（圖3）［23］，反應(yīng)機(jī)理如下：

圖3 金屬納米顆粒修飾電極檢測AO工作原理Fig. 3 Working principle of AO detected by metal nanoparticle modified electrode

電極表面沉積的納米Pd顆粒與AO競爭反應(yīng)過程產(chǎn)生的·OH，顯然AO存在時，Pd的還原電流降低，根據(jù)AO存在與否的電化學(xué)電流的差異對AO濃度關(guān)系定量分析AO的抗氧化活性，即方法的定量分析依據(jù)是［IC-IC，Ao］-1對［AO］-1的線性關(guān)系斜率（圖4［23］）.

這種金屬納米顆粒修飾電極檢測AO的優(yōu)點(diǎn)是利用了人體內(nèi)源型的ROS作為與AO的競爭反應(yīng)條件，使用簡便，放入待測溶液后，施加掃描電位，1，min內(nèi)即可得到檢測結(jié)果.缺點(diǎn)是不適用于在金屬納米顆粒表面發(fā)生吸附的體系，例如含有蛋白質(zhì)的體系.因為納米顆粒吸附之后難以進(jìn)行氧化還原反應(yīng).

圖4 由方程（5）得到的線性關(guān)系Fig. 4 Linear relationship obtained by equation（5）

3 Fe配合物含鐵蛋白修飾電極檢測AO［24］——H2O2淬滅型檢測

這種方法（圖5［24］）中使用Fe配合物、含鐵蛋白作為電極表面修飾劑，催化氧分子還原產(chǎn)生H2O2，H2O2氧化還原態(tài)FeⅡ從而形成FeⅡ/Ⅲ的催化還原電流，同時H2O2氧化體系中的AO，即AO與還原態(tài)FeⅡ競爭與H2O2的反應(yīng)，反應(yīng)過程如下：

圖5 Fe配合物、含鐵蛋白修飾電極檢測AO工作原理Fig. 5Working principle schema of AO detected by Fe complexes and iron-containing protein modified electrode

該方法的定量分析依據(jù)是［IC，O2-IC，Ao］-1對［AO］-1的線性關(guān)系斜率（圖6［24］）.

這種AO檢測方法的優(yōu)點(diǎn)是利用人體內(nèi)源型的ROS作為與AO的競爭反應(yīng)條件，而且可以用于實際樣本（例如唾液）的檢測.由于氧化還原的位點(diǎn)是吸附在TiO2納米涂層上的含F(xiàn)e配合物以及蛋白，因此被分析樣本中的蛋白質(zhì)等大分子吸附遮蓋的幾率較小.另外這種傳感器可批量制作，推廣使用的價值較好.缺點(diǎn)是TiO2納米涂層的制備以及傳感器制作的批量重現(xiàn)性需要專業(yè)人員操作才可以保證.

圖6 AO活性比較Fig. 6 Activity comparison of AO

4 磁性納米材料與鳥嘌呤/石墨烯復(fù)合材料修飾電極檢測AO［25］——·OH與H2O2復(fù)合淬滅型檢測

鳥嘌呤分子作為氧化探針，鍵合在納米四氧化三鐵/石墨烯復(fù)合材料上，從而能夠被外加磁場所吸附，固定于電極表面.首先，在生理條件的緩沖溶液中，電極表面施加一個負(fù)電位，使得氧還原反應(yīng)可以在原位發(fā)生，產(chǎn)生活性氧基團(tuán)，損傷抗氧化劑以及鍵合的鳥嘌呤分子，即AO與鳥嘌呤競爭與ROS的氧化還原反應(yīng).然后，修飾電極向正電位方向掃描，記錄鳥嘌呤分子的電化學(xué)氧化信號，用以定量檢測抗氧化劑.圖7［25］是傳感器的工作原理示意圖.當(dāng)檢測結(jié)束后，移去磁場，磁性納米粒子就可以被沖洗掉，進(jìn)而獲得連續(xù)操作的可能，免去了置換以及打磨電極的繁瑣步驟.

圖7 磁性納米材料與鳥嘌呤/石墨烯復(fù)合材料修飾電極檢測AO傳感器的工作原理Fig. 7 Working principle of AO sensor detected by magnetic nano-materials and guanine/graphene composites modified electrode

電極表面發(fā)生的反應(yīng)過程包括：

鳥嘌呤的氧化電流是與FeⅢ和H2O2的還原有關(guān)的，因此可以給出鳥嘌呤電流值IG.當(dāng)溶液中存在抗氧化劑和溶解氧時，鳥嘌呤-Fe3O4/石墨烯磁性修飾電極的催化電流可以表示為IAo.當(dāng)存在AO時，得

G到［IGAo- IG］-1對 ［AO］-1的線性關(guān)系.其斜率值能用來比較AO的抗氧化活性，直線的斜率越小，表明該AO的抗氧化能力越強(qiáng)［25］.從圖8［25］中可以觀察到，對·OH及H2O2的清除能力依次為鞣酸、維生素C、水溶性維生素E、谷胱甘肽.

圖8 抗氧化劑能力的比較Fig. 8 Comparison of the antioxidant capacity

這種AO檢測方法是針對流動體系連續(xù)檢測AO提高檢測通量設(shè)計的，具有第2、3種檢測方法的優(yōu)點(diǎn)，但存在的缺點(diǎn)是電化學(xué)原位產(chǎn)生ROS過程時間較長（15，min），因此，進(jìn)一步開發(fā)電化學(xué)原位產(chǎn)生ROS的材料，提高檢測通量是該方法改進(jìn)的方向.

5 光電化學(xué)檢測AO［26］——·OH與陽離子空穴淬滅型檢測

以TiO2納米顆粒光催化反應(yīng)為模型，研究了反應(yīng)過程中的活性氧（ROS）產(chǎn)生以及活性氧淬滅的反應(yīng)動力學(xué)模型（圖9［26］）.對苯二甲酸分子與體系中的光催化反應(yīng)產(chǎn)生的·OH反應(yīng)生成具有熒光性質(zhì)的2-羥基對苯二甲酸（λex=315，nm，λem=425，nm），因此對苯二甲酸作為氧化探針分子與體系中的生物抗氧化劑（AO）分子競爭與ROS的反應(yīng)，根據(jù)體系的熒光、反應(yīng)時間以及AO的濃度建立了AO淬滅ROS的反應(yīng)動力學(xué)模型，根據(jù)該模型推導(dǎo)AO清除ROS的動力學(xué)常數(shù).

該體系中的反應(yīng)機(jī)理包括：

光電轉(zhuǎn)化效率（IPCE）是溶液吸光度A、空穴-電子產(chǎn)生效率、入射光強(qiáng)度的函數(shù)，在短的時間內(nèi)，［AO］也可以被視為一個常數(shù)，所獲得的線性方程參數(shù)可以用來描述不同的分子的抗氧化能力，斜率越大顯示抗氧化能力越高.所以，參數(shù)k2τ 可以量化AO的抗氧化能力.

圖9 光電化學(xué)檢測AO的動力學(xué)Fig. 9 Assay of antioxidant capacity with photoelectrochemical method

在這種新方法中，光催化活性材料，TiO2納米顆粒結(jié)合適當(dāng)?shù)墓獯呋趸结樂肿?，例如對苯二甲酸的光催化氧化反?yīng)非常適合于測定在水溶液中的小分子的抗氧化性能.相比脈沖輻射技術(shù)或者Fenton反應(yīng)，該方法提供了一種簡單的方法產(chǎn)生·OH.本方法也適合結(jié)合微量滴定板和熒光陣列檢測器對AO進(jìn)行高流通量分析，是目前AO分析中較有推廣價值的一種檢測技術(shù).

6 結(jié) 論

AO的檢測方法基于氧化還原反應(yīng)機(jī)理.傳統(tǒng)的檢測方法中使用化學(xué)氧化劑，同時作為體系氧化還原反應(yīng)進(jìn)行程度的指示劑，其中存在的問題是不同的氧化劑反應(yīng)動力學(xué)不同，所以對于同一種AO，不同的氧化劑會給出不同的氧化還原動力學(xué)數(shù)據(jù).我們研究的這些AO檢測方法中采用的氧化劑一般都是·OH和H2O2，每種方法得到的抗氧化能力的變化順序具有可比性.而且，·OH 和H2O2也是人體內(nèi)源性ROS，有的方法中競爭分子采用DNA和鳥嘌呤分子，所以這樣的檢測方法設(shè)計得到的AO抗氧化活性也更好地模擬了人體實際情況.對于不同的檢測方法相比較而言，光電化學(xué)檢測方法有望成為一種推廣使用的AO檢測新技術(shù).

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責(zé)任編輯：郎婧

Research Progress in Electrochemical Detection Technology of Biological Antioxidant

LIU Jifeng，ZHANG Qiang，TU Qingxia，HAN Ailing
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Bio-oxidation process and the role of antioxidants（AO）in life sciences are widely recognized as a central issue of modern biology.During the oxidative metabolic process，free radicals and other reactive oxygen species（ROS）are generated and may cause oxidative damages. When excess free radicals or ROS overwhelm AO，destructive and lethal cellular effects occur.Therefore，it is of fundamental importance to understand the role of AO and control the oxidative stress.Different methods have been proposed to study the antioxidant properties of molecules acting through the radical reaction pathway，whereby the AO and the substrate compete for thermally generated peroxyl radicals.These methods using absorbance or fluorescent indicators yield different parameters for evaluating the antioxidant properties.Recently，we have developed the OH radical（·OH）quenching，H2O2quenching，and H2O2plus ·OH quenching electrochemcial methods for AO tests，and a different kinetic model was developed to compare the antioxidant activities，which is reviewed in this paper.Using these electrochemical AO detection techniques，ROS generated in situ at the electrode surface can be analyzed，and the redox would be similar to the oxidative metabolic process in vivo.

biological antioxidants；reactive oxygen species；electrochemical detection；photoelectrochemical detection

O657.1

A

1672-6510（2016）05-0001-07

10.13364/j.issn.1672-6510.20160061

2016-03-01；

2016-05-31

國家自然科學(xué)基金科學(xué)儀器專項資助項目（21127006）

劉繼鋒（1971—），男，山東泰安人，教授，jfliu@tust.edu.cn.