星點設計效應面法優(yōu)化海南霉素鈉固體分散體處方

趙才兵，李成梅，郭秀偉，高鵬，劉正光，劉波，鄒小軍，梁景樂

（1.山東勝利生物工程有限公司山東濟寧272100；2中牧實業(yè)股份有限公司北京100070）

星點設計效應面法優(yōu)化海南霉素鈉固體分散體處方

趙才兵1，李成梅1，郭秀偉1，高鵬1，劉正光1，劉波1，鄒小軍1，梁景樂2*

（1.山東勝利生物工程有限公司山東濟寧272100；2中牧實業(yè)股份有限公司北京100070）

目的：制備海南霉素鈉固體分散體。方法：以PEG4000、PEG6000、PVPK30為分散介質(zhì)，星點設計效應面法優(yōu)化處方。結(jié)果：以PEG4000、PEG6000、PVPK30和海南霉素鈉為自變量，固體分散體分散時間和沉降體積比為因變量的多元二次方程相關(guān)系數(shù)（R2）是0.8702和0.9076，響應面模型方差分析差異均極顯著（P＜0.01），對分散時間影響顯著的因素是PEG4000和PVPk30，對沉降體積比影響顯著的因素是PVPK30、PEG4000、PEG6000、PEG4000^2和PEG6000^2，優(yōu)化處方海南霉素鈉的含量均值是理論含量的99.07%。結(jié)論：通過星點設計效應面實現(xiàn)了海南霉素鈉固體分散體處方的優(yōu)化，選用固體分散體分散時間和沉降體積比為因變量提高了試驗效率，制備了海南霉素鈉新制劑。

海南霉素鈉；分散體；星點設計效應面

海南霉素鈉（Hainanmycin，C47H79O15Na）是國內(nèi)自主研發(fā)的聚醚類離子載體抗球蟲藥物，通過干擾球蟲體內(nèi)K+和Na+平衡，球蟲因滲透壓失衡及腫脹死亡［1］。主要用于雞球蟲病的防控，抗球蟲指數(shù)在170～196之間［2，3］。海南霉素鈉還能調(diào)節(jié)瘤胃功能，提高丙酸水平，抑制蛋白質(zhì)降解，明顯提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝，促進生長［4，5］。海南霉素不被消化道所吸收，安全性高，無組織殘留，無向可食性畜產(chǎn)品轉(zhuǎn)移的可能性。由于海南霉素鈉生產(chǎn)水平的提高，成本下降，正加速被市場接受。海南霉素鈉原料藥技術(shù)水平已經(jīng)國際領先，但制劑產(chǎn)品僅有1%海南霉素預混劑。固體分散體技術(shù)是改善難溶性藥物溶解性的主要途徑之一，通過改變藥物的分散狀態(tài)改善藥物的溶出速率，提高生物利用度［6，7］。星點設計響應面法是國內(nèi)外近年來集數(shù)學和統(tǒng)計學方法于一體的實驗設計方法，由二水平析因設計加軸點及中心點組成，與單因素實驗、正交設計和均勻設計等線性模型相比，具有精度高、預測性好、實驗次數(shù)較少等優(yōu)點［8-10］。本研究以分子分散技術(shù)為基礎，星點設計響應面法優(yōu)化處方，進行海南霉素鈉固體分散體的開發(fā)研究。

1　材料和儀器

海南霉素鈉（99.1%，山東勝利生物工程有限公司），海南霉素鈉標準品（99.4%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），聚乙二醇4000（PEG4000）、聚乙二醇6000（PEG6000）（國藥集團），聚維酮（PVP k30），無水乙醇（國藥集團），分析天平（賽多利斯），純凈水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，冰箱，粉碎機，藥典篩，多功能微生物自動測量分析儀（北京先驅(qū)），生化培養(yǎng)箱。

2　方法

2.1海南霉素鈉分散體制備

處方量的PEG4000、PEG6000，70～75℃熔化，攪拌15 min，處方量的PVP k30和海南霉素鈉溶于無水乙醇，獲得海南霉素鈉-PVPK30-乙醇溶液，滴加至PEG液體，加速攪拌至透明，-0.1Mpa，70～75℃旋蒸回收乙醇，海南霉素鈉-PEG-PVPk30液體固化8～12 h，粉碎。

2.2分散時間及沉降體積比

純化水50 mL加入塞量筒量，靜止，稱取海南霉素鈉分散體1.9 mg置于純化水表面，密塞，記錄純化水表面海南霉素鈉分散體被分散的時間（S），分散時間作為評價處方溶解性差異的指標之一。海南霉素鈉分散體被分散后，用力振搖1 min，記下混懸物的開始高度H0（mm），靜置3 h，記下混懸物的最終高度H（mm），沉降體積比=H/H0，沉降比應不低于0.90，沉降體積比作為評價懸液穩(wěn)定性主要指標及溶解差異參考指標。

2.3星點設計響應面法優(yōu)化處方

以PEG4000、PEG6000、PVPK30、Hainanmyci為自變量，分散時間（s）和沉降體積（H/H0）比為響應值，Design-Expert8.0.6.1生成多元二次方程、3D趨勢圖和高等線圖。

表1 星點設計因素及水平

2.4海南霉素鈉檢測

2.4.1試驗菌

枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501或CVCC7］，二劑量管碟法檢測樣品效價（中國獸藥典（2010版）附錄121頁抗生素微生物檢定法）。

2.4.2培養(yǎng)基配方

按配比稱取適量瓊脂粉于每個三角瓶中。按配比和體積稱取酵母浸粉、牛肉浸粉、蛋白胨、甘油于大燒杯中，加純化水適量，加熱溶解，攪拌均勻，加葡萄糖和純化水達到所需配制體積后，用6M NaOH溶液調(diào)pH值至7.7。

2.4.3標準品溶液制備

精密稱取標準品適量，置25 mL量瓶中，加入15 mL無水乙醇溶解后，用Tris-HCL緩沖液（pH7.1）定容，得1 000 u/mL的標準溶液，精密量取5 mL上述溶液至50 mL量瓶中，得100 u/mL的標準溶液，分別取2 mL上述溶液至100 mL和50 mL的容量瓶中，得2 u/mL和4 u/mL的溶液，作為點樣用溶液。

2.4.4供試品溶液的制備

取本品適量，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，每10 mg加無水乙醇6 mL，使溶解。加滅菌Tris-HCL緩沖液（pH7.1）稀釋成每1 mL中含1 000單位的溶液，再用滅菌Tris緩沖液（pH7.1）稀釋成濃度為每1 mL中含4.0和2.0單位的溶液。

3　結(jié)果

3.1星點設計及方差分析

依據(jù)星點設計效應面原理，依據(jù)表2，Design-Expert8.0.6.1生成多元二次方程，純化水表面海南霉素鈉分散體被分散的時間（t，min）相關(guān)系數(shù)R2=0.8702，沉降體積比相關(guān)系數(shù)R2=0.9076，說明該方程在設計劑量范圍內(nèi)能夠較好的表達自變量PEG4000、PEG6000、PVPK30、Hainanmyci與因變量分散時間（s）、沉降體積（H/H0）的量化關(guān)系。依據(jù)表3和表4，分散時間（t）響應面模型方差分析P=0. 0097＜0.01，差異極顯著，沉降體積比（H/H0）響應面模型方差分析P＜0.0001，差異極顯著，說明分散時間（t）和沉降體積比（H/H0）響應面模型具有較好代表性，試驗方法可靠。對分散時間（t）影響顯著的因素是 PEG4000和 PVPk30，PVPK30和 PEG4000、PEG6000交叉均有較大影響。對沉降體積比（H/H0）影 響 顯 著 的 是 PVPK30、PEG4000、PEG6000、PEG4000^2和PEG6000^2。

TIME=0.4667×PEG4000+1.1889×PEG6000+21.4167× PVPK30+1.2917× Hainanmycin-0.0039×PEG4000×PEG6000-0. 1833×PEG4000×PVPK30+0.0083×PEG4000× Hainanmycin-0. 1667×PEG6000×PVPK30-0.0500×PEG6000× Hainanmycin-0. 1875×PVPK30×Hainanmycin-0.0031×PEG4000^2-0.0064× PEG6000^2-0.1875×PVPK30^2+0.2031×Hainanmycin^2-8.5000；H/H0=1.0383-0.0020×PEG4000-0.0017×PEG6000+0.0158× PVPK30-0.0088×Hainanmycin+0.0001×PEG4000×Hainanmycin-0. 0002×PEG6000×PVPK30+0.0019× PVPK30^2+0.0005×Hainanmycin^2（R2=0.9076）。三維曲線圖1～4反映了影響因素的影響程度。

表2 星點設計及效應值

表3 分散時間（t）響應面模型方差分析

圖1:PEG4000和PVPK30對分散時間的三維曲線圖PEG6000=45. 81%、Hainanmycin=5.03%圖2:PEG6000和PVPK30對分散時間的三維曲線圖PEG4000=45. 00%、Hainanmycin=5.03%圖3:PEG4000和PEG6000對沉降體積比的三維曲線圖PVPK30=2. 00%、Hainanmycin=5.03%圖4:PEG6000和PVPK30對沉降體積比的三維曲線圖PEG4000 =45.00%、Hainanmycin=5.03%

表4 沉降體積比（H/H0）響應面模型方差分析

3.2處方優(yōu)化

PEG4000和PEG6000質(zhì)量分數(shù)取值10～70%，PVPk30質(zhì)量分數(shù)取值0～5%，海南霉素鈉含量固定為5%，分散體分散時間取值范圍為25～60 s，沉降體積比取0.95～1.00。通過Design-Expert8.0.6.1給出優(yōu)化配方，處方總質(zhì)量百分數(shù)接近100%，優(yōu)選處方3個。通過2.4法檢測，檢測優(yōu)化處方含量，見表5。

表5 響應面優(yōu)化處方預測值及真實值

4　討論

4.1分散體技術(shù)制備海南霉素鈉分散體

固體分散技術(shù)是將難溶性藥物與適宜載體制成固體分散體的一種技術(shù)。由于載體材料的抑晶作用，藥物以微晶態(tài)、無定型態(tài)、膠體分散態(tài)或分子分散態(tài)存在，具有很大的分散度［11，12］。固體分散技術(shù)的特點是提高難溶性藥物的溶出度，從而提高生物利用度。海南霉素鈉溶于甲醇和乙醇，不溶于水，通過制備的樣品檢測結(jié)果分析，固體分散體技術(shù)實現(xiàn)了海南霉素鈉的增溶。

4.2星點設計效應面法在分散體制備中的應用

星點設計（CCD）是一種新型的試驗設計方法，由二水平析因設計加軸點及中心點組成，是一種多因素五水平的試驗設計［13］。在統(tǒng)計學中，效應面法（RSM）探討了幾個解釋變量與一個或多個效應變量之間的關(guān)系。其主要思想是使用一個序列的設計實驗，用二次多項式模式以獲得最佳的效應。效應與因素之間的關(guān)系表現(xiàn)在效應面上，從效應面上可以讀取較佳工藝。線性的為平面，非線性的為曲面。在整個考察范圍內(nèi)，在靠近較佳區(qū)，非線性關(guān)系居多；愈遠離較佳區(qū)，面的彎曲度越接近線性。因此，星點實驗的復合相關(guān)系數(shù)較高，預測值更接近真實值，且實驗次數(shù)也較少，結(jié)果直觀。星點設計效應面法更簡化、試驗次數(shù)較少，試驗精度高，并適用于多因素、多水平的試驗［14，15］。制備海南霉素鈉分散體需要考察PEG4000、PEG6000、PVPk30和海南霉素鈉四個因素的影響，通過星點設計效應面法僅進行了25個組合，就充分證明重要的影響因素及其相互關(guān)系。方差分析數(shù)據(jù)顯示，模型代表性較強。優(yōu)化處方顯示，通過該法取得了理想的結(jié)果。

4.3星點設計效應面法制備海南霉素鈉分散體因變量的選擇

海南霉素鈉效價需要抗生素微生物檢定法，而抗生素微生物檢定法周期較長，培養(yǎng)皿需要量較大。本研究選用簡單易行的分散時間（t）和沉降體積比（H/H0）為初選因變量，處方優(yōu)化時相互參考，最后對優(yōu)化處方進行抗生素微生物檢定法檢測。優(yōu)化處方結(jié)果顯示，檢測結(jié)果接近于理論值，檢測均值為理論值的99.07%。為類似的研究提供了借鑒。■（編輯：趙曉松）

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Optimization of Hainanmycin Solid Dispersion by Central Composite Design and Response Surface Method

Zhao Caibing1，Li Chengmei1，Guo Xiuwei1，Gao Peng1，Liu Zhengguang1，Liu Bo1，Zou Xiaojun1，Liang Jingle2*
（1.China Animal Husbandry Industry Co.，LTD，Biological Science Institute，Shandong Shengli Bioengineering Co.，LTD，JiNingShanDong，272100；2.China Animal Husbandry Industry Co.，LTD，Beijing，100070）

Objective:To prepare Hainanmycin solid dispersion.Methods:PEG4000，PEG6000 and PVPK30 were used as mediums.The formulations of Hainanmycin solid dispersion were optimized by central composite design and response surface method.Results:Methods PEG4000，PEG6000，PVPK30 and Hainanmycin were independent variables.Dispersion time and sedimentation ratio were the dependent variables.The coefficient-correlation（R2）of the second-order polynomial equations in terms of actual values demonstrated the empirical relationships between the independent variables and the response were 0.8702 and 0.9076.the ANOVA of the empirical second-order polynomial model were significant（P＜0.01）.PEG4000 and PVPk30 were significant model terms to dispersion time.PVPK30、PEG4000、PEG6000、PEG4000^2and PEG6000^2 were significant model terms to sedimentation ratio.The average Hainanmycin content of optimized formulations was 99.07 percent of actual value.Conclusions Hainanmycin solid dispersion was optimized by central composite design and response surface method.The Study was simplified by dispersion time and sedimentation ratio as independent variables.A novel preparation of Hainanmycin was made.

Hainanmycin；Solid Dispersion；Central Composite Design and Response Surface Method

10.3969/j.issn.1008-4754.2016.10.046

趙才兵（1972-），男，農(nóng)學碩士，醫(yī)藥工程工程師，研究方向：藥物制劑；e-mail：1146875940@qq.com，Tel: 15963769867

梁景樂（1969-），男，理學博士，研究方向：醫(yī)藥工程，e-mail：1146875940@qq.com，Tel:0537-2317568。