類植物乳桿菌L-ZS9生物被膜態(tài)的黏附能力及形成影響因素

劉 蕾，武瑞赟，2，李 軍，李平蘭，*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

類植物乳桿菌L-ZS9生物被膜態(tài)的黏附能力及形成影響因素

劉 蕾1，武瑞赟1，2，李 軍1，李平蘭1，*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

旨在探究生物被膜態(tài)類植物乳桿菌L-ZS9的黏附能力，并確定影響其形成的主要因素。通過體外黏附實(shí)驗(yàn)，比較L-ZS9浮游與生物被膜兩種狀態(tài)下的黏附能力。結(jié)果表明，被膜態(tài)L-ZS9黏附率為浮游態(tài)的1.5 倍，且黏附相關(guān)基因fbb、ropN和rrf2均上調(diào)表達(dá)，顯示了被膜態(tài)的黏附優(yōu)勢(shì)。采用結(jié)晶紫染色法考察了培養(yǎng)時(shí)間、溫度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、蛋白酶、群體感應(yīng)自誘導(dǎo)信號(hào)分子（autoinducer-2，AI-2）對(duì)L-ZS9被膜形成的影響。結(jié)果顯示，L-ZS9于37 ℃培養(yǎng)36 h被膜形成量最多，維持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足有利于被膜的形成，各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在不同階段發(fā)揮不同作用；低pH值和膽鹽會(huì)破壞已經(jīng)形成的生物被膜；胃蛋白酶和胰蛋白酶不僅抑制初始被膜的形成，且可以破壞成熟的被膜；體積分?jǐn)?shù)0.5%的信號(hào)分子AI-2對(duì)被膜形成的促進(jìn)作用最強(qiáng)，并可緩解胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用。

類植物乳桿菌L-ZS9；黏附；生物被膜；影響因素；信號(hào)分子AI-2

劉蕾， 武瑞赟， 李軍， 等. 類植物乳桿菌L-ZS9生物被膜態(tài)的黏附能力及形成影響因素［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 136-143.

LIU Lei， WU Ruiyun， LI Jun， et al. Adhesion ability of Lactobacillus paraplantarum L-ZS9 and influencing factors of its biofilm formation［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 136-143. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615023. http://www.spkx.net.cn

隨著人們生活水平不斷提高，許多嚴(yán)重的健康問題開始涌現(xiàn)，如心臟病、高血壓、腸道紊亂和各種癌癥。近年來的研究發(fā)現(xiàn)避免或消除這些疾病的一個(gè)新方法就是攝入益生菌［1］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）對(duì)益生菌的定義，益生菌是一類活性微生物，達(dá)到足夠數(shù)量時(shí)可以對(duì)宿主產(chǎn)生有利的作用。目前研究表明益生菌具有抵抗胃腸道感染，改善乳糖代謝，降低膽固醇，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，緩解腹瀉，改善骨質(zhì)疏松等諸多益生功效［2-4］。然而，益生菌發(fā)揮益生功效的一個(gè)重要前提是需黏附定殖于胃腸道中，且黏附是定殖的先決條件。因此，研究如何增強(qiáng)益生菌的黏附能力具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，除了海洋中的細(xì)菌，大多數(shù)細(xì)菌都存在于生物或非生物表面，而非流體懸浮液環(huán)境［5］。細(xì)菌在生物或非生物表面，常常會(huì)形成生物被膜，以多細(xì)菌組成的群體形態(tài)生存。胃腸道中的微生物若要存活，也需要附著在胃腸道黏膜表面。研究表明細(xì)菌在生物被膜態(tài)比其浮游狀態(tài)時(shí)具有更強(qiáng)的抵抗不良環(huán)境因素的能力［6-7］，而且生物被膜的形成能力和黏附能力之間存在著緊密關(guān)系。但是關(guān)于益生菌被膜態(tài)與浮游態(tài)黏附能力的比較研究還非常缺乏。生物被膜雖然具有更強(qiáng)的抵抗能力，但是其形成也受到許多因素的影響［8］。目前大多數(shù)研究集中在如何清除有害微生物的生物被膜，而對(duì)如何增強(qiáng)有益微生物生物被膜的研究還很匱乏。

本研究選擇一株類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum）L-ZS9為研究對(duì)象，該菌可產(chǎn)生多種細(xì)菌素，可有效抑制腸桿菌科微生物的生長(zhǎng)［9-10］，具有開發(fā)成優(yōu)良益生菌制劑或食品益生菌添加劑的潛力。本實(shí)驗(yàn)通過比較L. paraplantarum L-ZS9生物被膜及浮游態(tài)細(xì)胞的黏附能力及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，確定生物被膜態(tài)細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)；對(duì)生物被膜形成影響因素進(jìn)行測(cè)定，且檢測(cè)了群體感應(yīng)系統(tǒng)通用信號(hào)分子自誘導(dǎo)物（autoinducer-2，AI-2）對(duì)生物被膜的影響，為進(jìn)一步研究增強(qiáng)益生菌黏附及生物被膜形成能力從而開發(fā)效果更好的益生菌功能食品提供新思路和理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與細(xì)胞

類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum）L-ZS9分離自比利時(shí)發(fā)酵肉Saucisson Sec Pur，現(xiàn)保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心（CICC 6262）和中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC 11669）。該菌株的全基因組序列已遞交，GenBank登錄號(hào)為CP013130［11］。

HT-29細(xì)胞，即人結(jié)腸癌細(xì)胞，購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.1.2試劑

商品化AI-2（3.78 mmol/L，分裝于細(xì)胞凍存管中置于-80 ℃待用） 美國(guó)OMM公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒TUREscript 1stStrand cDNA Synthesis Kit和TRIpure北京艾德萊生物科技有限公司；DNase I（RNase-free）及RNase抑制劑 美國(guó)Thermo公司；SYBGreen 美國(guó)ABI公司；胃蛋白酶和胰蛋白酶 美國(guó)Sigma公司。

1.1.3培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、檸檬酸二銨2 g/L、葡萄糖20 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、肉浸膏10 g/L、K2HPO42 g/L、乙酸鈉5 g/L、吐溫-80 1 mL/L、MnSO4·4H2O 0.25 g/L。

細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培養(yǎng)基，含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL和體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清。

1.2方法

1.2.1浮游態(tài)和生物被膜態(tài)細(xì)菌制備

將活化的L. paraplantarum L-ZS9接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后，5 000 r/min離心10 min收集菌體，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3 次，之后PBS重懸菌體至終濃度1×108CFU/mL，此為浮游態(tài)細(xì)菌。將活化的L. paraplantarum L-ZS9接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h，之后重懸菌體并收集于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS洗滌菌體，并重懸至終濃度1×108CFU/mL，此為生物被膜態(tài)細(xì)菌。

1.2.2浮游態(tài)和生物被膜態(tài)細(xì)胞對(duì)HT-29細(xì)胞黏附率的測(cè)定

將HT-29細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其長(zhǎng)滿單層后（每孔約含2.5×105個(gè)細(xì)胞），每孔接種100 μL上述收集的浮游態(tài)及生物被膜態(tài)細(xì)菌懸液，輕微晃勻后置于37 ℃培養(yǎng)1.5 h，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌5 次，加100 μL的0.1 g/100 mL胰酶-0.02 g/100 mL乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）室溫處理10 min，消化細(xì)胞，再加900 μL DMEM，并用巴氏吸管吹打，取100 μL混合液進(jìn)行10 倍稀釋，各稀釋度取100 μL接種于MRS平板，37 ℃培養(yǎng)，記錄菌落數(shù)，計(jì)算黏附率。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3 個(gè)平行，且進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.3浮游態(tài)和生物被膜態(tài)細(xì)胞黏附相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定

按上述方法收集浮游態(tài)和生物被膜態(tài)細(xì)菌，按照北京艾德萊生物科技有限公司的TRIpure提取總RNA步驟分別提取兩者總RNA。cDNA的合成參照該公司TUREscript 1stStrand cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行，方法如下：Total RNA 50～5 000 ng，Random Primer 1 μL，5×RT Reaction Mix 4 μL，TUREscript H-RTase 1 μL，之后用RNase free H2O 定容至20 μL。25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育30～50 min，65 ℃加熱15 min失活TUREscript H-RTase。合成的cDNA經(jīng)DNase I處理后置于-80 ℃待用。

參照L. paraplantarum L-ZS9全基因組序列，選取與黏附相關(guān)的基因fbb、ropN和rrf2，以16S rDNA為內(nèi)參基因，運(yùn)用Primer 3 Input（version0.4.0）設(shè)計(jì)引物，用于進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time-quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR），引物序列見表1。

表1　引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers used in this study

qRT-PCR的反應(yīng)體系（20 μL）如下：1 μL cDNA，10 μL 2×SYBGreen，上游引物和下游引物各1 μL（10 μmol/L），加7 μL無RNase水。反應(yīng)體系如下：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用Livak法［12］測(cè)定。

1.2.4培養(yǎng)時(shí)間和溫度對(duì)生物被膜的影響

將L. paraplantarum L-ZS9接種于MRS培養(yǎng)基中，置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃靜置培養(yǎng)12、24、36、48、72 h和1 周，MRS空白培養(yǎng)基作為對(duì)照。培養(yǎng)結(jié)束后，采用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)OD595nm值，分析培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生物被膜形成的影響。

將菌種接種于MRS培養(yǎng)基中，于25、37 ℃和42 ℃靜置培養(yǎng)，每隔3 h檢測(cè)OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)不同培養(yǎng)溫度對(duì)L-ZS9生長(zhǎng)速率的影響。之后，將實(shí)驗(yàn)用菌種接種于MRS培養(yǎng)基置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于25、37 ℃和42 ℃靜置培養(yǎng)36 h，培養(yǎng)結(jié)束后采用結(jié)晶紫染色法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)培養(yǎng)溫度對(duì)生物被膜形成的影響。

1.2.5營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)生物被膜的影響

將L. paraplantarum L-ZS9接種于MRS培養(yǎng)基中，置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃靜置培養(yǎng)36、48、72 h和1 周，每24 h添加新鮮的MRS培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后采用結(jié)晶紫染色法對(duì)生物被膜進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足時(shí)生物被膜的形成情況。

將L. paraplantarum L-ZS9分別接種于不含葡萄糖、MnSO4、MgSO4、乙酸鈉、K2HPO4、吐溫-80的MRS培養(yǎng)基中，置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)24、36、48 h檢測(cè)MRS培養(yǎng)基中不同物質(zhì)對(duì)L-ZS9生物被膜形成的影響。此外，將MRS中的葡萄糖以乳糖、半乳糖和蔗糖替代，對(duì)L-ZS9進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，分別檢測(cè)不同碳源對(duì)生物被膜形成的影響。

1.2.6pH值、膽鹽和滲透壓對(duì)生物被膜的影響

將L. paraplantarum L-ZS9接種于MRS中，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h，使其形成成熟的生物被膜，吸出培養(yǎng)上清液，分別添加pH 2.0、3.0、4.0、5.0，含有0.1、0.2 g/100 mL膽鹽以及0.3 mol/L NaCl的MRS，培養(yǎng)12 h后采用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)pH值、膽鹽及滲透壓對(duì)成熟生物被膜的影響。

1.2.7胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)生物被膜的影響

將L. paraplantarum L-ZS9分別接種于含有2 g/100 mL胃蛋白酶和胰蛋白酶的MRS培養(yǎng)基中，每隔3 h測(cè)定OD600nm值，繪制生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)L-ZS9生長(zhǎng)的影響。將接種的菌液置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃靜置培養(yǎng)12、24、36 h和48 h，檢測(cè)胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)生物被膜形成的影響。將L-ZS9接種于MRS中，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h，使其形成成熟的生物被膜，之后分別添加2 g/100 mL的胃蛋白酶和胰蛋白酶，培養(yǎng)12 h后檢測(cè)胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)成熟生物被膜的影響。

1.2.8群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2對(duì)生物被膜的影響

將L. paraplantarum L-ZS9接種于含有商品化AI-2（0%、0.1%、0.5%、1%、5%）的MRS培養(yǎng)基中，置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束后檢測(cè)生物被膜，分析AI-2對(duì)L-ZS9生物被膜形成的影響。

將L. paraplantarum L-ZS9分別接種于含有0.5% AI-2和2 g/100 mL胃蛋白酶，含有0.5% AI-2和2 g/100 mL胰蛋白酶，僅含有2 g/100 mL胃蛋白酶，僅含有2 g/100 mL胰蛋白酶的MRS培養(yǎng)基中，置于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h后測(cè)定生物被膜。

將L. paraplantarum L-ZS9接種于MRS中，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h，使其形成成熟的生物被膜，之后分別添加2 g/100 mL胃蛋白酶，2 g/100 mL胰蛋白酶，0.5% AI-2及2 g/100 mL胃蛋白酶，0.5% AI-2及2 g/100 mL胰蛋白酶，培養(yǎng)12 h后檢測(cè)生物被膜形成量。

1.3數(shù)據(jù)分析

所有測(cè)試重復(fù)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)3 次，用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1浮游態(tài)和生物被膜態(tài)細(xì)胞黏附性能比較

2.1.1浮游態(tài)和生物被膜態(tài)細(xì)胞對(duì)HT-29黏附率的比較將浮游態(tài)及生物被膜態(tài)L-ZS9對(duì)HT-29細(xì)胞進(jìn)行黏附，結(jié)果如圖1所示，被膜態(tài)細(xì)菌對(duì)HT-29的黏附率為浮游態(tài)細(xì)菌的1.5 倍，這表明生物被膜態(tài)細(xì)菌的黏附性能更強(qiáng)。對(duì)于益生菌，能夠黏附到腸黏膜表面是其發(fā)揮益生作用的重要前提之一，只有能夠進(jìn)行黏附才有可能定殖在胃腸道中。關(guān)于益生菌生物被膜的相關(guān)研究還較少，如Cheow等［13］于2013年報(bào)道稱高密度生物被膜狀態(tài)的鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）比其浮游狀態(tài)時(shí)具有更好的耐熱性及耐冷凍干燥的能力。但是關(guān)于被膜態(tài)益生菌的黏附性能的研究還未見報(bào)道，因此，以上數(shù)據(jù)表明被膜態(tài)的L. paraplantarum L-ZS9具有更好的黏附性能，提示制備被膜態(tài)益生菌制劑及促進(jìn)益生菌在腸道中形成生物被膜有利于益生菌更好地定殖于胃腸道中，從而發(fā)揮其益生功效。此外，多數(shù)細(xì)菌在自然環(huán)境中之所以選擇以生物被膜狀態(tài)生存，主要是由于無論單菌種生物被膜，還是多菌種復(fù)雜生物被膜均具有浮游狀態(tài)時(shí)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，且被膜態(tài)的細(xì)菌可啟動(dòng)一系列基因的表達(dá)來協(xié)調(diào)其群體性行為［14］。

圖1　浮游態(tài)及生物被膜態(tài)L-ZS9黏附能力Fig. 1 Adhesion abilities of planktonic and biofilm cells of L-ZS9

2.1.2浮游態(tài)和生物被膜態(tài)細(xì)胞黏附相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的比較

圖2　浮游態(tài)及生物被膜態(tài)L-ZS9相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平差異比較Fig. 2 Related genes transcription levels in planktonic and biofilm cells of L-ZS9

由2.1.1節(jié)可知L-ZS9被膜態(tài)細(xì)胞的黏附能力高于浮游態(tài)細(xì)胞，本研究通過qRT-PCR檢測(cè)了浮游態(tài)和被膜態(tài)L-ZS9黏附相關(guān)基因（fbb、ropN和rrf2）的轉(zhuǎn)錄水平。fbb為纖黏蛋白編碼基因，參與細(xì)胞的黏附作用。ropN和rrf2基因與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性相關(guān)，從而間接影響細(xì)菌的黏附性。圖2顯示，生物被膜態(tài)細(xì)胞的fbb、ropN和rrf2的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于浮游態(tài)細(xì)胞，其中fbb和ropN轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)大于1.5 倍，而rrf2的轉(zhuǎn)錄水平則超過2 倍。以上結(jié)果表明浮游態(tài)與被膜態(tài)細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上也存在差異，被膜態(tài)細(xì)胞fbb基因上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)黏附作用；ropN和rrf2也上調(diào)表達(dá)，運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，可能以此來抵抗外界流體的沖刷作用，增強(qiáng)與腸黏膜的作用，從而促進(jìn)其黏附。

2.2培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)生物被膜形成的影響

2.2.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生物被膜形成的影響

圖3　培養(yǎng)時(shí)間（A）及培養(yǎng)溫度（B）對(duì)L-ZS9生長(zhǎng)、產(chǎn)酸（CC）及生物被膜（DD）的影響Fig. 3 Effects of cultivation time （A） and temperature on the growth （B），pH （C） and biofilm formation （D） of L-ZS9

基于2.1節(jié)中生物被膜態(tài)細(xì)胞在黏附性方面所具有的優(yōu)越性，本研究對(duì)L-ZS9生物被膜形成的各項(xiàng)因素進(jìn)行了檢測(cè)，以明確該菌株生物被膜形成的促進(jìn)因素和抑制因素。圖3A顯示，L-ZS9在36 h形成生物被膜的量最多，在36 h之前，生物被膜生成量逐漸增多，36 h之后生成量開始下降，這可能是由于周圍環(huán)境營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，導(dǎo)致生物被膜的逐漸脫落。與本研究結(jié)果類似，對(duì)于L. monocytogenes而言，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至平臺(tái)期后期時(shí)生物被膜形成量也最多［15］。

2.2.2培養(yǎng)溫度對(duì)生物被膜形成的影響

不同培養(yǎng)溫度下L-ZS9的生長(zhǎng)曲線及pH值曲線表明，42 ℃時(shí)該菌株不能生長(zhǎng)，37 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快，但是當(dāng)培養(yǎng)36 h時(shí)，25 ℃和37 ℃的OD600nm值及pH值達(dá)到一致（圖3B和3C）。圖3D顯示，在25 ℃和37 ℃培養(yǎng)36 h后，菌株生物被膜的生成量沒有差異，表明由培養(yǎng)溫度引起的生長(zhǎng)速率差異對(duì)生物被膜生成量沒有影響。但是，培養(yǎng)溫度引起的生長(zhǎng)速率差異對(duì)生物被膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響還需進(jìn)一步深入研究。

2.3營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)生物被膜形成的影響

2.3.1營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足對(duì)生物被膜形成的影響

由2.2.1節(jié)可知，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)一定時(shí)，L-ZS9在36 h時(shí)形成的生物被膜量最多。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足時(shí)L-ZS9生物被膜的形成情況。本實(shí)驗(yàn)每隔24 h添加新的MRS培養(yǎng)基，圖4表明培養(yǎng)36 h和48 h時(shí)，是否添加新的培養(yǎng)基對(duì)生物被膜形成量沒有影響，這可能是由于此時(shí)剩余的營(yíng)養(yǎng)條件仍相對(duì)充足；培養(yǎng)72 h和168 h（1 周）時(shí)，添加新鮮培養(yǎng)基的處理組生物被膜生成量顯著高于不添加培養(yǎng)基的對(duì)照組，這是由于營(yíng)養(yǎng)條件的充足使得生物被膜的脫落減緩。對(duì)于生長(zhǎng)在不同基質(zhì)表面的菌體，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足程度對(duì)其生物被膜形成的影響不同，這取決于不同營(yíng)養(yǎng)條件時(shí)微生物以生物被膜形態(tài)存在是否有利于群體生存［16］。本研究結(jié)果表明，當(dāng)類植物乳桿菌L-ZS9附著在非生物基質(zhì)表面時(shí)，及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以維持營(yíng)養(yǎng)充足有利于生物被膜的形成。

圖4　添加新鮮培養(yǎng)基對(duì)L-ZS9生物被膜的影響Fig. 4 Effect of fresh medium on biofilm formation of L-ZS9

2.3.2不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及碳源對(duì)生物被膜形成的影響

為了進(jìn)一步了解不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)L-ZS9生物被膜形成的影響，本實(shí)驗(yàn)按照1.2.5節(jié)中的方法對(duì)其進(jìn)行了測(cè)定。圖5A和5B顯示，碳源顯著影響L-ZS9的生長(zhǎng)：無碳源時(shí)L-ZS9無法生長(zhǎng)，碳源為葡萄糖或蔗糖時(shí)，L-ZS9生長(zhǎng)良好，且生長(zhǎng)速率無顯著差異，碳源為乳糖和半乳糖時(shí)，L-ZS9的生長(zhǎng)速率減慢；其余物質(zhì)對(duì)L-ZS9的生長(zhǎng)沒有顯著影響。生物被膜檢測(cè)結(jié)果如圖5C、D、E所示，培養(yǎng)24 h時(shí)，缺乏MgSO4、乙酸鈉、吐溫-80可以促進(jìn)生物被膜的形成，缺乏MnSO4降低生物被膜的形成（圖5C）；培養(yǎng)36 h時(shí)，缺乏MgSO4、乙酸鈉、吐溫-80對(duì)生物被膜形成沒有顯著影響，缺乏MnSO4降低生物被膜的形成（圖5D）；培養(yǎng)48 h時(shí)，缺乏MgSO4、乙酸鈉、吐溫-80、MnSO4對(duì)生物被膜的形成沒有顯著影響（圖5E）；缺乏K2HPO4在以上培養(yǎng)時(shí)間時(shí)對(duì)生物被膜形成皆沒有顯著影響。值得注意的是，在培養(yǎng)24 h時(shí)，蔗糖為碳源可以顯著促進(jìn)生物被膜的形成，這說明蔗糖在L-ZS9生物被膜形成早期具有促進(jìn)作用。以上結(jié)果表明，不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在不同的培養(yǎng)時(shí)間及生物被膜形成發(fā)展階段發(fā)揮著不同的作用。

圖5　不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)L-ZS9生長(zhǎng)（A）、產(chǎn)酸（B）及在不同時(shí)間（C～E）對(duì)生物被膜的影響Fig. 5 Effect of nutrition on the growth （A）， pH （B） and biofilm formation at 24， 36 and 48 h （C， D and E） of L-ZS9

2.4胃腸道環(huán)境對(duì)生物被膜的影響

2.4.1pH值、膽鹽及滲透壓對(duì)成熟生物被膜的影響

胃腸道環(huán)境中的胃酸、膽鹽及滲透壓會(huì)對(duì)其中的微生物產(chǎn)生拮抗作用，其中低pH值及膽鹽會(huì)抑制L-ZS9的生長(zhǎng)，因此本研究著重考察了胃腸道環(huán)境因素對(duì)L-ZS9成熟生物被膜的影響。研究結(jié)果如圖6所示，成熟的L-ZS9生物被膜在pH 2.0～5.0時(shí)會(huì)被顯著破壞，同時(shí)0.1 g/100 mL和0.2 g/100 mL的膽鹽也會(huì)破壞成熟的生物被膜，而0.3 mol/L NaCl對(duì)成熟生物被膜沒有影響。該結(jié)果表明，胃腸道中的胃酸和膽鹽會(huì)破壞已經(jīng)形成的L-ZS9生物被膜，從而對(duì)其黏附定殖產(chǎn)生不利作用。

圖6　pH值、膽鹽及滲透壓對(duì)L-ZS9成熟生物被膜的影響Fig. 6 Effect of pH， bile salt and osmotic pressure on the formed biofilm of L-ZS9

2.4.2胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)初始生物被膜及成熟生物被膜的影響

由于胃腸道中存在著胃蛋白酶和胰蛋白酶，因此檢測(cè)二者對(duì)L-ZS9生物被膜的影響具有意義。圖7A、B顯示，胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)L-ZS9的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸沒有影響。圖7C顯示不同培養(yǎng)時(shí)間胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)初始生物被膜形成的影響，結(jié)果表明在培養(yǎng)12、24、36 h和48 h時(shí)，胃蛋白酶和胰蛋白酶會(huì)顯著抑制初始生物被膜的形成。圖7D顯示胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)成熟生物被膜的影響，結(jié)果表明胃蛋白酶和胰蛋白酶會(huì)顯著破壞成熟的生物被膜。以上結(jié)果說明，胃腸道中的胃蛋白酶和胰蛋白酶不僅會(huì)抑制L-ZS9在黏膜表面形成生物被膜，而且會(huì)破壞已經(jīng)成熟的生物被膜。本研究結(jié)果與已有研究結(jié)果類似，Lebeer等［17］曾對(duì)Lactobacillus rhamnosus的生物被膜形成能力與影響因素做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)被膜的形成受到培養(yǎng)基及胃腸道環(huán)境等多種因素的影響。

圖7　胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)L-ZS9生長(zhǎng)（A）、產(chǎn)酸（B）、初始生物被膜形成（C）及成熟生物被膜（DD）的影響Fig. 7 Effect of pepsin and trypsin on the growth （A）， pH （B）， biofilm formation （C） and formed biofilm （D） of L-ZS9

2.5群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2對(duì)生物被膜的影響

2.5.1AI-2對(duì)生物被膜形成的影響

生物被膜作為細(xì)菌群體存在的形態(tài)，受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控［18］。其中AI-2是介導(dǎo)LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)的通用信號(hào)分子，參與調(diào)控多種細(xì)菌的生物被膜形成，因此，本研究檢測(cè)了AI-2對(duì)L-ZS9生物被膜形成的影響。圖8A、B表明，外源的AI-2對(duì)L-ZS9的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸沒有影響。圖8C表明，外源添加的AI-2對(duì)L-ZS9生物被膜的影響具有濃度依賴性，0.5% AI-2對(duì)生物被膜的促進(jìn)作用最為顯著。外源添加信號(hào)分子AI-2可促進(jìn)綠膿桿菌PAO1［19］、幽門螺桿菌［20］、表皮葡萄球菌RP62A［21］等菌株的生物被膜形成；低體積分?jǐn)?shù)AI-2可促進(jìn)豬鏈球菌生物被膜的形成，而高體積分?jǐn)?shù)AI-2則抑制豬鏈球菌生物被膜的形成［22］；外源添加AI-2可減弱金黃色釀膿葡萄球菌生物被膜的形成［23］。也有研究發(fā)現(xiàn)血鏈球菌的生物被膜形成與AI-2沒有關(guān)系［24］。 而本研究表明，對(duì)于L. paraplantarum L-ZS9，一定體積分?jǐn)?shù)范圍的AI-2對(duì)其生物被膜的形成具有促進(jìn)作用。

圖8　信號(hào)分子AI-2對(duì)L-ZS9生長(zhǎng)（A）、產(chǎn)酸（BB）及生物被膜形成（CC）的影響Fig. 8 Effect of AI-2 on the growth （A）， pH （B） and biofilm formation （C）of L-ZS9

2.5.2AI-2影響胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)生物被膜的作用

由2.4.2節(jié)可知，胃蛋白酶及胰蛋白酶對(duì)L-ZS9的生物被膜具有抑制和破壞作用，由2.5.1節(jié)可知，0.5%的AI-2對(duì)其生物被膜具有促進(jìn)作用，因此本實(shí)驗(yàn)就AI-2與胃蛋白酶、胰蛋白酶共同作用對(duì)生物被膜的影響進(jìn)行了檢測(cè)。所得結(jié)果如圖9所示，圖9A顯示添加AI-2可以緩解胃蛋白酶、胰蛋白酶及二者共存對(duì)L-ZS9初始生物被膜形成的抑制作用，圖9B顯示AI-2還可以緩解胃蛋白酶、胰蛋白酶及二者共存對(duì)成熟生物被膜的破壞作用。由以上結(jié)果推測(cè)，胃腸道中AI-2的存在可以增強(qiáng)L-ZS9在黏膜表面形成生物被膜的能力。近年來有報(bào)道［25］稱AI-2可以改善抗生素誘導(dǎo)的腸道生態(tài)失衡，AI-2水平升高可以增加厚壁菌（Firmicutes）和擬桿菌（Bacteriodetes）的數(shù)量，且AI-2可以促進(jìn)雙歧桿菌（Bifidobacteria）的生物被膜形成和對(duì)宿主的定殖。結(jié)合本研究結(jié)果，通過提升胃腸道中AI-2水平，有利于益生菌在黏膜表面生物被膜的形成及對(duì)宿主的黏附。

圖9　信號(hào)分子AI-2削弱胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)L-ZS9初始生物被膜形成的抑制（A）及對(duì)成熟生物被膜的破壞（B）BFig. 9 AI-2 relieves the inhibition （A） and destruction （B） of biofilm formation of L-ZS9 by pepsin and trypsin

3　結(jié) 論

L. paraplantarum L-ZS9生物被膜狀態(tài)比浮游狀態(tài)時(shí)對(duì)HT-29的黏附能力更高，前者為后者的1.5倍；此外，生物被膜態(tài)菌體的fbb、ropN和rrf2的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于浮游態(tài)菌體，其中fbb和ropN轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)大于1.5 倍，而rrf2的轉(zhuǎn)錄水平則超過2 倍。L. paraplantarum L-ZS9在37 ℃靜置培養(yǎng)36 h時(shí)，生物被膜形成量最多；此外，及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有利于其生物被膜的形成，而不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在不同時(shí)間及生物被膜形成不同階段發(fā)揮不同作用。胃腸道中的低pH值及膽鹽會(huì)破壞已經(jīng)成熟的生物被膜；胃蛋白酶和胰蛋白酶不僅會(huì)抑制L. paraplantarum L-ZS9初始生物被膜的形成，而且會(huì)破壞已經(jīng)形成的生物被膜。外源添加群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2對(duì)L. paraplantarum L-ZS9生物被膜的形成具有影響，且該影響具有濃度依賴性，0.5%的AI-2對(duì)L. paraplantarum L-ZS9生物被膜的促進(jìn)作用最強(qiáng)。添加0.5%的外源AI-2不僅可以緩解胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)初始生物被膜的抑制作用，而且可以緩解二者對(duì)成熟生物被膜的破壞作用。

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Adhesion Ability of Lactobacillus paraplantarum L-ZS9 and Influencing Factors of Its Biofilm Formation

LIU Lei1， WU Ruiyun1，2， LI Jun1， LI Pinglan1，*
（1. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health， College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University， Beijing 100083， China； 2. College of Life Sciences， Inner Mongolia University， Hohhot 010021， China）

Adhesion of probiotics to the gastrointestinal tract is prerequisite for its beneficial function. This study aims to investigate the adhesion ability of biofilm-like cells of Lactobacillus paraplantarum L-ZS9 and determine factors influencing the biofilm formation of this strain. The adhesion ability to HT-29 of biofilm cells of L-ZS9 was compared with its planktonic cells. In addition， the effects of culture time， temperature， nutrition， low pH， high bile salt， proteases and quorum sensing signal （autoinducer-2， AI-2） on biofilm formation were investigated by crystal violet staining method. The results showed that the adhesion ratio of biofilm cells of L-ZS9 to HT-29 was 1.5 times higher than that of its planktonic cells. The genes fbb， ropN and rrf2 were up-regulated in biofilm cells. The strain produced the largest number of biofilm cells when cultured at 37 ℃for 36 h. Sufficient nutrition promoted biofilm formation. Low pH and high bile salt destroyed the formed biofilm. Pepsin and trypsin inhibited biofilm formation and destroyed the formed biofilm as well. AI-2 （0.5%， V/V） had the strongest beneficial effect on biofilm formation and weakened the inhibition and destruction of pepsin and trypsin. This work can lay a foundation for producing functional foods containing biofilm probiotics with better adhesion to the gastrointestinal tract.

Lactobacillus paraplantarum L-ZS9； adhesion； biofilm； influencing factors； signal AI-2

10.7506/spkx1002-6630-201615023

Q939.99

A

1002-6630（2016）15-0136-08引文格式：

10.7506/spkx1002-6630-201615023. http://www.spkx.net.cn

2016-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271827；31471707）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100805-0-1）

劉蕾（1988—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：liulei0606@gmail.com

李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn