液相色譜熒光檢測(cè)水產(chǎn)品中隱色孔雀石綠殘留的方法

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（北京市朝陽(yáng)區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京　100018）

液相色譜熒光檢測(cè)水產(chǎn)品中隱色孔雀石綠殘留的方法

郭 睿曹院章唐艷榮王艷紅王丹怡詹穎潔

（北京市朝陽(yáng)區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京100018）

本文概述了隱色孔雀石綠殘留檢測(cè)的液相色譜熒光檢測(cè)方法，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題的查找步驟與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)一步解析了該實(shí)驗(yàn)操作，為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的實(shí)施與改進(jìn)提供參考。

隱色孔雀石綠查找步驟實(shí)驗(yàn)設(shè)想

孔雀石綠（Basic Green 4）作為抗真菌劑，是抗外生性寄生蟲(chóng)藥和消毒劑，被廣泛使用于魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)中。但是，研究顯示，孔雀石綠具有三致作用，進(jìn)入人類(lèi)或動(dòng)物機(jī)體后，可以通過(guò)生物轉(zhuǎn)化，還原代謝成脂溶性的隱色孔雀石綠，具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變作用，嚴(yán)重威脅人類(lèi)身體健康，因此，孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中禁用。

1　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)室于2012年成功增項(xiàng)《GB/T20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》，自此該項(xiàng)目成為實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，“兩會(huì)”水產(chǎn)品特供保障項(xiàng)目。

自從2016年3月開(kāi)始，該項(xiàng)目的檢測(cè)譜圖出現(xiàn)了明顯的異常，每批次檢測(cè)樣品的質(zhì)控樣品回收率無(wú)法達(dá)標(biāo)，而且譜圖雜亂，噪音很高，檢測(cè)結(jié)果無(wú)法保證準(zhǔn)確度。該項(xiàng)目只能暫時(shí)拿下，查找原因，驗(yàn)證后，才能重新投入檢測(cè)。

2　出現(xiàn)問(wèn)題的原因分析

2.1 檢測(cè)儀器

直接配制對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室平時(shí)驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)溶液均使用10μg/kg濃度的隱色孔雀石綠。在現(xiàn)有儀器waters e2695+2475和waters 2695+2475上進(jìn)行儀器比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩臺(tái)儀器響應(yīng)值均出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。于是按照儀器清洗程序進(jìn)行維護(hù)，分別用稀硝酸和異丙醇沖洗管路過(guò)夜，經(jīng)過(guò)10μg/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液比對(duì)，waters e2695+2475性能恢復(fù)，色譜峰響應(yīng)值可以達(dá)到初始狀態(tài)。waters 2695+2475系統(tǒng)老化，無(wú)法達(dá)到信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度，提交申請(qǐng)向儀器廠家報(bào)修，儀器更改相應(yīng)狀態(tài)標(biāo)識(shí)。詳見(jiàn)圖1。

圖1　e2695+2475標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖中可以看出，性能恢復(fù)的waters e2695+2475檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，r2=0.999582，最低檢出限為0.5μg/kg，可以確定檢測(cè)儀器沒(méi)有問(wèn)題。

2.2檢測(cè)試劑

重新領(lǐng)用未開(kāi)封的實(shí)驗(yàn)涉及的試劑，仔細(xì)核對(duì)，重新配制相關(guān)溶液，注意每一個(gè)環(huán)節(jié)，嚴(yán)格操作。使用新配制的試劑重新進(jìn)行質(zhì)控實(shí)驗(yàn)，采集數(shù)據(jù)，計(jì)算空白樣品添加回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍舊異常。詳見(jiàn)圖2。

圖2 自動(dòng)標(biāo)尺色譜圖

此次試驗(yàn)操作規(guī)范，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未發(fā)生異常，可以確定檢測(cè)試劑和實(shí)驗(yàn)方法沒(méi)有問(wèn)題。

2.3樣品提取步驟

使用重新配制的溶液，注意每一個(gè)環(huán)節(jié)，規(guī)范操作，重新進(jìn)行質(zhì)控實(shí)驗(yàn)，提取的樣液濃縮后不經(jīng)過(guò)凈化，直接溶解上機(jī)檢測(cè)，采集數(shù)據(jù)，計(jì)算空白樣品添加回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取液中有隱色孔雀石綠殘留檢出，回收量在合格范圍內(nèi)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 自動(dòng)標(biāo)尺色譜圖

此次試驗(yàn)使用的相關(guān)設(shè)備和玻璃器具均不會(huì)出現(xiàn)異常，可以確定樣品提取過(guò)程沒(méi)有問(wèn)題。

2.4樣品凈化步驟

使用固相萃取裝置，直接用10g/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液（基質(zhì)為乙腈）分別過(guò)酸性氧化鋁柱和PRS柱，分別接取過(guò)柱液、淋洗液、洗脫液，直接上機(jī)檢測(cè)，采集數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隱色孔雀石綠在酸性氧化鋁過(guò)柱液中幾乎全部流出無(wú)保留，在過(guò)PRS柱后無(wú)法檢測(cè)出隱色孔雀石綠。詳見(jiàn)圖4。

過(guò)酸性氧化鋁柱的過(guò)柱液

圖4 自動(dòng)標(biāo)尺色譜圖

過(guò)PRS柱的洗脫液

圖5 自動(dòng)標(biāo)尺色譜圖

此次試驗(yàn)可以肯定是凈化步驟出現(xiàn)問(wèn)題。

（1）直接使用10g/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液（基質(zhì)為乙腈）過(guò)PRS柱后無(wú)法在過(guò)柱液、淋洗液、洗脫液中檢測(cè)出，首先懷疑是PRS柱異常?，F(xiàn)在使用的PRS柱是Agilent公司的，于是從其他實(shí)驗(yàn)室借來(lái)了VARIAN的PRS柱，使用固相萃取裝置，直接用10g/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液（基質(zhì)為乙腈）分別過(guò)酸性氧化鋁柱和PRS柱，分別接取過(guò)柱液、淋洗液、洗脫液，直接上機(jī)檢測(cè)，采集數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隱色孔雀石綠在Agilent PRS柱和VARIAN PRS柱的洗脫液中均無(wú)法檢測(cè)出隱色孔雀石綠。詳見(jiàn)圖6。

過(guò)Agilent PRS柱的洗脫液

圖6　自動(dòng)標(biāo)尺色譜圖

過(guò)VARIAN PRS柱的洗脫液。

此次試驗(yàn)可以排除PRS柱的廠家差異，問(wèn)題查找進(jìn)入了瓶頸期。

（2）為了確定隱色孔雀石綠殘留的去向，于是設(shè)計(jì)直接采用液相方法的PRS柱后過(guò)柱液、淋洗液、洗脫液上液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器，確定是否含有隱色孔雀石綠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隱色孔雀石綠就殘留在洗脫液中。詳見(jiàn)圖8。

圖8　自動(dòng)標(biāo)尺色譜圖

此次試驗(yàn)可以確定是凈化步驟的洗脫出現(xiàn)問(wèn)題。

（3）洗脫過(guò)程排除了試劑問(wèn)題、固相萃取柱問(wèn)題、實(shí)驗(yàn)方法問(wèn)題，還會(huì)涉及的只有固相萃取裝置，于是直接使用10g/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液（基質(zhì)為乙腈）自然過(guò)PRS柱，過(guò)柱過(guò)程中只會(huì)采用吸耳球手工吹打，收集柱后過(guò)柱液、淋洗液、洗脫液，上機(jī)檢測(cè)，采集數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫液中隱色孔雀石綠幾乎全部洗脫無(wú)保留，色譜峰峰型良好。詳見(jiàn)圖9。

圖9　自動(dòng)標(biāo)尺色譜圖

此次試驗(yàn)可以確定是固相萃取裝置管路年久老化，在洗脫過(guò)程中溶解了雜質(zhì)，造成色譜圖基線響應(yīng)值過(guò)高，掩蓋了目標(biāo)峰的信號(hào)。

3　結(jié)語(yǔ)

通過(guò)此次實(shí)驗(yàn)事故問(wèn)題的查找步驟，更加系統(tǒng)地學(xué)習(xí)了《GB/T20361-2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定 高效液相色譜熒光檢測(cè)法》，增長(zhǎng)了經(jīng)驗(yàn)，也深切體會(huì)了日常儀器設(shè)備的維護(hù)和自檢的重要性。希望通過(guò)我實(shí)驗(yàn)室的這次常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目問(wèn)題查找步驟，可以給同行們的工作一些參考建議。實(shí)驗(yàn)室技能的日益提高，不排除會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問(wèn)題，檢測(cè)工作的嚴(yán)謹(jǐn)性要求我們面對(duì)任何異常不得不求甚解，問(wèn)題的出現(xiàn)是我們提高技術(shù)的契機(jī)。

圖7　自動(dòng)標(biāo)尺色譜圖

郭睿（1981-），職稱(chēng):中級(jí)獸醫(yī)師，研究方向:實(shí)驗(yàn)室管理及檢測(cè)。

曹院章（1966-），職稱(chēng):中級(jí)獸醫(yī)師，研究方向:檢疫及獸藥殘留檢測(cè)。