Bif-1在肝癌中的表達(dá)并縮短其生存期相關(guān)性研究

范仁根　查文章　周勇　秦呈林　單湘湘　周建平　萬心強(qiáng)

Bif-1在肝癌中的表達(dá)并縮短其生存期相關(guān)性研究

范仁根1查文章1周勇1秦呈林1單湘湘2周建平2萬心強(qiáng)3

目的 探討B(tài)if-1在肝癌組織的表達(dá)及其對于臨床預(yù)后的相關(guān)性。方法 用免疫組化法研究206例肝細(xì)胞肝癌中Bif-1的表達(dá)情況。半定量測定細(xì)胞質(zhì)的免疫反應(yīng)。并與其他多個臨床病理參數(shù)結(jié)合分析，其中包括患者的生存情況。運(yùn)用χ2檢驗(yàn)和K-M生存分析進(jìn)行研究。結(jié)果 Bif-1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平高于癌旁組織。Bif-1在肝癌中表達(dá)水平的增高與組織低分化和短生存期顯著相關(guān)。Bif-1的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、腫瘤大小、包膜侵犯、HBs-Ag的表達(dá)以及門靜脈侵犯無顯著相關(guān)性。結(jié)論 Bif-1在肝癌中過表達(dá)。Bif-1的過表達(dá)是一個新的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志，與腫瘤的不良分化與總生存期縮短相關(guān)。

Bif-1；Beclin1；肝癌；生存期

在世界范圍內(nèi)，肝細(xì)胞肝癌發(fā)病率第五，在腫瘤相關(guān)死亡率中位列第三，是肝移植的主要指征[1］。因此，肝癌是人類健康的一大重要問題，預(yù)計(jì)在不久的將來與其相關(guān)的問題還會增加。盡管診斷水平和外科治療方法近年來取得巨大進(jìn)展，患者的預(yù)后仍不盡如人意，因?yàn)樵谇谐g(shù)后或其他局部區(qū)域治療法后，復(fù)發(fā)率較高。然而，肝癌的發(fā)展機(jī)制至今仍不明確。

Bif-1是一種保守的胞漿蛋白，包含一個羧基SH3結(jié)構(gòu)域，最初是被作為Bax結(jié)合蛋白發(fā)現(xiàn)的[2］。Bif-1與Bcl-2家族蛋白沒有顯著的同源性。這一家族的蛋白與Bax蛋白相互作用，影響細(xì)胞的生存和死亡。近來，Bif-1表達(dá)的臨床病理作用被認(rèn)為與多種腫瘤的發(fā)展與預(yù)后相關(guān)[3］。然而，Bif-1與肝癌的臨床病理關(guān)聯(lián)仍不清楚。本研究的目的是用免疫組化的方法檢測Bif-1在肝癌中的表達(dá)情況并探索其與預(yù)后的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1一般資料

選取2012年6月～2013年6月筆者所在醫(yī)院收治的206例肝癌患者的臨床資料，男134例，女72例，年齡50～83歲，平均（52.34±2.09）歲。所有患者均符合肝癌疾病判斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重感染者、合并嚴(yán)重疾病者等。

1.2方法

通過鼠抗人Bif-1單克隆抗體（CA，USA；1∶500稀釋）進(jìn)行免疫組化染色，切片，脫蠟用二甲苯和乙醇，3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（微波加熱檸檬酸緩沖液為40分鐘），一抗暴露于48℃過夜并用抗過氧化物酶染色試劑盒染色，標(biāo)記抗原用3，3'-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽，其后用蘇木精復(fù)染。免疫組化染色為Bif-1評價經(jīng)臨床三個未知患者預(yù)后的病理學(xué)專家，結(jié)果得到一致共識。根據(jù)Bif-1陽性細(xì)胞百分率強(qiáng)度進(jìn)行評估。Bif-1陽性細(xì)胞百分率強(qiáng)度分級如下，0級0～39%；1級：40～69%；2級＞70%。免疫染色強(qiáng)度得分為：0，負(fù)；1，弱；2，強(qiáng)。此外，免疫反應(yīng)評分為陽性染色細(xì)胞百分率及染色強(qiáng)度評分（0～4）相加得出。免疫陽性的腫瘤評分0～1被指定為“低”，腫瘤評分2～4免疫反應(yīng)評分被指定為“高”。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 15統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)確定組間變量之間的差異，采用K-M生存分析法研究分類組與生存期的相關(guān)性。P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

通過免疫組化檢測206例肝癌患者及其相應(yīng)的癌旁組織Bif-1的表達(dá)情況。在正常肝組織和癌組織中，可以觀察到Bif-1在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色，而細(xì)胞核不染色。免疫組化結(jié)果如圖1所示。106例腫瘤組織為Bif-1高表達(dá)組（51.5%），其余100個腫瘤組織為Bif-1低表達(dá)組（48.5%）。Bif-1在癌組織和癌旁組織的表達(dá)率分別為51.5%和33.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1　Bif-1 在肝癌及癌旁組織的表達(dá)

圖2　Bif-1在肝癌術(shù)后組織中的表達(dá)與總體生存率的相關(guān)性

結(jié)果提示患者Bif-1的表達(dá)情況與患者的細(xì)胞病理分級及預(yù)后有一定相關(guān)性，而與患者性別、年齡，腫瘤大小、內(nèi)膜損傷、乙肝表面抗原的表達(dá)、門靜脈浸潤無關(guān)。

表1　Bif-1在肝癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性

實(shí)驗(yàn)中，我們研究了Bif-1在肝癌組織中的表達(dá)與生存周期的相關(guān)性，單因素分析結(jié)果提示Bif-1與肝癌的預(yù)后密切相關(guān)，Bif-1陽性高表達(dá)的患者與低表達(dá)的患者生存周期明顯不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（對數(shù)秩檢驗(yàn)值=4.096，P=0.043；圖2）。高表達(dá)組的平均生存期為（40.0±2.5）個月，而低表達(dá)組為（49.0±3.5）個月。這表明，Bif-1表達(dá)水平是肝癌患者總體生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。

3　討論

本研究中，我們用免疫組化法檢測了Bif-1在肝癌中的表達(dá)情況，與癌旁組織相比，Bif-1在肝癌組織細(xì)胞中高表達(dá)。Bif-1可通過UVRAG與Bec lin1作用來調(diào)節(jié)PI3KC3的活性以及在哺乳動物細(xì)胞中的自我吞噬效應(yīng)。既往研究表明，Bif-1表達(dá)下調(diào)明顯抑制PI3KC3的活性以及自噬小體在人宮頸癌細(xì)胞和老鼠成纖維細(xì)胞的形成[4］。另外，研究發(fā)現(xiàn)Bif-1 與Atg9陽性囊泡可共同局部化[5］。這些囊泡的形成與轉(zhuǎn)運(yùn)是吞噬過程中自噬小體膜起源和膨脹的必要條件。自我吞噬是一種進(jìn)化上高度保守的代謝途徑，可降解細(xì)胞大分子和器官細(xì)胞[6］。自我吞噬與細(xì)胞程序性死亡密切相關(guān)，已經(jīng)受到了眾多學(xué)者的關(guān)注。

自噬死亡消除了機(jī)體損壞的有害細(xì)胞，包括受化療藥物作用的腫瘤細(xì)胞。增生的腫瘤細(xì)胞的生長需要營養(yǎng)，然而腫瘤周圍環(huán)境中含氧量和營養(yǎng)都顯著減少。在正常乳腺組織氧氣和葡萄糖中位水平分別是10 kPa與5 mmol/l，而在乳腺癌組織中則分別為4 kPa與1.5 mmol/l[7］。這一差異說明腫瘤細(xì)胞除了高糖酵解，也需要通過自我吞噬來增加能量供給。隨著腫瘤的生長，癌細(xì)胞可能需要自我吞噬以在營養(yǎng)缺乏和低氧的環(huán)境下生存，表現(xiàn)為有限的血管化。自噬小體被認(rèn)為存在于血管化不足和低代謝區(qū)域。另外，凋亡腫瘤組織中對自我吞噬的抑制亦可導(dǎo)致細(xì)胞壞死。因此，自我吞噬被認(rèn)為是一個必要的生理反應(yīng)，在營養(yǎng)缺乏的的條件下維持腫瘤細(xì)胞的活力。

實(shí)驗(yàn)表明，相比于高分化的肝癌組織，低分化的肝癌組織中Bif-1的表達(dá)水平更高。Bif-1表達(dá)水平增高與肝癌分級之間的關(guān)聯(lián)目前尚不明確。Ogier-Denis等[8］人的研究已經(jīng)證實(shí)，相比于分化良好的結(jié)腸癌細(xì)胞，未分化的克隆細(xì)胞株HT29高潛能的自噬蛋白降解明顯減少，從而導(dǎo)致自噬活性增高。因此，我們認(rèn)為低/未分化的癌細(xì)胞表現(xiàn)出更大的自噬活力，通過蛋白降解使得腫瘤細(xì)胞在營養(yǎng)受限條件下得以存活。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bif-1在肝癌中是一個致癌基因而不是抑癌基因。然而，之前有研究[9］表明Bif-1在胰腺導(dǎo)管腺癌、大腸癌、前列腺癌、膀胱癌、膽囊癌以及胃癌中表達(dá)水平下降。這與我們在肝癌中的研究結(jié)果相悖，這一差異有待進(jìn)一步研究。我們認(rèn)為自我吞噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著種種病理生理學(xué)作用，其作用可能隨著腫瘤細(xì)胞類型和腫瘤組織環(huán)境差異而發(fā)生改變[10］。

總之，本研究表明Bif-1蛋白的表達(dá)可成為肝癌預(yù)后的一個新型標(biāo)志物。Bif-1過表達(dá)的肝癌患者腫瘤分級更差，生存時間更短。Bif-1的生物學(xué)作用還需要更多的研究闡明，以便于評估其在肝癌診斷與治療中的潛在價值。

[1]朱朋飛，秦建民. 細(xì)胞自噬在原發(fā)性肝癌發(fā)生與防治中的生物學(xué)作用[J］. 中國醫(yī)藥科學(xué)，2015，5（4）：24-28.

[2]王小剛，徐仁芳，徐海燕，等. Bif-1在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義[J］. 臨床泌尿外科雜志，2015，30（1）：11-13.

[3]王鑄，何霞，馮發(fā)深，等. Bif-1對前列腺癌LNCap細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J］. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2012，12（7）：781-784.

[4]Takahashi Y，Coppo la D，M atsushita N， et al. Bif-1 interacts with Beclin 1 through UVRAG and regulates autophagy and tum origenesis[J］. Nat Cell Bio l.，2007，9（10）: 1142-1151.

[5]Takahashi Y，Meyerkord CL，W ang HG. BAR gaining membranes for autophagosome formation: Regu lation of autophagy and tumorigenesis by Bif-1/Endophilin B1[J］. Autophagy，2008，4（1）: 121-124.

[6]王寵，張萍，朱衛(wèi)國. 細(xì)胞自噬與腫瘤發(fā)生的關(guān)系[J］. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2010，26（11）：988-997.

[7]李丁，張鵬. 細(xì)胞自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究進(jìn)展[J］. 山東醫(yī)藥，2015，55（45）：106-108.

[8]Ogier-Denis E，Blais A，Houri JJ，et al. The emergence of a basolateral 1-deoxymannojirimycin-sensitive mannose carrier is a function of intestinal epithelial cell differentiation. Evidence for a new inhibitory effect of 1-deoxymannojirimycin on facilitative mannose transport[J］. The Journal of biological chemistry，1994，269（6）：4285-4290.

[9]Florin Burada，Elena Raluca N icoli，M arius Eugen Ciurea，et al. Autophagy in colorectal cancer:An important switch from physiology to pathology[J］. W orld Journal of Gastrointestinal Oncology，2015，36（11）: 271-284.

[10]李國東，吳德全，李本義. 細(xì)胞自噬在腫瘤中作用的研究進(jìn)展[J］.癌癥，2009，28（4）：445-448.

The Correlation Studies of Bif-1 Overexpressed in Hepatocellular Carcinoma and Correlates With Shortened Patient Survival Time

FAN Rengen1ZHA Wenzhang1ZHOU Yong1QIN Cheng lin1SHAN Xiangxiang2ZHOU Jianping2WAN Xinqiang31 Genera l Surgery Department， First People's Hospital of Yancheng， Yancheng Jiangsu 224000， China， 2 Department of Geriatric Medicine， First People's Hospital of Yancheng， Yancheng Jiangsu 224000， China， 3 The Department of Clinical Medicine， Nantong University Medical School， Nantong Jiangsu 226019， China

Ob jective Bif-1 and Beclin1 interact with each other andaf ect the structure of autophagy bodies in the process of autophagy. The purpose of this study is to investigate the prognostic signif cance of Bif-1 expression and its correlation with prognostic parameters in other clinical and pathological parameters. Methods Immunohistochem ical method was used to study the expression of Bif-1 in 206 cases of hepatocellular carcinoma. Sem i quantitative determ ination of the immune response in the cy top lasm. And com bined with other clinical patho logical parameters， including the patient's survival. Chi square test and K-M survival analysis were used. Resu lts The expression level of Bif-1 in hepatocellular carcinoma cells w as significantly higher than that in adjacent tissues. The higher expression level of Bif-1 in liver cancer was signif cantly associated with low dif erentiation and short survival time. The expression level of Bif-1 was not signif cantly correlated with patient's age， gender， tumor size， capsule invasion， HBs-Ag expression and portal vein invasion. Conclusion The study indicates that Bif-1 is overexpressed in hepatocellular carcinoma. Over expression of Bif-1 is a new independent prognostic marker， and tumor dif erentiation was associated with a shorter overall survival.

Beclin1， Bif-1， Liver cancer， Survival time

R 735.7

A

1674-9308（2016）29-0037-04

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.29.021

1 江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院普外科，江蘇 鹽城 224000；2 江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，江蘇 鹽城 224000；3.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，江蘇 南通 226019