p53可調(diào)控表達(dá)的B細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型的建立

黃　亞, 王繼軍, 顧　欣, 龐　磊, 成　語(yǔ), 張艷青, 郁多男, 2

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院RNA研究中心; 2. 揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究院, 江蘇 揚(yáng)州，225001)

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p53可調(diào)控表達(dá)的B細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型的建立

黃亞1, 王繼軍1, 顧欣1, 龐磊1, 成語(yǔ)1, 張艷青1, 郁多男1, 2

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院RNA研究中心; 2. 揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究院, 江蘇 揚(yáng)州，225001)

目的探討p53可調(diào)控表達(dá)的B細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型的建立。方法利用MYC過(guò)表達(dá)同時(shí)p53失活原理建立了B細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型，利用敲入的可編碼p53和雌激素受體(ER)融合蛋白p53 ERTAM的等位基因，可實(shí)現(xiàn)對(duì)p53的“失活”與“活化”兩種狀態(tài)的調(diào)控。結(jié)果過(guò)表達(dá)c-Myc及p53功能缺失足以使正常骨髓細(xì)胞惡變成為腫瘤細(xì)胞。RT-PCR證實(shí)腫瘤細(xì)胞呈Rag1陽(yáng)性和TdT陰性，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞確實(shí)來(lái)源于B細(xì)胞的早期發(fā)育階段。結(jié)論p53可調(diào)控小鼠B細(xì)胞淋巴瘤模型不僅具備B細(xì)胞淋巴瘤特征，而且可實(shí)現(xiàn)p53活性的可控。

p53; c-Myc; B細(xì)胞淋巴瘤; 小鼠模型

B細(xì)胞淋巴瘤是人淋巴系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，它們大多源自位于生發(fā)中心的B細(xì)胞，或源自經(jīng)過(guò)生發(fā)中心反應(yīng)的B細(xì)胞[1]。在中國(guó)B細(xì)胞淋巴瘤約占全部惡性腫瘤的3%左右，死亡率在惡性腫瘤中排第11～13位[2]。許多人類B細(xì)胞淋巴瘤是多克隆性的，這提示在腫瘤形成中有1～2個(gè)基因變異事件就可以引起腫瘤發(fā)生[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)Myc基因是一個(gè)定位于染色體8q24上的與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因，常參與生發(fā)中心B細(xì)胞發(fā)生的人類淋巴瘤的染色體易位。這種易位在約10%的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和幾乎所有散發(fā)性Burkitt淋巴瘤中出現(xiàn)。

Myc易位可使其受免疫球蛋白μ重鏈基因增強(qiáng)子(Eμ)的調(diào)控。Eμ-myc的轉(zhuǎn)基因小鼠形成淋巴瘤有著人類母細(xì)胞淋巴瘤的病理特點(diǎn)，但其成瘤時(shí)間長(zhǎng)約1年[5], 因此用其作為研究人類B細(xì)胞淋巴瘤存在一定困難。另外，在面臨多種可能致癌因素比如DNA受損、缺氧、營(yíng)養(yǎng)脅迫及促癌基因過(guò)表達(dá)時(shí)可以激發(fā)p53的活性[6]。在腫瘤形成過(guò)程中, p53活化信號(hào)是持續(xù)存在的，重啟p53的腫瘤抑制通路也是目前腫瘤細(xì)胞特異性治療策略之一[7]。本文利用MYC過(guò)表達(dá)同時(shí)p53失活原理建立了B細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型，利用敲入的可編碼p53和雌激素受體(ER)融合蛋白p53ERTAM的等位基因，可實(shí)現(xiàn)對(duì)p53的“失活”與“活化”兩種狀態(tài)的調(diào)控[8]。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞與動(dòng)物

1.1.1細(xì)胞培養(yǎng): GP+E86包裝細(xì)胞受贈(zèng)于美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)Andrei Thomas-Tikhonenko實(shí)驗(yàn)室, DMEM, 10%胎牛血清, 10%雙抗, 37℃, 5%CO2培養(yǎng)。

1.1.2質(zhì)粒構(gòu)建：以LXSN為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)腫瘤基因c-Myc的LMycSN逆轉(zhuǎn)錄病毒。細(xì)胞轉(zhuǎn)染: Lip 2000脂質(zhì)體40 μL, gagpol 2 μg, vsvg 2 μg, LMycSN 10 μg, 混勻后室溫靜置20 min, 加入GP+E86細(xì)胞中，過(guò)夜后換液, 48 h后行neomycin (G418)篩選，細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.1.3荷瘤: p53ERTAM小鼠受贈(zèng)于美國(guó)加利福尼亞大學(xué)舊金山分校Gerard Evan實(shí)驗(yàn)室，并與揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心C57BL/6小鼠回交并做基因鑒定確認(rèn)。方法：選用回交后的第8代小鼠，取小鼠股骨骨髓，用1 mL注射器吸取PBS沖洗出骨髓組織，并與已消化的轉(zhuǎn)染LMycSN的GP+E86細(xì)胞混勻后，同時(shí)以空白載體LXSN及p53ERTAM小鼠骨髓組織為對(duì)照，選擇6～8周C57BL/6小鼠作為宿主，5只一組，共3組，分別進(jìn)行皮下荷瘤，觀察成瘤效果。

1.2藥物

腫瘤生長(zhǎng)至約1.5 cm時(shí)，他莫昔芬(Sigma, T5648)超聲溶解于玉米油(sigma, C8267)中, 1 mg/只，腹腔注射，1次/2 d。

1.3腫瘤組織Hematoxylin和Eosin (H&E)染色

切除腫瘤后，4%多聚甲醛固定，梯度脫水后石蠟包埋，切成4 μm/片，H&E染色。

1.4流式分析

細(xì)胞流式分析：分離腫瘤后，用70 μm尼龍網(wǎng)研磨，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞用標(biāo)記抗體。CD45R(B220)、CD19、CD4、CD8、CD11b、F4/80、CD11c、NK1.1、IgM、IgD抗體及凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自BD公司，采用FACScalibur流式細(xì)胞儀分析腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記及注射藥物后腫瘤細(xì)胞早期凋亡變化。

1.5RT-PCR

研磨腫瘤組織并將研磨后的腫瘤細(xì)胞裂解于Trizol中，苯酚抽提，乙醇沉淀，提取出總RNA。純化并反轉(zhuǎn)錄成cDNA, PCR擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物上樣于1.5%瓊脂糖電泳。引物序列如下: gag-myc: TTGTACACCCTAAGCCTCCG(F,gag)、TGCTGCTGGTAGAAGTTCTC(R,myc); Rag-1: TGCAGACATTCTAG-CACTCTGG(F)、ACATCTGCCTTCACGTCGAT(R); TdT: GAAGATGGGAACAACTCGAAGAG(F)、CAGGTGCTGGAACATTCTGGGAG(R)。

2　結(jié)　果

將p53ERTAM小鼠骨髓細(xì)胞和可以分泌c-Myc逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒包裝細(xì)胞GP+E86混合后經(jīng)小鼠皮下注射，4周左右腫瘤可以生長(zhǎng)成直徑約1.5 cm。但是, p53ERTAM小鼠骨髓細(xì)胞本身或者只轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體LXSN, 即沒有過(guò)表達(dá)c-Myc的p53ERTAM小鼠骨髓細(xì)胞無(wú)法在相同時(shí)間內(nèi)成瘤，在2個(gè)月之后也沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤。荷瘤結(jié)果為L(zhǎng)MycSN成瘤時(shí)間28 d時(shí)為5/5, LXSN處死時(shí)間60 d時(shí)為0/5, p53ERTAM處死時(shí)間60 d時(shí)為0/5。這一結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)c-Myc及p53功能缺失足以使正常骨髓細(xì)胞惡變成為腫瘤細(xì)胞。

組織學(xué)檢測(cè)顯示腫瘤組織由大量淋巴樣細(xì)胞組成，細(xì)胞明顯大于正常淋巴細(xì)胞，核分裂象明顯增多，提示可能是淋巴瘤(圖1A)。RT-PCR證實(shí)Myc逆轉(zhuǎn)錄病毒確實(shí)已經(jīng)整合到腫瘤細(xì)胞的基因組DNA中(圖1B)。流式細(xì)胞檢測(cè)腫瘤細(xì)胞呈B220和CD19強(qiáng)陽(yáng)性及CD43弱陽(yáng)性，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞來(lái)源于B淋巴細(xì)胞。但I(xiàn)gM陰性說(shuō)明這些腫瘤細(xì)胞來(lái)源于早期B淋巴細(xì)胞(圖1C)。CD4、CD8陰性說(shuō)明腫瘤細(xì)胞不是來(lái)源于T淋巴細(xì)胞, F4/80、CD11b陰性說(shuō)明腫瘤細(xì)胞非來(lái)源于單核細(xì)胞, CD11c陰性說(shuō)明腫瘤細(xì)胞非來(lái)源于樹突狀細(xì)胞, NK1.1陰性說(shuō)明腫瘤細(xì)胞非來(lái)源于NK細(xì)胞 (圖1C)。為了進(jìn)一步證實(shí)腫瘤細(xì)胞確實(shí)來(lái)源于早期發(fā)育階段的B淋巴細(xì)胞，作者利用RT-PCR證實(shí)腫瘤細(xì)胞呈Rag1陽(yáng)性和TdT陰性，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞確實(shí)來(lái)源于B細(xì)胞的早期發(fā)育階段[9](圖1D、E)。

A: 腫瘤組織切片H&E染色(400倍); B: 腫瘤組織的gag-myc RT-PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳圖，1、2、3、4分別是不同小鼠的腫瘤組織，小鼠脾臟細(xì)胞為陰性對(duì)照, LMycSN質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照; C: 腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記流式分析結(jié)果; D、E: 腫瘤組織的Rag1及TdT RT-PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳圖，1、2、3、4分別是不同腫瘤組織，人胃癌細(xì)胞株BGC823位陰性對(duì)照，小鼠胸腺細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。

圖1小鼠腫瘤的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)荷瘤小鼠腹腔注射他莫昔芬后腫瘤逐漸變小，4～6 d后在原荷瘤處已無(wú)肉眼可見腫瘤(圖2A右側(cè))。事實(shí)上，注射他莫昔芬0.5和1 h后流式檢測(cè)顯示腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡率隨著時(shí)間變化明顯增加 (6.80%、25.5%)(圖2B)。由于敲入的雌激素受體(ER)有突變，因此不受小鼠體內(nèi)雌激素干擾。這充分提示他莫昔芬可以活化腫瘤細(xì)胞內(nèi)p53, 實(shí)現(xiàn)p53的“開”與“關(guān)”兩種狀態(tài)的調(diào)控。

A: 小鼠腫瘤注射他莫昔芬前后比較，左圖為未注射他莫昔芬時(shí)背部腫瘤，右圖箭頭所指為原腫瘤所在處;B: 注射他莫昔芬后0、0.5及1 h流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞早期凋亡情況。

圖2小鼠腫瘤形成后注射他莫昔芬后腫瘤消失

3　討　論

目前，建立B細(xì)胞淋巴瘤的動(dòng)物模型的方法大致可分為自發(fā)型淋巴瘤模型、誘發(fā)型淋巴瘤模型、移植型淋巴瘤模型和基因工程型淋巴瘤模型[10]。作者研究發(fā)現(xiàn)將能產(chǎn)生編碼myc的逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞與p53ERTAM骨髓細(xì)胞混合后皮下可以成瘤，而不是采用病毒上清感染，該方法感染率更高，方法更簡(jiǎn)便[11]。由于回交8代后p53ERTAM骨髓細(xì)胞與荷瘤宿主小鼠已基本同源，而包裝細(xì)胞與荷瘤小鼠非同源，這樣可避免包裝細(xì)胞干擾成瘤結(jié)果。

p53作為抑癌基因在遏制腫瘤起始和進(jìn)展中有著重要作用，它的功能有: ① 阻滯細(xì)胞周期。p53的調(diào)節(jié)功能主要體現(xiàn)在G1和G2/M期的周期阻滯。② 促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡。③ 維持基因組穩(wěn)定[12]。人類多種腫瘤中存在p53失活的現(xiàn)象[13]。大量研究[14-17]揭示了p53的下游靶基因，如p21、14-3-3-δ、Gadd45、Bax、PTEN等。近年來(lái)研究[18-20]發(fā)現(xiàn)p53可通過(guò)調(diào)控微小RNA抑制腫瘤形成及調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性。B細(xì)胞淋巴瘤的相關(guān)研究進(jìn)展不斷，但對(duì)淋巴瘤的發(fā)病原因、機(jī)制未完全明了，臨床治療效果不佳，預(yù)后差。作者發(fā)現(xiàn)p53可調(diào)控小鼠B細(xì)胞淋巴瘤模型不僅具備B細(xì)胞淋巴瘤特征，而且可實(shí)現(xiàn)p53活性的可控，提高臨床治療效果，為研究人類B細(xì)胞淋巴瘤及P53調(diào)控的靶基因以及淋巴瘤干細(xì)胞等提供了非常有用的動(dòng)物模型。

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Establishment of a B lymphoma rat model with regulatable expression of p53

HUANG Ya1, WANG Jijun1, GU Xin1, PANG Lei1, CHENG Yu1,ZHANG Yanqing1, YU Duonan1, 2

(1.RNAResearchCenterofCollegeofMedicineofYangzhouUniversity;2.InstituteofComparativeMedicineofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu, 225001)

ObjectiveTo explore the establishment method of a B lymphoma rat model with regulatable expression of p53. MethodsThe B lymphoma rat model with regulatable expression of p53 was established by MYC over expression and p53 inactivation principles, and the “deactivation” and “activation”of p53 were regulated by the encoding p53 and allelic gene of estrogen receptor (ER) fusion protein p53ERTAM. ResultsOver-expressed c-Myc and the functional deficiency of p53 was able to make normal bone marrow cells become malignant tumor cells. RT-PCR confirmed that the tumor cells were positive for Rag1 and negative for TdT, which proved that the tumor cells did originate from the early stage of B cells. ConclusionThe B lymphoma rat model with regulatable expression of p53 not only has the characteristics of B cell lymphoma, but also can realize the control of p53 activity.

p53; c-Myc; B cell lymphoma; rat model

2016-06-10

國(guó)家自然科學(xué)基金(NO.81470277); 江蘇省高等教育優(yōu)先發(fā)展項(xiàng)目; 中央財(cái)政(生物醫(yī)學(xué))創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

郁多男

R 733

A

1672-2353(2016)19-001-04DOI: 10.7619/jcmp.201619001