Lactobacillus plantarum 163產(chǎn)細菌素食品級培養(yǎng)基篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

胡美忠，黨麗娟，陸兆新，*

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學院藥學院，貴州 銅仁 554300；2.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

Lactobacillus plantarum 163產(chǎn)細菌素食品級培養(yǎng)基篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

胡美忠1，2，黨麗娟2，陸兆新2，*

（1.銅仁職業(yè)技術(shù)學院藥學院，貴州 銅仁 554300；2.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

為獲得Lactobacillus plantarum 163最佳食品級培養(yǎng)基，首先篩選出Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基配方，即白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L，蒸餾水補足至1 L。Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選出Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基配方的關(guān)鍵因子，即接種量、K2HPO4添加量、pH值和大白菜汁添加量。通過Box-Behnken試驗構(gòu)建了Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基二次多項式模型，得到理想發(fā)酵條件，即K2HPO41.89 g/L、大白菜汁341.5 mL/L、接種量3.56%、pH 6.95，其抑菌活性比優(yōu)化前增加30%以上。

食品級培養(yǎng)基；優(yōu)化；響應面；植物乳桿菌163

胡美忠， 黨麗娟， 陸兆新. Lactobacillus plantarum 163產(chǎn)細菌素食品級培養(yǎng)基篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化［J］. 食品科學， 2016，37（15）: 165-170. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615028. http://www.spkx.net.cn

HU Meizhong， DANG Lijuan， LU Zhaoxin. Screening of food-based medium and optimization of fermentation conditions for bacteriocin production by Lactobacillus plantarum 163［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 165-170. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615028. http://www.spkx.net.cn

隨著社會進步，人們生活水平提高，人們對吃的要求概括為：健康、原生態(tài)和綠色，故現(xiàn)食品工業(yè)研究人員都在尋找天然安全的食品防腐劑借以制造綠色安全健康食品，而乳酸菌來源的食品添加劑研究是目前的一個熱點［1］。

Lactobacillus plantarum 163篩選自貴州銅仁產(chǎn)發(fā)酵白菜（大白菜），前期研究發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生兩種活性細菌素，且對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均有較好的抑制效果，具有作為生物防腐劑應用于食品防腐的潛力，然而之前的研究Lb. plantarum 163的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基（非食品級），其培養(yǎng)出來的發(fā)酵物不適合直接用于食品防腐［2-3］。

本實驗以Lb. plantarum 163發(fā)酵的MRS培養(yǎng)基為出發(fā)點，根據(jù)乳酸菌生長需要的氮源、碳源、無機鹽、生長因子和水，選取可直接食用或GB 2760—2011《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》明確規(guī)定可使用的成分［4］，以培養(yǎng)基配方組成簡單，培養(yǎng)基原料來源廣泛、價廉和細菌素產(chǎn)量高為前提［5-6］，設(shè)計篩選Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基，運用響應面法（response surface methodology，RSM）及回歸方程得到Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基組分配比。

1　材料與方法

1.1菌株、培養(yǎng)基與試劑

供試菌種：Lb. plantarum 163，從貴州省銅仁市酸白菜中分離純化并鑒定，現(xiàn)保藏于GCMGC 8224。指示菌：Bacillus pumilus CMCC 63202。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）；MRS培養(yǎng)基。

食品級培養(yǎng)基篩選配方編號及配方明細（各配方總體積1 L用蒸餾水補足，pH 6.5±0.2，白菜汁制備方法：大白菜（Chinese cabbage）洗凈后，切成小條，九陽榨汁機榨汁，得白菜汁，番茄汁同）。

1）白菜汁80 mL/L、番茄汁30 mL/L、乙酸鈉5 g/L、K2HPO42 g/L、酵母膏5 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.04 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L；2）白菜汁80 mL/L、番茄汁30 mL/L、乙酸鈉5 g/L、K2HPO42 g/L、酵母膏5 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.04 g/L；3）白菜汁80 mL/L、番茄汁30 mL/L、乙酸鈉5 g/L、K2HPO42 g/L、酵母膏5 g/L、硫酸鎂0.2 g/L；4）白菜汁80 mL/L、番茄汁30 mL/L、乙酸鈉5 g/L、K2HPO42 g/L、酵母膏5 g/L；5）白菜汁80 mL/L、番茄汁30 mL/L、酵母膏5 g/L；6）白菜汁80 mL/L、番茄汁30 mL/L；7）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、酵母膏5 g/L、K2HPO42 g/L、吐溫-80 1 mL/L；8）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、酵母膏5 g/L、K2HPO42 g/L；9）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、酵母膏5 g/L、吐溫-80 1 mL/L；10）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、吐溫-80 1 mL/L；11）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、酵母膏7.5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L、吐溫-80 0.5 mL/L；12）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、酵母膏7.5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L；13）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L、吐溫-80 0.5 mL/L；14）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L、吐溫-80 0.5 mL/L；15）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、蛋白胨10 g/L、K2HPO42 g/L、吐溫-80 0.5 mL/L；16）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、蛋白胨10 g/L、K2HPO42 g/L；17）白菜汁200 mL/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L；18）白菜汁200 mL/L、葡萄糖10 g/L；19）番茄汁50 mL/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L；20）番茄汁50 mL/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L；21）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L；22）白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、葡萄糖10 g/L；23）番茄汁50 mL/L、胡蘿卜汁100 mL/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L；24）番茄汁50 mL/L、胡蘿卜汁100 mL/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L。

1.2儀器與設(shè)備

YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠；SW-CJ-IBU超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；Orion 3 STAR pH計 美國Thermo公司；PYX-DHS-50X65 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；JYZ-F600九陽榨汁機 九陽股份有限公司。

1.3方法

1.3.1Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基篩選

Lb. plantarum 163菌株接種于MRS培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)14 h后，按照體積分數(shù)2%分別接種于1～24號篩選培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h后離心，得上清液，備用。

以短小芽孢桿菌（CMCC 63202）為指示菌（菌液OD600nm≈1，以液體培養(yǎng)基為對照），瓊脂擴散法檢測各篩選培養(yǎng)基發(fā)酵上清液的抑菌活性［2］，抑菌活性以抑菌圈直徑表示，結(jié)果取3 次平均值。

1.3.2Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基Plackett-Burman設(shè)計

從Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基篩選試驗選擇白菜汁、番茄汁、葡萄糖和K2HPO4為培養(yǎng)基成分的配方，Plackett-Burman試驗對此配方進行關(guān)鍵因子篩選，其中X1～X4為培養(yǎng)基配方組分，X5～X8為發(fā)酵條件，響應值為抑菌圈直徑，試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析采用JMP軟件（Version 9.0.2，SAS Institute Inc.），每組試驗設(shè)2 次重復，結(jié)果取平均值。

1.3.3Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基響應面設(shè)計

從Plackett-Burman試驗結(jié)果選擇接種量、K2HPO4添加量、pH值和大白菜汁添加量4 個因子，采用Box-Behnken試驗進行響應面法優(yōu)化［7-8］，以期獲得影響該菌株發(fā)酵產(chǎn)細菌素的最佳培養(yǎng)基組成以及外部發(fā)酵條件，試驗設(shè)計及分析采用Design-Expert（Version 8.05b）軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基篩選

從MRS培養(yǎng)基出發(fā)，以培養(yǎng)基配方組成簡單，培養(yǎng)基成分安全易得、價廉，代謝產(chǎn)生的細菌素產(chǎn)量高為前提，設(shè)計了24 種篩選用培養(yǎng)基。結(jié)果見表1。培養(yǎng)36 h后，這24 種發(fā)酵液均出現(xiàn)乳白色絮狀物質(zhì)，表明培養(yǎng)基中有菌體產(chǎn)生；36 h后24 種培養(yǎng)基發(fā)酵液pH值在3.7～4.0之間，表明在發(fā)酵過程中，菌體代謝產(chǎn)生大量的有機酸。然而抑菌實驗顯示，這24 種培養(yǎng)基發(fā)酵液僅僅只有17～24號培養(yǎng)基產(chǎn)生抑菌圈，這表明Lb. plantarum 163雖然能在1～16號培養(yǎng)基中生長，但是并不能產(chǎn)生細菌素。

比較1～24號培養(yǎng)基可發(fā)現(xiàn)，1～10號培養(yǎng)基無葡萄糖，17～24號含葡萄糖，這可能是葡萄糖的代謝是合成細菌素的必要條件，有類似葡萄糖是某一代謝過程的關(guān)鍵因子［9-10］。而11～16號（除12號）培養(yǎng)基含有葡萄糖但是不表現(xiàn)抑菌活性，但是含有吐溫-80。吐溫-80是混濁劑，有利于細菌擴散，但是在某些場合下也會影響細菌素的產(chǎn)量［11］，12號培養(yǎng)基含有葡萄糖、不含有吐溫-80，但是也沒有表現(xiàn)抑菌活性，但是12號培養(yǎng)基其他組分如酵母膏、蛋白胨等含量較高，不產(chǎn)細菌素可能是因為培養(yǎng)基營養(yǎng)過于豐富有關(guān)，因為細菌素的產(chǎn)生與細菌周圍營養(yǎng)情況關(guān)系密切。

17～24號培養(yǎng)基均有抑菌效果，其中17、18、21、23號培養(yǎng)基抑菌效果較好，綜合比較，21號培養(yǎng)基配方最為簡單，抑菌效果也較好，故選擇21號（白菜汁200 mL/L、番茄汁50 mL/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO42 g/L）培養(yǎng)基作為后續(xù)發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基。

表1　Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基的篩選Table 1 Screening of food-based medium for Lb. plantarum 163

2.2Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基Plackett-Burman設(shè)計

Plackett-Burman試驗的設(shè)計方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。P＜0.000 1，表明該篩選模型極顯著。根據(jù)表4顯著性分析可知，影響Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基產(chǎn)細菌素的主要因素是：接種量、K2HPO4添加量、pH值、大白菜汁添加量和培養(yǎng)溫度，它們對抑菌圈大小具有極顯著影響（P＜0.000 1）。其中培養(yǎng)溫度與抑菌圈直徑成負相關(guān)，即培養(yǎng)溫度越高，抑菌圈直徑越少，另外從能耗上來看，培養(yǎng)溫度越低，有利于降低能耗，故選擇較低的溫度不但有利于提升細菌素產(chǎn)量，且有利于降低生產(chǎn)成本，但是前期的實驗發(fā)現(xiàn)，Lb. plantarum 163培養(yǎng)溫度低于30 ℃，則菌體生長緩慢，如果選擇30 ℃以下溫度培養(yǎng)Lb. plantarum 163耗時，故綜合考慮，培養(yǎng)溫度不作為關(guān)鍵因子考察，培養(yǎng)溫度設(shè)定于30 ℃。其余因素根據(jù)Plackett-Burman試驗設(shè)計原理皆選定為低水平進行后續(xù)響應面試驗。

表2　Plackett-Burrmmaann試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Plackett-Burman design with experimental results

表3　Plackett-Burman方差分析Table 3 Analysis of variance of Plackett-Burman design

表4　Plackett-Burman試驗回歸系數(shù)及顯著性檢驗Table 4 Regression coefficients and significance of Plackett-Burman design

2.2Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基響應面設(shè)計

2.2.1預測模型及回歸方程建立分析

從Plackett-Burman試驗結(jié)果分析基礎(chǔ)上，進行響應面設(shè)計，響應面采用Box-Behnken對各個關(guān)鍵因子進行進一步優(yōu)化，得到其回歸方程為：

試驗響應值及預測值見表5。方差分析及顯著性見表6。方差分析可知，模型F值為18.327 4，P＜0.000 1，模型顯著，失擬項F值為34.637 8，P= 0.131 5，失擬項不顯著。校正決定系數(shù)，變異系數(shù)為4.874 3%，說明該模型擬合性比較好，可以采用此模型（回歸方程）代替實驗真實點對響應值進行相關(guān)預測。

回歸方程回歸系數(shù)顯著性檢驗表明（表6）：一次項系數(shù)B和D的P值均＜0.000 1，表明線性影響效應中B（白菜汁添加量）和D（pH值）對Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基細菌素產(chǎn)量效應顯著，而A（K2HPO4添加量）和C（接種量）對Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基細菌素產(chǎn)量效應不顯著。二次項系數(shù)A2、B2、C2和D2的P值均＜0.01，說明多個具體的試驗因子對響應值的影響變化相對復雜，曲面效應顯著，交互項BC和BD交互效應P＜0.05，效應顯著，其他兩兩交互效應不顯著。

經(jīng)過響應面優(yōu)化，可分析得到Lb. plantarum 163最佳食品級培養(yǎng)基配方為：K2HPO41.89 g/L、大白菜汁341.5 mL/L、接種量3.56%、pH 6.95。為驗證Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基產(chǎn)細菌素的模型方程的有效性，在實驗范圍內(nèi)選取最優(yōu)發(fā)酵條件及相近的培養(yǎng)條件共5 組進行實際驗證實驗，結(jié)果見表7，所得抑菌圈直徑（抑菌活性）與模型預測值非常接近，說明該模型是合適有效的。

表5　Box-Behnken設(shè)計方案及抑菌活性實際值和預測值Table 5 Box-Behnken design （BBD） with actual and predicted values of antimicrobal activity

表6　Box-Behnken試驗方差分析及顯著性檢驗Table 6 Analysis of variance and significance test of BBD

表7　抑菌活性模型驗證實驗Table 7 Model validation experiments for antimicrobal activity

3　討 論

防腐劑可分為化學防腐劑和天然防腐劑，而化學防腐劑可能存在誘癌性、致畸性和易引起食物中毒等問題［12-13］，近年來使用受到限制，而天然防腐劑則因為其安全的特性正在逐步取代化學防腐劑?？梢姡踩煽渴欠栏瘎┻x擇的一個重要前提。

少部分乳酸菌會在代謝過程中分泌一種具有廣譜抑菌作用的活性多肽-細菌素，而人類利用乳酸菌及發(fā)酵產(chǎn)物有幾千年歷史［14-15］，現(xiàn)在廣泛應用于食品制造，保健食品生產(chǎn)等方面［16］，故由乳酸菌分泌產(chǎn)生的細菌素應用于食品防腐安全可行，本研究的Lb. plantarum 163產(chǎn)生的兩種活性多肽就有應用于食品防腐的潛力。Lb. plantarum 163是植物乳桿菌，屬于乳酸菌，來源安全，其代謝產(chǎn)物也安全［17］，然而前期的研究，Lb. plantarum 163發(fā)酵培養(yǎng)基是MRS培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基是實驗室用培養(yǎng)基，其所含成分不符合安全的范疇，故要利用Lb. plantarum 163的發(fā)酵產(chǎn)物應用于食品防腐，需要篩選出食品級的培養(yǎng)基。

食品級培養(yǎng)基的篩選，除了考慮安全，即所有成分均符合國家標準GB 2760—2011明確規(guī)定可使用的范圍外［4］，也需要考慮生產(chǎn)的實際成本，即原料價廉，培養(yǎng)基組成簡單。本研究的食品級培養(yǎng)基篩選就是基于這幾點出發(fā)，篩選出Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基。

Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)細菌素，產(chǎn)量自然是一個重要的考慮條件，本研究首先利用Plackett-Burman試驗對篩選出來的食品級發(fā)酵培養(yǎng)基關(guān)鍵因子進行篩選，然后利用Box-Behnken響應面對各個關(guān)鍵因子進行優(yōu)化，得到Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基各組分的優(yōu)化配方，最后利用驗證實驗驗證模型的可靠性，最終結(jié)果顯示，模型是可靠的。

Plackett-Burman是一種經(jīng)濟高效的二水平試驗設(shè)計方法，可以在大量減輕工作量的前提下得到所需的試驗要求，現(xiàn)在廣泛應用于各種工藝優(yōu)化研究［18-19］。如利用Plackett-Burman設(shè)計法篩選出影響假絲酵母HZ19生物量的重要影響因子［20］，利用Plackett-Burman試驗設(shè)計確定了8 種碳源、8 種氮源和6 種無機鹽對Bacillus malacitensis Z-5菌株芽孢產(chǎn)量的影響［21］。

響應面法是一種高效的培養(yǎng)基優(yōu)化方法，可同時評估影響產(chǎn)量的各因素及相互關(guān)系［22-23］。Ben Belgacem等［24］考察了pH值和溫度對3 種細菌素的穩(wěn)定性，Kaur等［25］使用響應面法優(yōu)化Pediocin BA28的培養(yǎng)基，提高了Pediocin BA28的產(chǎn)量。

Lb. plantarum 163食品級培養(yǎng)基（21號培養(yǎng)基）經(jīng)過優(yōu)化后（K2HPO41.89 g/L、大白菜汁 341.5 mL/L、接種量3.56%、pH值為6.95）其抑菌活性相對于未優(yōu)化前提升30%以上，效果顯著。

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Screening of Food-Based Medium and Optimization of Fermentation Conditions for Bacteriocin Production by Lactobacillus plantarum 163

HU Meizhong1，2， DANG Lijuan2， LU Zhaoxin2，*
（1. Department of Pharmacy， Tongren Polytechnic College， Tongren 554300， China；2. College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

The intention of the current work was to obtain the optimal food-based medium and culture conditions for bacteriocin production by Lactobacillus plantarum 163. The appropriate medium （1 L） containing 200 mL of cabbage juice， 50 mL of tomato juice， 10 g of glucose， and 2 g of K2HPO4in distilled water was selected for further optimization. Inoculum concentration， K2HPO4，pH and cabbage juice were determined to be the key factors the influence bacteriocin production by using Plackett-Burman design. A quadratic polynomial model for describing the effects of the four factors on bacteriocin activity against Bacillus pumilus CMCC 63202 was obtained by Box-Behnken design. The optimal levels of these factors were found to be K2HPO41.89 g/L， cabbage juice 341.5 mL/L， inoculum concentration 3.56% （V/V） and pH 6.95. Under these conditions， the maximum antimicrobial activity was achieved， which was over 30% higher than that before optimization.

food-based medium； optimization； response surface methodology； Lactobacillus plantarum 163

10.7506/spkx1002-6630-201615028

TS201.3

A

1002-6630（2016）15-0165-06

2015-09-22

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD23B05）

胡美忠（1981—），男，副教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：42554573@qq.com

陸兆新（1957—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：fmb@njau.edu.cn

引文格式：