敵草快和硫辛酸對育肥豬腸道結(jié)構(gòu)及消化功能的影響

鮑偉光　郝　月　崔艷軍　李潔蕾　張校軍　李　淦　王占彬　顧憲紅*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.河南科技大學動物科技學院，洛陽471003)

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敵草快和硫辛酸對育肥豬腸道結(jié)構(gòu)及消化功能的影響

鮑偉光1郝月1崔艷軍1李潔蕾1張校軍1李淦1王占彬2顧憲紅1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.河南科技大學動物科技學院，洛陽471003)

本文旨在研究敵草快和硫辛酸(LA)對育肥豬腸道結(jié)構(gòu)及消化功能的影響，以探究LA對敵草快引起的應激是否有緩解作用。選取24頭(70.64±3.61) kg的健康大白閹公豬，按照2×2因子設(shè)計，隨機分為對照組、LA組、敵草快組和LA+敵草快組，每個組設(shè)6個重復，每個重復1頭豬。試驗期29 d。LA添加劑量為800 mg/kg飼糧，飼喂貫穿試驗全程，而一次性腹腔滴注敵草快于試驗第15天進行，無腹腔滴注敵草快試驗豬滴注等量的生理鹽水。于試驗第29天對所有試驗豬前腔靜脈采血后屠宰取樣，運用試劑盒檢測血漿和腸道氧化損傷標志物的含量以及空腸食糜消化酶的活性，蘇木精-伊紅(HE)染色后運用圖像分析軟件觀察腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)并測定絨毛高度、隱窩深度，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)，熒光定量PCR法檢測閉合蛋白(occludin)和緊密結(jié)合蛋白(ZO-1)的相對表達量。結(jié)果表明：1)敵草快極顯著升高了試驗豬血漿和腸道丙二醛(MDA)、蛋白質(zhì)羰基(PCO)和8-羥基鳥苷(8-OHdG)的含量(P<0.01)，極顯著降低了十二指腸、空腸及回腸絨毛高度、隱窩深度(P<0.01)，極顯著增大了十二指腸和空腸V/C(P<0.01)，顯著增大了回腸V/C(P<0.05)，極顯著降低了空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達量(P<0.01)，極顯著降低了空腸食糜中淀粉酶、胰蛋白酶以及脂肪酶的活性(P<0.01)。2)飼糧中添加LA對試驗豬血漿和腸道MDA、PCO和8-OHdG含量的影響均不顯著(P>0.05)，對十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度、隱窩深度以及V/C的影響均不顯著(P>0.05)，對空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達量的影響也不顯著(P>0.05)，對空腸食糜中淀粉酶、胰蛋白酶以及脂肪酶活性的影響差異也均不顯著(P>0.05)。3)在應激狀態(tài)下，飼糧中添加LA使豬血漿8-OHdG含量顯著降低(P<0.05)，十二指腸絨毛高度、空腸絨毛高度以及回腸隱窩深度顯著升高(P<0.05)，空腸V/C顯著降低(P<0.05)，回腸V/C極顯著降低(P<0.01)，空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，空腸食糜淀粉酶和胰蛋白酶的活性顯著提升(P<0.05)。由此可見，敵草快引起了育肥豬強烈的氧化應激，導致了腸道結(jié)構(gòu)的嚴重損傷并減弱了腸道的消化功能；在敵草快引起的應激狀態(tài)下，飼糧中添加800 mg/kg LA能夠減緩腸道結(jié)構(gòu)的損傷并能一定程度地提高腸道的消化功能。

敵草快；硫辛酸；育肥豬；氧化應激；腸道

生物體內(nèi)的能量代謝將氧氣作為有氧代謝過程中的電子接受體，不可避免地產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)，過量的ROS產(chǎn)生及引發(fā)的脂質(zhì)過氧化損傷及炎癥反應可通過多種途徑導致氧化應激狀態(tài)和疾病[1-2]。在氧化應激條件下，腸黏膜的特殊結(jié)構(gòu)及氧的對流交換機制決定了它更容易造成氧化損傷，經(jīng)常出現(xiàn)腸道蠕動異常、黏膜滲透性增高、電解質(zhì)分泌、腸上皮形態(tài)及細胞的結(jié)構(gòu)和消化功能異常等癥狀[3]。因此，研究氧化應激對腸道的損傷及消化功能的影響變得尤為重要。敵草快(diquat)為氧化還原型雙吡啶除草劑，屬中等毒性化合物，敵草快進入動物體內(nèi)后，利用分子氧產(chǎn)生氧自由基和其他ROS，導致氧化應激。硫辛酸(lipoic acid,LA)作為一種高效的抗氧化劑可以減少ROS的產(chǎn)生，減弱DNA的氧化損傷，抑制脂質(zhì)過氧化，并能很大程度地改善體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，對氧化應激引起的疾病有顯著的緩解作用[4-5]。Guven等[6]報道，LA可以通過清除ROS和RNS對大鼠小腸缺血性再灌注損傷進行修復。Powell等[7]報道，小腸細胞系DLD-1高糖損傷組的谷胱甘肽(GSH)含量與對照組相比顯著降低，添加LA后細胞中GSH含量恢復正常；同時發(fā)現(xiàn)高糖損傷組誘導型一氧化氮合酶(iNOS)啟動子基因表達上調(diào)，而LA損傷修復組顯著降低了iNOS啟動子表達上調(diào)量，在轉(zhuǎn)錄水平證明了LA對小腸細胞氧化損傷的修復作用。Cui等[8]進一步從腸道免疫細胞受體基因表達量驗證LA的抗氧化作用，高脂飼糧能引起慢性氧化損傷，抑制腸道相關(guān)淋巴細胞的信號轉(zhuǎn)導，導致了對黏膜免疫力的抑制，而LA能夠通過從轉(zhuǎn)錄水平修復相關(guān)基因、腸道氧化損傷和免疫抑制反應。近年的研究顯示，LA有非常強的抗氧化效果，而且現(xiàn)有研究未發(fā)現(xiàn)任何副作用。然而，LA的研究多選用小型動物建立氧化應激模型，且有關(guān)LA緩解氧化應激的研究大多都限制在細胞水平，對建立大中型動物模型研究LA調(diào)控腸道氧化應激的試驗相對較少。本課題組以育肥豬為研究對象，選用敵草快誘導試驗豬產(chǎn)生氧化應激，探討氧化應激對試驗豬腸道氧化損傷標志物、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、上皮細胞緊密結(jié)合性以及消化酶活性的影響，選擇LA為營養(yǎng)素，探究飼糧中添加LA對氧化應激育肥豬腸道損傷及消化功能的調(diào)控作用，為進一步揭示其緩解大中型動物氧化應激的作用機制提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗設(shè)計

試驗采用2×2因子設(shè)計，腹腔是否滴注敵草快(0、8 mg/kg體重)和飼糧中是否添加LA(0、800 mg/kg飼糧)為2個主效應，共形成4個組(對照組、LA組、敵草快組和LA+敵草快組)。敵草快購自美國Sigma公司；LA購自美國Amresco公司，純度≥99%。

選取24頭體重(70.64±3.61) kg的健康大白閹公豬，根據(jù)體重相近的原則隨機分為4個組，每個組6個重復，每個重復1頭豬。試驗期為29 d。其中LA從試驗第1天就開始添加，直到全程；腹腔滴注敵草快于試驗第15天進行，每頭試驗豬一次性滴注量為8 mg/kg體重，以250 mL生理鹽水稀釋后采用輸液器滴注，其他試驗豬滴注等量的生理鹽水，滴注耗時約5 min。

1.2試驗飼糧與飼養(yǎng)管理

試驗飼糧為粉料，基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，參考NRC(2012)及中國《豬飼養(yǎng)標準》(NY/T 65—2004 )相應階段營養(yǎng)需要配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。為保證飼糧質(zhì)量，根據(jù)試驗豬日采食量估算每周采食總量，并根據(jù)配方每周配料1次，配料時按照試驗設(shè)計向基礎(chǔ)飼糧中分別添加0、800 mg/kg LA構(gòu)成2種試驗飼糧。

試驗在中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所試驗基地豬場進行。試驗前，圈舍進行徹底清洗打掃，以2%～3%濃度的燒堿和百毒殺先后進行2次消毒，再熏蒸消毒(髙猛酸鉀∶甲醛=1∶2，室內(nèi)密閉)24 h，通風干燥5 d，轉(zhuǎn)入試驗豬當天再用百毒殺消毒。轉(zhuǎn)入的試驗豬飼養(yǎng)在160 cm×90 cm×120 cm的代謝籠中，單籠飼養(yǎng)，適應約1周后開始正式試驗，試驗期間由專人對試驗豬進行管理和飼喂，所有操作均嚴格按照飼養(yǎng)手冊進行，盡可能減少與試驗無關(guān)的應激因素，環(huán)境溫度控制在15～20 ℃，相對濕度40%～60%。

1.3樣品采集

試驗的第29天前腔靜脈采血，離心后取上清液分裝至1.5 mL離心管，-20 ℃保存。用電擊棒(110 V、5 A)將豬只擊暈、懸掛、頸動脈放血，整個過程在半分鐘內(nèi)完成以確保將試驗豬的痛苦降到最低。待豬只沒有角膜反射后，立即沿腹中線剖開，取出內(nèi)臟。找到空腸中段部位剪取1～2 cm空腸段，用預冷的生理鹽水沖洗掉食糜后，放入離心管中，液氮速凍，-80 ℃保存。取距幽門口5～10 cm處的十二指腸；整個空腸組織中段部位的空腸；距離回盲連接處5～10 cm的回腸；各取1 cm的十二指腸、空腸、回腸腸段用預冷的生理鹽水沖洗掉食糜后，放入10%的福爾馬林溶液中固定。接取空腸食糜，放入離心管中，液氮速凍，-20 ℃保存。

表1　基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1)預混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kg of the diet：VA 2 512 IU，VD31 200 IU，VE 4 IU，VK31.5 mg，VB1217.6 μg，核黃素 riboflavin 2.5 mg，泛酸 pantothenic acid 6.8 mg，煙酸 niacin 20.3 mg，膽堿 choline 351 mg，Mn 10 mg，F(xiàn)e 50 mg，Zn 50 mg，Cu 10 mg，I 0.3 mg，Se 0.3 mg。

2)消化能為計算值，其余營養(yǎng)水平為實測值。DE was a calculated value, while the other nutrient levels were measured values.

1.4檢測指標和測定方法

1.4.1血漿生化指標的測定

用含肝素鈉抗凝劑的采血管采集前腔靜脈血液，靜置10～15 min后，在離心機中以3 000 r/min離心10 min分離血漿，-20 ℃保存。血漿中丙二醛(malondialdehyde,MDA)和蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl,PCO)含量都采用比色法測定，試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測豬血漿8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy deoxyguanosine,8-OHdG)的含量，試劑盒購自R&D公司。

1.4.2空腸組織生化指標的測定

將腸道組織樣品從-80 ℃冰箱取出放入研缽，邊倒入液氮邊研磨，直至磨成粉末，準確稱量粉末重量，并按照1∶9加入生理鹽水制成10%的組織勻漿；在4 ℃的低溫冷凍離心機中以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清后原液備用；將原液用生理鹽水稀釋至1%的組織勻漿，用南京建成生物工程研究所提供的考馬斯亮藍試劑盒測定1%組織勻漿中的蛋白質(zhì)濃度，再用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測定組織中MDA和PCO的含量。使用ELISA方法檢測豬腸段8-OHdG的含量，試劑盒購自R&D公司。

1.4.3空腸食糜消化酶活性的測定

將采集的空腸食糜在4 ℃冰箱中解凍后，用4 ℃的低溫冷凍離心機以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液稀釋相應的倍數(shù)用于測定。食糜中的淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶活性測定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。

1.4.4腸道組織切片

從固定液中取出腸道組織，經(jīng)一系列由低到高濃度的乙醇脫水，二甲苯透明后，55 ℃于銅質(zhì)模具進行石蠟包埋，用切片機切成5 μm厚度的切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。每個樣品做3張不連續(xù)性切片進行觀察，每個樣品各選取6個完整、典型的絨毛視野，采用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)采集圖像并測定絨毛高度(絨毛頂端至隱窩開口處的垂直距離)、隱窩深度(隱窩開口至隱窩基底部的垂直距離)，并計算絨毛高度/隱窩深度(V/C)的值。

1.4.5空腸閉合蛋白(occludin)和緊密結(jié)合蛋白(zonula occludens protein-1,ZO-1)轉(zhuǎn)錄水平的相對表達量

將空腸組織樣品從-80 ℃冰箱取出放入研缽，邊倒入液氮邊研磨，直至磨成粉末，取少量粉末于1.5 mL離心管中，使用ThermoSCRIPTTM熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒，參照其說明書進行總RNA提取和mRNA反轉(zhuǎn)錄，然后使用熒光實時定量檢測方法對occludin和ZO-1的相對表達量進行定時定量分析。雙鏈DNA染色使用嵌合熒光染色法染色。根據(jù)豬3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease gene,GAPDH)、occludin和ZO-1的基因序列，用Primer 5.0設(shè)計引物，并用NCBI中Blast初步檢測引物的特異性。引物序列如表2所示。

表2　目的基因引物序列

1.5數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.2軟件對數(shù)據(jù)進行雙因素有互作的方差分析，并在氧化應激的情況下對是否添加LA的2組進行t檢驗，所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差表示，以P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2　結(jié)　果

2.1敵草快和LA對育肥豬腸道氧化損傷及屏障功能的影響

2.1.1敵草快和LA對育肥豬血漿和腸道氧化損傷產(chǎn)物的影響

由表3可知，腹腔滴注敵草快均使育肥豬血漿和腸道MDA、PCO和8-OHdG含量極顯著升高(P<0.01)；飼糧中添加LA對育肥豬血漿和腸道MDA、PCO和8-OHdG含量均無顯著影響(P>0.05)；腹腔滴注敵草快和飼糧中添加LA對育肥豬血漿PCO含量有顯著的交互作用(P<0.05)，對血漿8-OHdG含量的交互作用接近顯著(P=0.09)，對血漿和腸道MDA、腸道PCO以及腸道8-OHdG含量的交互作用均不顯著(P>0.05)。對應地，在非應激的情況下飼糧中添加LA對育肥豬血漿8-OHdG的含量并無顯著影響(P>0.05)，然而在氧化應激的情況下，飼糧中添加LA使育肥豬血漿8-OHdG的含量顯著降低(P<0.05)。

2.1.2敵草快和LA對育肥豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

從圖1可以看出,對照組和LA組試驗豬腸結(jié)構(gòu)完整，無明顯的損傷出現(xiàn)；滴注敵草快的所有試驗豬腸絨毛出現(xiàn)斷裂、腫脹的現(xiàn)象，腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)受損；然而，腹腔滴注敵草快相比沒有腹腔滴注敵草快的試驗豬，飼糧中添加LA一定程度地減弱了試驗豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)受損的程度。

由表4可知，腹腔滴注敵草快均使育肥豬十二指腸、空腸及回腸絨毛高度、隱窩深度極顯著降低(P<0.01)，十二指腸和空腸V/C極顯著增大(P<0.01)，回腸V/C顯著增大(P<0.05)；飼糧中添加LA對育肥豬腸道絨毛高度、隱窩深度以及V/C均無顯著影響(P>0.05)；腹腔滴注敵草快和飼糧中添加LA對回腸V/C有極顯著的交互作用(P<0.01)，對十二指腸絨毛高度(P=0.07)、空腸絨毛高度(P=0.07)和V/C(P=0.11)以及回腸隱窩深度(P=0.09)交互作用接近顯著，對十二指腸隱窩深度和V/C、空腸隱窩深度以及回腸絨毛高度的交互作用均不顯著(P>0.05)。對應地，腹腔滴注敵草快相比沒有腹腔滴注敵草快的育肥豬，飼糧中添加LA對腸道的影響更為明顯；表現(xiàn)為十二指腸絨毛高度、空腸絨毛高度以及回腸隱窩深度顯著升高(P<0.05)，空腸V/C顯著降低(P<0.05)，回腸V/C極顯著降低(P<0.01)。

表3　敵草快和LA對育肥豬血漿和腸道氧化損傷產(chǎn)物的影響

Diquat：敵草快；LA：硫辛酸；D×LA：敵草快×硫辛酸；+表示添加或滴注，-表示未添加或未滴注。同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Diquat: diquat; LA: lipoic acid; D×LA: diquat ×lipoic acid; + mean added or injection; - mean without added or no injection. In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same small letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.1.3敵草快和LA對育肥豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達量的影響

由圖2可知，腹腔滴注敵草快均使育肥豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)；飼糧中添加LA對育肥豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達量的影響均不顯著(P>0.05)；腹腔滴注敵草快和飼糧中添加LA對空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達量交互作用影響均不顯著(P>0.05)。然而，在非應激的情況下LA對育肥豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達量的影響不顯著(P>0.05)；在氧化應激的情況下，飼糧中添加LA對育肥豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達量均顯著地提升(P<0.05)。

2.2敵草快和LA對育肥豬空腸食糜中消化酶活性的影響

由表5可知，腹腔滴注敵草快均使育肥豬空腸食糜中淀粉酶、胰蛋白酶以及脂肪酶的活性極顯著降低(P<0.01)；飼糧中添加LA對育肥豬空腸食糜中淀粉酶、胰蛋白酶以及脂肪酶活性的影響不顯著(P>0.05)；腹腔滴注敵草快和飼糧中添加LA對空腸食糜中淀粉酶和胰蛋白酶活性的交互作用接近顯著(P=0.09)，對空腸食糜中脂肪酶活性的交互作用不顯著(P>0.05)。對應地，在非應激的情況下LA對育肥豬空腸糜中淀粉酶和胰蛋白酶的影響均不顯著(P>0.05)，然而在氧化應激的情況下，飼糧中添加LA對育肥豬空腸食糜中淀粉酶以及胰蛋白酶的活性均有顯著地提升(P<0.05)。

3　討　論

LA屬于維生素B族物質(zhì)，同時也是一些微生物的內(nèi)源性生長因子。外源性LA具有抗氧化以及抗炎癥作用。敵草快為氧化還原型雙吡啶除草劑，屬中等毒性化合物。敵草快進入動物體內(nèi)后，利用分子氧產(chǎn)生氧自由基和其他ROS[9]，導致氧化應激，作為一種氧化應激誘導劑分別應用于野生型大鼠[10]、斷奶仔豬[11]和生長豬[12]，并成功建立了氧化應激模型。本試驗中腹腔滴注8 mg/kg體重敵草快依據(jù)李麗娟等[11]使用12 mg/kg體重敵草快誘導了斷奶仔豬產(chǎn)生氧化應激，徐靜等[12]按8 mg/kg體重劑量一次性腹腔注射敵草快溶液，可誘導生長豬氧化應激，氧化應激效應可持續(xù)28 d，血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性和MDA含量可作為反映氧化應激的敏感指標。本試驗腹腔滴注8 mg/kg體重敵草快所有試驗豬均出現(xiàn)急躁、空口咀嚼、嘔吐、厭食等現(xiàn)象，持續(xù)1周左右后，采食量逐漸恢復，非應激組滴注等量的生理鹽水未見豬只行為異常，這與前人的研究結(jié)果[11-15]類似，而本研究選擇育肥豬作為試驗動物為建立大中型氧化應激動物模型奠定了基礎(chǔ)。雖然LA作為緩解敵草快導致的氧化應激未見報道，但是有研究表明LA可以用于治療百草枯(paraquat)引起的中毒[16]，而百草枯作為一種有機雜環(huán)類接觸性除草劑與敵草快結(jié)構(gòu)功能相似。

圖1　敵草快和LA對育肥豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

3.1敵草快和LA對育肥豬腸道氧化損傷及屏障功能的影響

腸道極易受氧化的損傷[17]，腹腔滴注的敵草快進入機體首先通過的是腸黏膜，腸黏膜氧化應激所產(chǎn)生的過多的氧自由基如ROS和RNS可以破壞DNA、生物脂質(zhì)大分子、蛋白質(zhì)和其他生物大分子，過多的氧自由基可以通過抗氧化系統(tǒng)消除，包括非酶成分和抗氧化酶系[18-19]。LA的特殊結(jié)構(gòu)決定了它具有清除機體過量的自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、減弱DNA的氧化損傷等功能[20]。因此，飼糧中添加LA能很大程度地改善體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)。

宋小珍等[21]在斷奶仔豬上的研究表明，氧化應激使豬腸道SOD、GSH-Px的活性顯著降低，而MDA的含量顯著上升。Chen等[22]研究表明，氧化應激導致仔豬小腸功能障礙并顯著降低了SOD等抗氧化物酶的活性。王遠孝等[23]的研究結(jié)果顯示，氧化應激降低了空腸黏膜總抗氧化能力、谷胱甘肽還原酶和GSH-Px活性，提高了MDA含量。Kataria等[24]的研究也證明了氧化應激對豬抗氧化物酶有抑制作用。以上試驗表明，氧化應激導致了抗氧化酶活性的降低。本試驗則通過檢測氧化損傷標志物來說明腸道是否遭受了氧化損傷，結(jié)果表明，所有氧化應激的試驗豬血漿和腸道MDA、PCO以及8-OHdG含量均極顯著升高，說明氧化應激造成了試驗豬脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的嚴重損傷。張海超[25]的研究結(jié)果表明，氧化應激造成了腸道的氧化損傷，顯著降低了血漿MDA和空腸PCO的含量。張焱等[26]的研究結(jié)果顯示，過高的氧化應激水平參與胃腸道腫瘤的發(fā)生，造成MDA和8-OHdG含量明顯升高。這些研究結(jié)果與本試驗的結(jié)果類似。LA緩解氧化應激分別于小鼠[27-28]、肉雞[29]、奶牛[30]以及細胞水平[31]有了一定的研究，然而對于育肥豬的研究還尚屬空缺，在本試驗中，同在氧化應激的情況下，攝食LA的試驗豬相比攝食基礎(chǔ)飼糧的試驗豬損傷程度更低，說明LA有緩解氧化應激的能力，而飼糧中添加LA的試驗豬血漿8-OHdG含量降低達到了顯著水平，說明LA有可能對試驗豬DNA有一定的修復能力。

表4　敵草快和LA對育肥豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

D：敵草快；LA：硫辛酸；D×LA：敵草快×硫辛酸；+表示添加或滴注，-表示未添加或未滴注；**：P<0.01；*：P<0.05；n.s.：P>0.05。

D: diquat; LA: lipoic acid; D×LA: diquat ×lipoic acid; + mean added or injection; - mean without added or no injection; **:P<0.01; *:P<0.05; n.s.:P>0.05.

圖2　敵草快和LA對育肥豬空腸occludin(A)和ZO-1(B)mRNA相對表達量的影響

小腸結(jié)構(gòu)的正常是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和機體正常生長的生理基礎(chǔ)，腸道絨毛高度、隱窩深度、V/C等是衡量小腸結(jié)構(gòu)的重要指標。從組織學上講，絨毛萎縮引起的絨毛表面積的減少會造成小腸吸收功能的下降，即絨毛高度的下降會降低小腸的吸收功能[32]；隱窩深度反映的是細胞的生成率，隱窩變淺表明細胞成熟率上升，分泌功能增強，隱窩的深淺對維持腸道結(jié)構(gòu)穩(wěn)定具有重要的意義[33]；V/C則綜合反映了小腸的功能狀態(tài)，其比值的下降表明黏膜受損，消化吸收功能下降。王蕾等[34]的研究表明，應激導致豬絨毛高度顯著降低，隱窩深度顯著增大，V/C顯著降低。本試驗的結(jié)果顯示，氧化應激顯著降低了腸道絨毛高度、隱窩深度，顯著增加了V/C，此結(jié)果中隱窩深度和V/C的變化正好與王蕾等[34]的結(jié)果相悖。而Xiao等[35]研究表明，氧化應激使豬腸道絨毛高度、隱窩深度降低，使V/C增加，與本試驗結(jié)果類似。據(jù)推測，在強烈氧化應激的情況下，小腸為了抵御應激會生成大量的細胞以更新死亡的細胞，反而引起分泌功能加強，隱窩深度變淺；而V/C增加也可能是由于在劇烈氧化應激狀態(tài)下隱窩深度變淺的程度強于絨毛高度降低的程度。本試驗中試驗豬所遭受的氧化應激是劇烈的，此外，同在氧化應激的情況下，飼糧中添加LA使十二指腸和空腸的絨毛高度顯著增加，說明LA對氧化應激狀態(tài)下試驗豬十二指腸和空腸絨毛有了一定的修復；然而，在強烈的應激狀態(tài)下LA組回腸隱窩深度顯著高于非LA組，說明LA一定程度的減弱了氧化應激，進而減緩了回腸氧化應激狀態(tài)下新生細胞的速度；由于LA的強氧化性使氧化應激急速減緩，進而使隱窩深度顯著升高，而此時氧化應激導致腸道的絨毛高度斷裂還未能修復，因此空腸和回腸的V/C顯著降低。

緊密連接是構(gòu)成上皮屏障功能最重要的結(jié)構(gòu)，由occludin和ZO-1等結(jié)構(gòu)蛋白及各類連接蛋白分子共同組成。ZO-1與維持和調(diào)節(jié)上皮細胞和屏障功能有關(guān)，還參與調(diào)節(jié)細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運、維持上皮極性等重要過程。occludin功能涉及細胞間黏附、移動及通透性，一旦發(fā)生變異、減少和缺失可引起腸上皮細胞間隙通透性增加，因此occludin和ZO-1常被用來作為觀察各種組織緊密連接屏障功能和通透性功能的指標[36-39]。本試驗結(jié)果顯示，氧化應激極顯著降低了試驗豬空腸occludin和ZO-1 mRNA相對表達量，更深度地證明氧化應激造成了試驗豬腸道的損傷，而同在氧化應激的狀態(tài)下，LA組的試驗豬occludin和ZO-1 mRNA相對表達量顯著高于敵草快組，說明LA在氧化應激的情況下起到了修復試驗豬腸道的作用，在非應激的情況下LA并無顯著的作用。根據(jù)前文的試驗結(jié)果我們推測LA并沒有直接修復腸道的作用，而是通過其特殊結(jié)構(gòu)清除腸道過量的自由基使得腸道免受其害，進而達到了保護腸道的作用。

3.2敵草快和LA對育肥豬消化功能的影響

消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)是小腸的首要功能。其中空腸位于小腸中段，相比十二指腸和回腸更長，是動物消化吸收飼料的主要場所[40]。空腸內(nèi)食糜消化酶的活性能夠直接地反映出腸道消化吸收的能力，當腸道損傷時，消化酶會一定程度地減少，活性也會相應降低[41]。近幾年，國內(nèi)外研究氧化應激對育肥豬消化功能的影響相對較少。Guo等[42]對小鼠的研究顯示，氧化應激造成腸道的病變并顯著降低了腸道消化酶的活性。Gessner等[43]的研究表明，氧化應激使仔豬消化酶活性顯著降低。本試驗中，氧化應激極顯著地降低了腸道淀粉酶、胰蛋白酶以及脂肪酶活性，進一步印證了氧化應激對腸道消化功能的負作用。此外，本試驗加入的LA顯著增加了氧化應激試驗豬淀粉酶和胰蛋白酶的活性，說明LA可能具有提高氧化應激狀態(tài)下育肥豬的消化功能，根據(jù)本試驗中其他試驗結(jié)果的分析，推測LA可能是通過清除體內(nèi)的自由基來緩解氧化應激對腸道的損傷，進而增加了腸道絨毛高度，提高了消化能力，而具體的生理機制還需進一步探究。然而，LA對動物消化功能的作用未見報道，根據(jù)本試驗的結(jié)果可以初步推測LA可能是通過清除體內(nèi)過量的自由基緩解了應激，維持了機體正常的氧化還原狀態(tài)，從而增加了腸道絨毛高度、減緩了黏膜受損度并提高了空腸食糜中消化酶的活性，進而改善了育肥豬的消化功能。

4　結(jié)　論

本試驗研究表明，腹腔滴注8 mg/kg體重敵草快對育肥豬腸道結(jié)構(gòu)造成了嚴重損傷并減弱了腸道的消化功能；飼糧中添加800 mg/kg LA對腸道結(jié)構(gòu)和消化功能的影響較?。蝗欢?，在敵草快引起的應激狀態(tài)下，LA能夠減緩腸道的結(jié)構(gòu)損傷并能一定程度地提高腸道的消化功能。

[1]DRYDEN G W,Jr,DEACIUC I,ARTEEL G,et al.Clinical implications of oxidative stress and antioxidant therapy[J].Current Gastroenterology Reports,2005,7(4):308-316.

[2]JENA G,TRIVEDI P P,SANDALA B.Oxidative stress in ulcerative colitis:an old concept but a new concern[J].Free Radical Research,2012,46(11):1339-1345.

[3]DATTA K,SUMAN S,KALLAKURY B V S,et al.Exposure to heavy ion radiation induces persistent oxidative stress in mouse intestine[J].PLoS One,2012,7(8):e42224.

[4]SPALDING M D,PRIGGE S T.Lipoic acid metabolism in microbial pathogens[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2010,74(2):200-228.

[5]ROCHETTE L,GHIBU S,RICHARD C,et al.Direct and indirect antioxidant properties of α-lipoic acid and therapeutic potential[J].Molecular Nutrition & Food Research,2013,57(1):114-125.

[6]GUVEN A,TUNC T,TOPAL T,et al.α-lipoic acid and ebselen prevent ischemia/reperfusion injury in the rat intestine[J].Surgery Today,2008,38(11):1029-1035.

[7]POWELL L A,WARPEHA K M,XU W M,et al.High glucose decreases intracellular glutathione concentrations and upregulates inducible nitric oxide synthase gene expression in intestinal epithelial cells[J].Journal of Molecular Endocrinology,2004,33(3):797-803.

[8]CUI J,LE G W,YANG R L,et al.Lipoic acid attenuates high fat diet-induced chronic oxidative stress and immunosuppression in mice jejunum:a microarray analysis[J].Cellular Immunology,2009,260(1):44-50.

[9]YAMAUCHI M,NAKANO H,MAEKAWA J,et al.Oxidative stress in obstructive sleep apnea[J].Chest,2005,127(5):1674-1679.

[10]FU Y X,CHENG W H,ROSS D A,et al.Cellular glutathione peroxidase protects mice against lethal oxidative stress induced by various doses of diquat[J].Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine,1999,222(2):164-169.

[11]李麗娟,陳代文,余冰,等.氧化應激對斷奶仔豬肌體氧化還原狀態(tài)的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2007,19(3):199-203.

[12]徐靜,余冰,陳代文.Diquat誘導的生長豬氧化應激持續(xù)時間及適宜的應激標識[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2008,41(12):4359-4364.

[13]ZHENG P,YU B,HE J,et al.Protective effects of dietary arginine supplementation against oxidative stress in weaned piglets[J].British Journal of Nutrition,2013,109(12):2253-2260.

[14]LV M,YU B,MAO X B,et al.Responses of growth performance and tryptophan metabolism to oxidative stress induced by Diquat in weaned pigs[J].Animal,2012,6(6):928-934.

[15]趙嬌,周招洪,梁小芳,等.葡萄籽原花青素及維生素E對氧化應激仔豬生長性能、血清氧化還原狀態(tài)和肝臟氧化損傷的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2013,46(19):4157-4164.

[16]杜斌,陳煒,陳俊良,等.α-硫辛酸對百草枯中毒大鼠胸腺Bax、Bcl-2表達及SOD活力、MDA水平的影響[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2015,35(23):2071-2074.

[17]蔡旋,王靜嫻,陳小連,等.腸道上皮氧化應激細胞模型的研究進展[J].畜牧獸醫(yī)學報,2014,45(3):337-346.

[18]LANGIE S A S,WILMS L C,HMLINEN S,et al.Modulation of nucleotide excision repair in human lymphocytes by genetic and dietary factors[J].British Journal of Nutrition,2010,103(4):490-501.

[19]NEUBAUER O,REICHHOLD S,NICS L,et al.Antioxidant responses to an acute ultra-endurance exercise:impact on DNA stability and indications for an increased need for nutritive antioxidants in the early recovery phase[J].British Journal of Nutrition,2010,104(8):1129-1138.

[20]GORACA A,HUK-KOLEGA H, PIECHOTA A,et al.Lipoic acid-biological activity and therapeutic potential[J].Pharmacological Reports,2011,63(4):849-858.

[21]宋小珍,魯琳,劉鳳華,等.高溫應激對仔豬小腸上皮脂質(zhì)過氧化的動態(tài)影響[J].動物營養(yǎng)學報,2008,20(1):75-79.

[22]CHEN Q,LE G W,SHI Y H,et al.Effect of iron supplementation on intestinal function and oxidative stress in piglets with induced colitis[J].Journal of Animal and Feed Sciences,2007,16(2):205-213.

[23]王遠孝,張莉莉,周根來,等.大豆卵磷脂對子宮內(nèi)發(fā)育遲緩仔豬腸道抗氧化和熱休克蛋白70表達的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2012,45(13):2711-2717.

[24]KATARIA A K,KATARIA N.Evaluation of oxidative stress in pigs affected with classical swine fever[J].Porcine Research,2012,2(2):35-38.

[25]張海超.氧化應激對肉仔雞腸道氧化損傷和屏障功能的影響[D].碩士學位論文.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學,2012.

[26]張焱,馬雙余,孫曉力.胃腸道腫瘤患者機體氧化應激狀態(tài)的研究[J].西安交通大學學報:醫(yī)學版,2013,34(6):793-796.

[27]崔玨,肖瀛,王斌,等.硫辛酸高脂日糧對小鼠免疫功能的影響[J].營養(yǎng)學報,2010,32(1):35-38.

[28]吳聰,朱麗麗,楊永蘭,等.硫辛酸對高脂飼養(yǎng)小鼠氧化應激及血糖血脂的影響[J].營養(yǎng)學報,2010,32(5):489-494.

[29]李杏,陳小連,朱麗慧,等.硫辛酸對黃羽肉雞生長性能、抗氧化能力和免疫功能的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2012,24(3):515-521.

[30]朱家橋,曹隨忠,熊桂林,等.硫辛酸對圍產(chǎn)期奶牛血清脂肪代謝和肝功能酶的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2010,43(9):1933-1938.

[31]張康保,高倩,張雅靜,等.鎘對PC12細胞的氧化損傷及α-硫辛酸的保護效應[J].中國獸醫(yī)學報,2014,34(8):1349-1352,1357.

[32]EID Y Z,OHTSUKA A,HAYASHI K.Tea polyphenols reduce glucocorticoid-induced growth inhibition and oxidative stress in broiler chickens[J].British Poultry Science,2003,44(1):127-132.

[33]左之才,劉兵,李莉,等.早期斷乳應激性腹瀉對仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)與腸道菌群的影響[J].中國獸醫(yī)科學,2012,42(1):64-68.

[34]王蕾,劉堅,侯永清,等.α-酮戊二酸對LPS慢性應激仔豬小腸黏膜形態(tài)與功能的影響[J].畜牧獸醫(yī)學報,2010,41(1):46-52.

[35]XIAO K,SONG Z H,JIAO L F,et al.Developmental changes of TGF-β1 and smads signaling pathway in intestinal adaption of weaned pigs[J].PLoS One,2014,9(8):e104589.

[36]肖定福,唐志如,印遇龍,等.殼聚糖對仔豬腸黏膜通透性及Occludin和ZO-1表達的影響[J].畜牧獸醫(yī)學報,2012,43(6):894-900.

[37]楊鳳娟,曾祥芳,譙仕彥.羅伊氏乳桿菌I5007對新生仔豬腸道形態(tài)、二糖酶活性和緊密連接蛋白表達的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2014,47(22):4506-4515.

[38]YANG K M,JIANG Z Y,ZHENG C T,et al.Effect ofLactobacillusplantarumon diarrhea and intestinal barrier function of young piglets challenged with enterotoxigenicEscherichiacoliK88[J].Journal of Animal Science,2014,92(4):1496-1503.

[39]ZHANG B K,GUO Y M.Supplemental zinc reduced intestinal permeability by enhancing occludin and zonula occludens protein-1 (ZO-1) expression in weaning piglets[J].British Journal of Nutrition,2009,102(5):687-93.

[40]KATO A,ROMERO M F.Regulation of electroneutral NaCl absorption by the small intestine[J].Annual Review of Physiology,2011,73(1):261-281.

[41]MATTSSON O.Book review:radiologic examination of the small intestine[J].Acta Radiologica,1961,55(3):239.

[42]GUO M Y,SATOH K,QI B,et al.Thiol-oxidation reduces the release of amylase induced by β-adrenergic receptor activation in rat parotid acinar cells[J].Biomedical Research,2010,31(5):293-299.

[43]GESSNER D K,FIESEL A,MOST E,et al.Supplementation of a grape seed and grape marc meal extract decreases activities of the oxidative stress-responsive transcription factors NF-κB and Nrf2 in the duodenal mucosa of pigs[J].Acta Veterinaria Scandinavica,2013,55:18.

(責任編輯武海龍)

Effects of Diquat and Lipoic Acid on Intestinal Morphology and Digestive Function of Finishing Pigs

BAO Weiguang1HAO Yue1CUI Yanjun1LI Jielei1ZHANG Xiaojun1LI Gan1WANG Zhanbin2GU Xianhong1*

(1. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Institute of Animal Sciences,Beijing 100193, China; 2. College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

This study was to investigate the effects of diquat and lipoic acid (LA) on intestinal morphology and digestive function of finishing pigs, in order to explore whether diquat induced stress on the LA had a role in alleviating. Twenty-four healthy finishing pigs (Yorkshire) with the body weight of (70.64±3.61) kg were randomly allocated to control, LA, diquat, LA+diquat groups with 6 replicates per group and 1 pig per replicate by a 2×2 factorial arrangement. The trial period was 29 days. LA was given all in the trial (800 mg/kg diet). Diquat challenged pigs were given a single intraperitoneal injection of diquat at the 15th days and non-challenged pigs were injected intraperitoneally with the equal physiological saline amount at the same time. All the pigs were slaughtered after the vena cava blood was sampledon the 29th day. Using kits to detected the contents of plasma and intestine oxidative damage markers and the activities of digestive enzymes in jejunum chyme. After hematoxylin and eosin (HE) staining, using image analysis software to observed intestinal morphology structure and determined villus height, crypt depth, and calculated the value of the villus height to crypt depth (V/C). Using fluorescence quantitative PCR to detected the relative expression abundance of occludin and zonula occludens protein-1 (ZO-1) mRNA in jejunum. The results showed as follows: 1) diquat significantly increased the contents of malondialdehyde (MDA), protein carbonyl (PCO) and 8-hydroxy deoxyguanosine (8-OHdG) in plasma and intestine (P<0.01), significantly reduced the villus height and crypt depth in duodenum and jejunum and ileum (P<0.01), while significantly increased the V/C in duodenum and jejunum (P<0.01), and significantly increased the V/C of the ileum (P<0.05), significantly reduced the relative expression abundance of occludin andZO-1 mRNA in jejunum (P<0.01), and significantly reduced the activities of amylase, trypsase and lipase in jejunum chyme (P<0.01). 2) There were no significant difference on the contents of MDA, PCO and 8-OHdG in plasma and intestine when dietary supplementation of LA (P>0.05), as same as the villus height, crypt depth and V/C in duodenum, jejunum and ileum, the relative expression abundance of occludin andZO-1 mRNA in jejunum, the activities of amylase, trypsase and lipase in jejunum chyme (P>0.05). 3) Under the oxidative stress, dietary supplementation of LA significantly reduced the content of 8-OHdG in plasma (P<0.05), while significantly improved the villus height in duodenum and jejunum (P<0.05), and significantly improved crypt depth in ileum (P<0.05), significantly reduced V/C in jejunum (P<0.05) and ileum (P<0.01), significantly increased the relative expression abundance of occludin andZO-1 mRNA in jejunum (P<0.05), significantly improved the activity of amylase and trypsase in jejunum chyme (P<0.05). In conclusion, diquat caused oxidative stress in pigs is strong, leading to serious injury of intestinal structure and weakened intestinal digestive function. Dietary supplementation of 800 mg/kg of LA can suppress the oxidative stress caused by diquat injection on intestinal injury of finishing pigs, and may improve digestive function.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3264-3274]

diquat; lipoic acid; finishing pigs; oxidative stress; intestine

, professor, E-mail: guxianhong@vip.sina.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.030

2016-04-11

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃課題(2012CB124706)；國家科技支撐計劃課題(2012BAD39B02)；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS07)

鮑偉光(1988—)，男，河南開封人，碩士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學專業(yè)。E-mail: baoweiguang2013@163.com

顧憲紅，研究員，博士生導師，E-mail: guxianhong@vip.sina.com

S828

A

1006-267X(2016)10-3264-11