飼糧精粗比對(duì)泌乳水牛瘤胃細(xì)菌和甲烷菌區(qū)系的影響

林　波　梁　辛　李麗莉　韋升菊　李　萍　鄒彩霞,*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南寧530004；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧530001)

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飼糧精粗比對(duì)泌乳水牛瘤胃細(xì)菌和甲烷菌區(qū)系的影響

林波1梁辛2李麗莉2韋升菊2李萍1鄒彩霞1,2*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南寧530004；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧530001)

本試驗(yàn)旨在研究飼糧精粗比對(duì)泌乳水牛瘤胃細(xì)菌和甲烷菌區(qū)系的影響。選取15頭健康雜交后備泌乳水牛，按體重、采食量等相近原則隨機(jī)分為3組，每組5頭，分別飼喂精粗比為0∶100(全粗料組)、35∶65(低精料組)、50∶50(中等精料組)的混合飼糧。試驗(yàn)為期40 d，其中前10 d為預(yù)試期。在試驗(yàn)結(jié)束后第1天，經(jīng)口腔抽取瘤胃液抽提微生物DNA，采用Illumina Miseq PE250平臺(tái)研究瘤胃細(xì)菌和甲烷菌區(qū)系組成。結(jié)果表明：1)在門(mén)水平上，水牛瘤胃內(nèi)擬桿菌門(mén)(45%～65%)、厚壁菌門(mén)(13%～27%)和變形菌門(mén)(13%～18%)為主要細(xì)菌類(lèi)別，與低精料組和中等精料組相比，全粗料組提高了擬桿菌門(mén)、黃桿菌門(mén)和SR1細(xì)菌的比例，降低了厚壁菌門(mén)、疣微菌門(mén)、放線菌門(mén)和綠彎菌門(mén)細(xì)菌的比例；在科水平上，普雷沃氏科(15%～32%)和黃桿菌科(8%～21%)為主要細(xì)菌類(lèi)別，與中等精料組相比，全粗料組、低精料組提高了普雷沃氏科細(xì)菌的比例，降低了黃桿菌科、毛螺菌科、瘤胃球菌科、紅蝽?xiàng)U菌科和雙歧桿菌科細(xì)菌的比例；中等精料組瘤胃細(xì)菌相比全粗料組有更高的多樣性。2)水牛瘤胃內(nèi)，90%以上的甲烷菌為甲烷短桿菌屬，其次為熱原體屬，飼糧精粗比的改變并未影響甲烷短桿菌屬在瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)地位。綜合得出，全粗料飼糧有提高水牛瘤胃內(nèi)纖維降解相關(guān)細(xì)菌比例的趨勢(shì)，卻降低了瘤胃細(xì)菌的多樣性；飼糧精粗比的差異對(duì)水牛瘤胃甲烷菌在屬水平上的組成并無(wú)顯著影響。

水牛；精粗比；瘤胃；細(xì)菌區(qū)系；甲烷菌區(qū)系

水牛是典型的以粗料飼喂的反芻動(dòng)物，其瘤胃發(fā)酵特點(diǎn)及微生物區(qū)系組成有何特點(diǎn)尚無(wú)定論。飼糧精粗比是決定瘤胃發(fā)酵的主要因素，而改變飼糧精粗比以研究瘤胃微生物區(qū)系的反應(yīng)也是闡明反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系特點(diǎn)的重要手段[1-2]。Mao等[3]研究表明，在飼喂高精料飼糧的奶牛瘤胃內(nèi)，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)細(xì)菌的比例則較高，而變形菌門(mén)(Proteobacteria)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)細(xì)菌的比例較低。Pitta等[4]對(duì)水牛的研究發(fā)現(xiàn)，全粗料飼糧飼喂后瘤胃內(nèi)瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和黃桿菌門(mén)(Fibrobacter)細(xì)菌的比例較高；而精粗比為50∶50的飼糧飼喂后瘤胃內(nèi)普雷沃菌屬(Prevotella)細(xì)菌的比例較高，表明瘤胃球菌屬和黃桿菌門(mén)細(xì)菌是瘤胃內(nèi)纖維消化的重要細(xì)菌類(lèi)別。本課題組前期的研究也表明，提高飼糧精粗比降低了瘤胃內(nèi)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和丁酸弧菌數(shù)量[5]。高粗飼糧條件下，纖維降解菌如丁酸弧菌、棲瘤胃普雷沃氏菌等是瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌種；高精料條件下，嗜淀粉類(lèi)細(xì)菌如反芻獸新月單胞菌、消化鏈球菌、乳酸桿菌以及嗜淀粉瘤胃桿菌為優(yōu)勢(shì)菌種[6-7]。然而，在不同精粗比飼糧下水牛瘤胃微生物區(qū)系的變化情況研究報(bào)道還較少，不足以闡明水牛瘤胃微生物區(qū)系的特點(diǎn)。因此，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)飼喂不同精粗比飼糧的水牛瘤胃細(xì)菌和甲烷菌區(qū)系的變化進(jìn)行了研究，以期闡明飼糧精粗比構(gòu)成對(duì)水牛瘤胃細(xì)菌和甲烷菌區(qū)系的影響，為進(jìn)一步了解水牛瘤胃提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)在廣西水牛研究所水牛養(yǎng)殖示范基地進(jìn)行。選取15頭健康雜交[廣西本地水?！?尼里-拉菲水牛)×摩拉水牛]后備泌乳水牛，按體重、采食量等相近原則隨機(jī)分為3組，每組5頭水牛。試驗(yàn)牛進(jìn)行單槽專(zhuān)人飼喂，采取先粗后精的飼喂順序。飼喂后，試驗(yàn)牛放于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)自由運(yùn)動(dòng)和飲水。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

采用單因素設(shè)計(jì)原則，3組水牛分別飼喂精粗比為0∶100(全粗料組)、35∶65(低精料組)和50∶50的混合飼糧(中等精料組)，試驗(yàn)期共40 d，其中預(yù)試期10 d，正試期30 d。預(yù)試期內(nèi)逐步過(guò)渡飼糧精粗比，到正試期前達(dá)到試驗(yàn)所設(shè)定的精粗比。精料組成、精料和粗料飼喂量及采食營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1　精料組成、精料和粗料飼喂量及采食營(yíng)養(yǎng)水平

1)每千克預(yù)混料含有 One kg of premix contained the following：VE 3 000 IU,VD 150 000 IU,VA 500 000 IU,Cu 1.3 g,Fe 4.0 g,Mn 3.0 g,I 80 mg,Zn 6.0 g,Co 80 mg,Se 50 mg。

2)實(shí)測(cè)值 Measured values。

1.3瘤胃液采集

正試期結(jié)束后第1天，每頭水牛采集瘤胃液100 mL，以組為單位混合，通過(guò)4層紗布過(guò)濾，取

50 mL濾液冷凍干燥(Christ Alpha 1-4 LD plus, Christ Alpha, Germany)，用于DNA提取測(cè)定微生物區(qū)系。

1.4瘤胃微生物區(qū)系測(cè)定

1.4.1瘤胃液DNA提取

DNA提取方法按照Rius等[8]的報(bào)道進(jìn)行。具體方法為：稱(chēng)取25 mg冷凍干燥瘤胃液置于裝有0.7 g鋯珠(0.1 mm)、200 μL的20%十二烷基苯磺酸鈉(SDS)、282 μL的QIAquick Buffer A和268 μL的QIAquick Buffer PB(Qiagen，德國(guó))以及550 μL的飽和酚/氯仿/異戊醇溶液(25∶24∶1)的離心管中。封閉離心管后于小型珠磨器(Biospec Mini-Beadbeater-16，美國(guó))上破碎2 min，然后于16 000×g(4 ℃)下離心20 min，取500 μL上清液與650 μL的Buffer PB混合后，用QIAquick PCR purification kit(Qiagen，德國(guó))純化混合液獲得DNA樣品。

1.4.2水牛瘤胃微生物區(qū)系組成的測(cè)序分析

瘤胃細(xì)菌和甲烷菌的16S rRNA基因片段擴(kuò)增與處理均按照Kittelmann等[9]提供的方法進(jìn)行。PCR引物由Illumina Miseq PE250測(cè)序接頭、1個(gè)2堿基的連接(linker)和樣品標(biāo)簽(barcode)組成，細(xì)菌PCR引物為515f/806r，甲烷菌PCR引物為519f/915r(表2)。PCR擴(kuò)增采用Promega PCR mix進(jìn)行，體系為50 μL，每個(gè)樣品的2種微生物分別擴(kuò)增2管。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；然后進(jìn)入94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s的循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增后，將同一樣品的同一種微生物的2管PCR產(chǎn)物混合，電泳后切膠回收，采用膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)純化；采用ND2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo，德國(guó))準(zhǔn)確測(cè)定純化產(chǎn)物的DNA濃度(精確到0.1 ng/μL)后，每個(gè)樣品的PCR純化產(chǎn)物按照細(xì)菌∶甲烷菌=5∶1的濃度比例混合。最后，將各樣品全部PCR產(chǎn)物混合后，送廣州?；锛夹g(shù)有限公司應(yīng)用Miseq PE250平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析。

表2　瘤胃微生物區(qū)系測(cè)序分析采用的引物信息

1.4.3測(cè)序序列的聚類(lèi)分析和注釋

測(cè)序數(shù)據(jù)分析采用QIIME 1.5進(jìn)行，經(jīng)過(guò)去除接頭污染、低復(fù)雜度以及低質(zhì)量reads等質(zhì)量控制后，對(duì)獲得的clean reads進(jìn)行拼接并去除引物，用于后續(xù)分析[10]。序列分類(lèi)操作單元(OTU)注釋和聚類(lèi)分析按照與細(xì)菌和古菌97%相似度以上的原則進(jìn)行。OTU聚類(lèi)分析和注釋通過(guò)與Ribosomal Database Project(RDP)數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)菌和古菌序列比對(duì)進(jìn)行，細(xì)菌聚類(lèi)分析到門(mén)和科水平，甲烷菌分類(lèi)到屬水平。

1.5統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均采用SAS 8.02軟件的GLM程序進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用Duncan氏法，P<0.05為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果與分析

2.1高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與多樣性分析

高通量測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量控制后，各組細(xì)菌和甲烷菌測(cè)序clean reads數(shù)、OTU數(shù)以及樣品物種多樣性指數(shù)如表3。水牛瘤胃內(nèi)細(xì)菌測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，在種水平上得到的clean reads數(shù)平均值為26 613，OTU數(shù)平均值為969，測(cè)序覆蓋率為0.89～0.90；細(xì)菌香農(nóng)多樣性指數(shù)平均值為7.58，Chao1多樣性指數(shù)平均值為1 233。除中等精料組香農(nóng)指數(shù)顯著高于全粗料組(P<0.05)外，組間細(xì)菌各指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。水牛瘤胃內(nèi)甲烷菌測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，在種水平上得到的clean reads數(shù)平均值為8 607，OTU數(shù)平均值為136，測(cè)序覆蓋率為0.74～0.93；甲烷菌香農(nóng)多樣性指數(shù)平均值為1.25，Chao1多樣性指數(shù)平均值為237。組間甲烷菌各指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3　瘤胃細(xì)菌和甲烷菌高通量測(cè)序質(zhì)量控制與樣品多樣性指數(shù)

2.2飼糧精粗比對(duì)瘤胃細(xì)菌區(qū)系的影響

不同精粗比飼糧下，瘤胃細(xì)菌組成在門(mén)水平和科水平的組成見(jiàn)表4。水牛瘤胃細(xì)菌在門(mén)水平上主要的細(xì)菌門(mén)是擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)。全粗料組擬桿菌門(mén)細(xì)菌的比例顯著高于中等精料組(P<0.05)，黃桿菌門(mén)和SR1細(xì)菌的比例顯著高于低精料組和中等精料組(P<0.05)，但全粗料組厚壁菌門(mén)、疣微菌門(mén)細(xì)菌的比例顯著低于中等精料組(P<0.05)，放線菌門(mén)和綠彎菌門(mén)細(xì)菌的比例顯著低于低精料組和中等精料組(P<0.05)。

在科水平上，瘤胃細(xì)菌以普雷沃氏科(Prevotellaceae)和黃桿菌科(Fibrobacteraceae)為主。全粗料組、低精料組普雷沃氏科細(xì)菌的比例顯著高于中等精料組(P<0.05)，而全粗料組和低精料組黃桿菌科、毛螺菌科、紅蝽?xiàng)U菌科和雙歧桿菌科細(xì)菌的比例均顯著低于中等精料組(P<0.05)，全粗料組瘤胃球菌科細(xì)菌的比例顯著低于中等精料組(P<0.05)。

表4　瘤胃細(xì)菌門(mén)和科水平上的細(xì)菌比例(占總菌比例大于1%)

續(xù)表4分類(lèi)學(xué)水平Taxonomylevel微生物Microbes/%全粗料組Allforagegroup低精料組Lowconcentrategroup中等精料組MediumconcentrategroupSEMP值P?value科Family普雷沃氏科Prevotellaceae31．6a25．7a15．1b2．09<0．001黃桿菌科Fibrobacteraceae8．3b11．3b20．5a5．75<0．001腸桿菌科Enterobacteriaceae7．617．699．580．570．348莫拉氏菌科Moraxellaceae4．254．335．370．420．505毛螺菌科Lachnospiraceae2．28b2．74b4．73a0．34<0．001瘤胃球菌科Ruminococcaceae2．55b3．18ab4．62a0．24<0．001韋榮球菌科Veillonellaceae0．760．860．670．050．339紫單胞菌科Porphyromonadaceae0．640．630．760．040．059叢毛單胞菌科Comamonadaceae0．600．410．260．060．005紅蝽?xiàng)U菌科Coriobacteriaceae0．25b0．31b0．49a0．04<0．001未分類(lèi)菌科XⅢIncertaesedisXⅢ0．170．250．580．230．078雙歧桿菌科Bifidobacteriaceae0．10b0．17b0．65a0．310．001

不同精粗比飼糧飼喂的各組水牛瘤胃細(xì)菌組成的柱狀分布圖和熱圖分布分別如圖1和圖2所示。雖然組間各樣品瘤胃細(xì)菌組成相近，但不同組間瘤胃細(xì)菌組成比例仍存在差異，特別是全粗料組的普雷沃氏科、鏈球菌科(Streptococcaceae)和氣單胞菌科(Aeromonadaceae)細(xì)菌的比例較高，而中等精料組中黃桿菌科、瘤胃球菌科、毛螺菌科、雙歧桿菌科和厭氧繩菌科(Anaerolineaceae)細(xì)菌的比例較高。

AF：全精料組 all forage group；LC：低精料組 low concentrate group；MC：中等精料組 medium concentrate group。下圖同 The same as below。

圖1飼糧精粗比對(duì)瘤胃細(xì)菌在科水平上組成的影響

Fig.1Effects of forage to concentrate ratio on ruminal bacteria composition at family level

圖2　飼糧精粗比對(duì)瘤胃細(xì)菌在科水平上熱圖分布的影響

2.3飼糧精粗比對(duì)泌乳水牛瘤胃甲烷菌區(qū)系的影響

飼糧精粗比對(duì)瘤胃甲烷菌區(qū)系在屬水平上組成的影響如圖3所示?？设b定到屬水平的水牛瘤胃甲烷菌共6個(gè)，其中主要的甲烷菌是甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、熱原體屬(Thermoplasma)和甲烷球菌屬(Methanosphaera)，這3類(lèi)菌約占甲烷菌總數(shù)的95%，其中各組甲烷短桿菌屬細(xì)菌的比例均在90%以上。飼糧精粗比均未影響各組甲烷菌的組成比例。

圖3　飼糧精粗比對(duì)瘤胃甲烷菌在屬水平上組成的影響

3　討　論

3.1飼糧精粗比對(duì)瘤胃細(xì)菌區(qū)系的影響

飼糧精粗比是決定瘤胃發(fā)酵的主要原因之一，我們前期的研究結(jié)果表明飼糧精粗比影響了水牛瘤胃的發(fā)酵指標(biāo)[5]，而其調(diào)控的途徑主要通過(guò)影響瘤胃微生物區(qū)系或功能。研究表明，隨著飼糧精料比例的提高，纖維降解菌和真菌數(shù)量逐漸減少，當(dāng)精料增加到一定比例時(shí)，瘤胃內(nèi)低pH最終會(huì)抑制纖維降解菌的生長(zhǎng)[7,11]。Kocherginskaya等[12]發(fā)現(xiàn)高精料飼糧瘤胃內(nèi)細(xì)菌數(shù)量和種類(lèi)較多，變形菌門(mén)是門(mén)水平上的主要細(xì)菌；對(duì)高粗飼糧而言，低G+C含量的革蘭氏陽(yáng)性菌為主要的細(xì)菌類(lèi)別。Wetzels等[13]報(bào)道，與30%精料水平組相比，0和60%精料水平組瘤胃壁上的厚壁菌門(mén)和SR1含量較高。Mao等[3]研究表明，在飼喂高精料飼糧引起亞急性酸中毒的奶牛瘤胃內(nèi)，變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)細(xì)菌的比例顯著降低，而厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)細(xì)菌的比例則提高；在屬水平上，普雷沃菌屬、密螺旋體屬(Treponema)、厭氧支原體屬(Anaeroplasma)等屬細(xì)菌的比例在高精料飼糧組中較低，但瘤胃球菌屬、奇異菌屬(Atopobium)和梭菌目(Clostridiales)等細(xì)菌的比例較高。本研究結(jié)果表明，精粗比為50∶50組水牛瘤胃細(xì)菌在門(mén)水平上具有較高比例的厚壁菌門(mén)、變菌門(mén)和放線菌門(mén)細(xì)菌，而全粗料組則具有較高比例的擬桿菌門(mén)、黃桿菌門(mén)和SR1細(xì)菌，該結(jié)果與其他一些關(guān)于奶牛和羊的結(jié)果相似[3,13]，均表明高精料飼糧可提高瘤胃內(nèi)厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)，降低擬桿菌門(mén)細(xì)菌的比例。在科水平上，本研究發(fā)現(xiàn)全粗料組普雷沃氏科細(xì)菌比例(31.6%)為最高，而中等精飼糧組黃桿菌科細(xì)菌的比例(20.5%)為最高；普雷沃氏科是擬桿菌門(mén)的主要細(xì)菌，含有較多高活性的半纖維素降解菌，廣泛存在于瘤胃和動(dòng)物后腸道中負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)和碳水化合物的分解[14]，其在高粗飼糧中含量較高表明該科的細(xì)菌與纖維消化密切相關(guān)。然而，Pitta等[4]對(duì)水牛飼喂不同精粗比飼糧研究結(jié)果表明，全粗料飼喂組水牛瘤胃內(nèi)瘤胃球菌屬和黃桿菌門(mén)細(xì)菌數(shù)量較高，而在50∶50精粗比飼糧組，普雷沃氏屬是細(xì)菌數(shù)量最多的屬，與本研究結(jié)果并不一致，其原因可能本試驗(yàn)與該研究的動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)差異有關(guān)，本試驗(yàn)3組水牛為同時(shí)飼喂，而該研究則為同組水牛順序飼喂，即先喂全粗料飼糧再喂低精料飼糧，最后喂中等精料飼糧；此外，也有可能與引物的差異有關(guān)，Pitta等[4]的研究采用不同的引物得到了不同的細(xì)菌區(qū)系組成，表明引物的合理選擇對(duì)區(qū)系的影響較大。本研究發(fā)現(xiàn)精粗比為50∶50組瘤胃內(nèi)細(xì)菌的香農(nóng)多樣性指數(shù)顯著高于全粗料組，表明飼喂適宜的精料有提高瘤胃內(nèi)細(xì)菌多樣性的趨勢(shì)，該結(jié)果與孫云章[15]的研究表明飼糧由全粗料轉(zhuǎn)為精粗比為30∶70時(shí)，山羊瘤胃細(xì)菌區(qū)系多樣性增加一致。此外，Kocherginskaya等[12]也研究表明，高精料飼糧飼喂下山羊瘤胃內(nèi)細(xì)菌數(shù)量和種類(lèi)較多。本研究中，精粗比為50∶50組瘤胃內(nèi)細(xì)菌多樣性高于全粗料飼糧組的原因可能與精粗比為50∶50組瘤胃內(nèi)分解淀粉和纖維的細(xì)菌共存，而全粗料飼糧組則以高效分解纖維的細(xì)菌為主，種類(lèi)較少有關(guān)，因此給水牛飼喂精粗平衡的飼糧有利于維持瘤胃細(xì)菌的多樣性和穩(wěn)定性。

3.2飼糧精粗比對(duì)瘤胃甲烷菌區(qū)系的影響

飼糧精粗比會(huì)顯著影響反芻動(dòng)物瘤胃甲烷產(chǎn)量，高粗飼糧甲烷產(chǎn)量和甲烷菌數(shù)量均顯著高于高精料飼糧，但飼糧精粗比對(duì)甲烷菌區(qū)系的研究報(bào)道還較少?，F(xiàn)有研究表明，反芻動(dòng)物瘤胃甲烷菌以甲烷短桿菌屬為主，其次是甲烷球菌屬和熱原體屬[16]；較多印度學(xué)者的研究表明，水牛瘤胃內(nèi)甲烷菌以甲烷微菌屬(Methanomicrobium)細(xì)菌為主，表現(xiàn)出不同于其他反芻動(dòng)物不同的區(qū)系[17-19]。本研究表明，水牛瘤胃內(nèi)甲烷菌共7個(gè)屬，其中甲烷短桿菌屬在各組中的占比均在90%以上，與Franzolin等[20]報(bào)道水牛瘤胃甲烷菌以甲烷短桿菌屬為主一致，且與反芻動(dòng)物的瘤胃甲烷菌以甲烷桿菌屬為主一致。本研究結(jié)果不同于其他印度學(xué)者研究結(jié)果的原因可能與水牛所處的地理位置或品種有關(guān)[21]，另一重要原因可能與引物的差異有關(guān)，研究表明不同甲烷菌引物會(huì)產(chǎn)生不同的菌群組成[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，水牛飼糧精粗比并未影響甲烷短桿菌屬在水牛瘤胃內(nèi)的主導(dǎo)地位，因此飼糧精粗比對(duì)瘤胃甲烷產(chǎn)量的影響可能主要?dú)w因于甲烷菌數(shù)量的變化，但飼糧精粗比的改變是否影響了不同種的甲烷短桿菌組成尚有待進(jìn)一步研究。有研究表明，反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)甲烷菌組成有其個(gè)體特異性[23]，并不容易隨外界環(huán)境和飼糧組成的改變的而變化。

4　結(jié)　論

全粗料飼糧有提高瘤胃內(nèi)纖維降解相關(guān)細(xì)菌比例的趨勢(shì)，卻降低了瘤胃細(xì)菌的多樣性；飼糧精粗比的差異對(duì)瘤胃甲烷菌在屬水平上的組成并無(wú)顯著影響。

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(責(zé)任編輯王智航)

Dietary Forage to Concentrate Ratio Affects Ruminal Bacterial and Methanogen Community Composition of Water Buffaloes

LIN Bo1LIANG Xin2LI Lili2WEI Shengju2LI Ping1ZOU Caixia1,2*

(1. College of Animal Science, Guangxi University, Nanning 530004, China; 2. Key Laboratory of Buffalo Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Buffalo Genetics, Breeding and Reproduction of Guangxi, Buffalo Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530001, China)

This study was conducted to study the effects of dietary forage to concentrate ratio on ruminal bacterial and methanogen community composition of water buffaloes. Fifteen healthy similar hybrid water buffaloes were selected and divided into three groups with 5 heads per group according to body weight and feed intake. The three groups were fed diets with concentrate to forage ratio at 0∶100 (all forage group), 35∶65 (low concentrate group) and 50∶50 (medium concentrate group), respectively. The total experimental period was 40 days, including 10 days of advanced experiment feeding period. On day 1 after the experiment, rumen fluid sample was taken from rumen through mouth, and ruminal fluid DNA was extracted to research ruminal bacterial and methanogen community by Illumina Miseq 250PE. The results showed as follows: 1) at phyla level, ruminal bacterial community of buffaloes was dominated by Bacteroidetes (45% to 65%) and Firmicutes (13% to 27%) and Proteinobacter (13% to 18%); compared with low concentrate group and medium concentrate group, all forage group increased the proportions of Bacteroidetes, Fibrobacter and SR1, but decreased the proportions of Firmicutes, Verrucomicrobia, Actinobacteria and Chloroflexi; at the family level, the dominant bacteria were Prevotellaceae (15% to 32%) and Fibrobacteraceae (8% to 21%); compared with medium concentrate group, all forage group and low concentrate group increased the proportions of Prevotellaceae, while decreased the proportions of Fibrobacteraceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Coriobacteriaceae and Bifidobacteriaceae; additionally, the bacterial community in medium concentrate group was more diverse than that in all forage group. 2) Ruminal methanogen community of water buffaloes was dominated byMethanobrevibacter(over 90%), followed byThermoplasma; dietary concentrate to forage ratio had no influence on ruminal methanogen community of water buffaloes. In conclusion, bacteria related with fiber digestion tends to be increased by all forge diet, but ruminal bacterial diversity is decreased by all forage diet; there is no influence of concentrate to forage ratio on ruminal methanogen composition of water buffaloes at genus level.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(10)：3101-3109]

water buffalo; concentrate to forage ratio; rumen; bacteria community; methanogen community

， professor， E-mail: caixiazou2002@hotmail.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.10.012

2016-03-28

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160470)；廣西自然科學(xué)基金(2013GXNSFBA019114)

林波(1983—)，男，四川雅安人，副研究員，博士，主要從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail: linbobri@foxmail.com

鄒彩霞，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: caixiazou2002@hotmail.com

S823

A

1006-267X(2016)10-3101-09