地衣芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

余永名，劉 巖，李學(xué)鵬，李 春，儀淑敏，*，勵(lì)建榮，*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.渤海大學(xué)數(shù)理學(xué)院，遼寧 錦州 121013）

地衣芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

余永名1，劉 巖1，李學(xué)鵬1，李 春2，儀淑敏1，*，勵(lì)建榮1，*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.渤海大學(xué)數(shù)理學(xué)院，遼寧 錦州 121013）

將地衣芽孢桿菌接種到草魚(yú)肌原纖維蛋白中，研究不同貯藏溫度條件下地衣芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠特性的影響。結(jié)果表明：地衣芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠特性和結(jié)構(gòu)有較大影響。4 ℃和25 ℃貯藏條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，凝膠強(qiáng)度、硬度、彈性和白度均呈下降趨勢(shì)，且對(duì)照組下降幅度大于空白組；空白組和對(duì)照組凝膠的菌落總數(shù)均顯著增加，自由水含量隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，對(duì)照組上升更明顯，其保水性逐漸變差；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察到凝膠微觀結(jié)構(gòu)被破壞，由緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸變得疏松多孔；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）結(jié)果表明肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白逐漸被降解，且對(duì)照組凝膠的結(jié)構(gòu)和蛋白降解程度均大于空白組。25 ℃條件下更適宜地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)，樣品凝膠破壞程度大于4 ℃條件下貯藏的樣品。

地衣芽孢桿菌；草魚(yú)；肌原纖維蛋白；凝膠特性

余永名， 劉巖， 李學(xué)鵬， 等. 地衣芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠特性的影響［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 31-38.

YU Yongming， LIU Yan， LI Xuepeng， et al. Effect of Bacillus licheniformis on gel properties of grass carp myofibrillar protein［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 31-38. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615006.

http://www.spkx.net.cn

淡水魚(yú)肌原纖維蛋白的凝膠形成能力較海水魚(yú)差，越來(lái)越多的研究者通過(guò)在加工過(guò)程中改善工藝、加入添加物等方式去提高其凝膠特性。但是貯藏過(guò)程中如微生物污染、溫度等條件的變化等仍有可能導(dǎo)致最終產(chǎn)品凝膠特性的降低。Mori［1］和Coton［2］等認(rèn)為一些芽孢桿菌出現(xiàn)在魚(yú)糜制品的貯藏中期，推測(cè)可能是導(dǎo)致魚(yú)糜制品腐敗的原因，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是其中很常見(jiàn)的一類［2］，也是魚(yú)丸的優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一［3］。芽孢桿菌在不利條件下能夠形成具有特殊抵抗力的芽孢，污染食品后因具有耐熱性而易殘留，魚(yú)糜制品經(jīng)過(guò)高溫處理也很難將其殺死，在貯藏過(guò)程中持續(xù)地影響魚(yú)糜制品的品質(zhì)。

草魚(yú)年產(chǎn)量居我國(guó)四大淡水魚(yú)類養(yǎng)殖品種的首位，可作為魚(yú)糜加工的主要原料之一。本實(shí)驗(yàn)以草魚(yú)肌原纖維蛋白為研究對(duì)象，向其中加入一定量的地衣芽孢桿菌，通過(guò)熱誘導(dǎo)形成凝膠，研究不同貯藏溫度條件下地衣芽孢桿菌對(duì)草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，從肌原纖維蛋白凝膠特性變化的角度闡述草魚(yú)肉及其魚(yú)糜制品在貯藏過(guò)程中變化情況，以期為提高草魚(yú)及其魚(yú)糜制品貯藏品質(zhì)提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料、菌種與試劑

草魚(yú)購(gòu)自錦州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

地衣芽孢桿菌（菌種編號(hào)1.265）購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）。

營(yíng)養(yǎng)肉湯、平板計(jì)數(shù)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；TA.XT-plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；NMI20核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；蛋白電泳儀、GS-800圖像掃描儀 美國(guó)Bio-Rad公司；UV2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；MLS-3030CH立式高壓蒸汽滅菌鍋 三洋電機(jī)有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇景集團(tuán)蘇州安泰技術(shù)有限公司；CR-400色彩色差計(jì) 柯尼卡美能達(dá)（中國(guó)）投資有限公司；BagMixer400拍打均質(zhì)器 法國(guó)Interscience公司；T25 basic組織勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；S4800場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡 日本Minolta公司。

1.3方法

1.3.1地衣芽孢桿菌懸液的配制

菌種活化：用無(wú)菌吸管吸取0.3～0.5 mL適宜液體培養(yǎng)基，加入到裝有凍干粉末狀地衣芽孢桿菌的安培管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸取全部菌懸液，移殖于固體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，獲得的地衣芽孢桿菌單菌落再進(jìn)行2 次純培養(yǎng)。

菌懸液的制備：將活化好的菌株接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，以2%的接種量傳代培養(yǎng)1 次后，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，制成約107CFU/mL菌懸液，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2草魚(yú)肌原纖維蛋白的提取及測(cè)定

根據(jù)Hong等［4］的方法并略作修改，取新鮮草魚(yú)背部肉，與4 倍體積的pH 6.25、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含有0.1 mol/L NaCl）混合，勻漿2 min，每勻漿20 s，停20 s，防止過(guò)熱，勻漿液4 ℃、3 500×g離心15 min，并且收集沉淀，重復(fù)2 次。沉淀再與4 倍體積的pH 6.25、0.1 mol/L NaCl混合搖勻，混合液4 ℃、3 500×g離心15 min，收集沉淀，重復(fù)2 次，再經(jīng)過(guò)兩層紗布過(guò)濾除去結(jié)締組織，濾液以4 000×g離心15 min，所得沉淀即為肌原纖維蛋白。

1.3.3草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠的制備

將肌原纖維蛋白分成200 g的兩等份，加入2.5%食鹽擂潰后分裝于滅菌的500 mL燒杯中，按照1∶40（V/V）加入濃度為107CFU/mL的菌懸液（對(duì)照組），另一組按照同樣的比例加入生理鹽水（空白組），混合均勻，再以15 g每瓶分裝于滅菌帶蓋的玻璃瓶（3 cm×5 cm）中，將小瓶在4 ℃、3 500×g離心1 min，排除內(nèi)部的空氣，之后放到80 ℃水浴鍋中加熱30 min，取出后在冰上放置1 h，將樣品分別貯藏于4 ℃和25 ℃條件下，定期取樣測(cè)定指標(biāo)。

1.3.4凝膠強(qiáng)度測(cè)定

凝膠強(qiáng)度為破斷力與凹陷距離的乘積：凝膠強(qiáng)度/（g·mm）=破斷力/g×凹陷距離/mm。測(cè)定前將凝膠樣品于室溫放置30 min，切成2.5 cm×2.5 cm的圓柱體［5］。凝膠強(qiáng)度通過(guò)質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定。每組樣品進(jìn)行5 份平行測(cè)定。

參數(shù)設(shè)定：探頭型號(hào)為P/5S；測(cè)前速率為1 mm/s、測(cè)試速率為1 mm/s、測(cè)后速率為1 mm/s；壓縮距離為15 mm；觸發(fā)力為10 g。

1.3.5質(zhì)地剖面分析（texture profile analysis，TPA）參數(shù)測(cè)定

測(cè)定前將凝膠樣品于室溫放置30 min，切成2.5 cm×2.5 cm的圓柱體，選用質(zhì)構(gòu)儀的TPA模式測(cè)定其硬度、彈性等各項(xiàng)指標(biāo)。測(cè)試參數(shù)設(shè)定為：P/50探頭；測(cè)前速率2 mm/s、測(cè)試速率2 mm/s、測(cè)后速率2 mm/s；觸發(fā)力5 g；壓縮程度為40%，其中停留時(shí)間為5 s，每組樣品做5個(gè)平行。

1.3.6白度測(cè)定

測(cè)定前將凝膠樣品于室溫放置30 min，采用色差計(jì)測(cè)量，測(cè)定L*（明亮度）、a*（紅綠偏差）和b*（黃藍(lán)偏差）值。白度的計(jì)算公式如下［6］。

白度=100-［（100-L*）2+a*2+b*2］1/2

1.3.7低場(chǎng)核磁共振分析

凝膠樣品在室溫下放置平衡30 min后，制成直徑為10 mm、高為20 mm的圓柱體并裝入核磁管，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列進(jìn)行自旋-自旋弛豫時(shí)間T2的測(cè)定，每組做5 個(gè)平行。測(cè)試參數(shù)：線圈直徑：15 mm；頻率：22.0 MHz；溫度：（32.00±0.01） ℃；采用重復(fù)時(shí)間（TR）：3 000 ms；回波時(shí)間（EchoTime）：150 μs；重復(fù)掃描次數(shù)（NS）：8；回波個(gè)數(shù)（EchoCnt）：3 500。所得CPMG指數(shù)衰減曲線采用儀器自帶的軟件進(jìn)行反演，得到T2各個(gè)部分所對(duì)應(yīng)的峰面積值為W1、W2及W3，它們分別代表3 個(gè)組分中水的百分含量。

1.3.8場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡分析

參照Oujifard等［7］的方法并稍作修改：將肌原纖維蛋白凝膠切成小塊（3 mm×3 mm×2 mm），用2.5%戊二醛溶液固定24 h，去除固定液，用0.2 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，15 min/次，再用去離子水沖洗1 h，之后分別用50%、70%、90%的乙醇梯度脫水，15 min/次，再用100%乙醇脫水3 次，10 min/次，處理完后進(jìn)行真空冷凍干燥，然后離子濺射鍍金，最后用掃描電鏡進(jìn)行觀察。

1.3.9十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析

參考Laemmli［8］的方法并稍作修改：稱取魚(yú)糜凝膠3.0 g，絞碎后加入27 mL加熱到85 ℃的5% SDS溶液，用高速勻漿機(jī)均質(zhì)4 min后85 ℃水浴加熱1 h，冷卻后將勻漿液在26～28 ℃、11 000 r/min條件下離心5 min，取上清液。調(diào)節(jié)上清液質(zhì)量濃度為6 mg/mL，與上樣緩沖液按1∶2（V/V）比例混合，沸水浴5 min。制膠后上樣10 μL，其中濃縮膠4%、分離膠10%。52 mA恒流進(jìn)行凝膠電泳。電泳完成后進(jìn)行染色和脫色，染色液：0.25%的考馬斯亮藍(lán)R-250、50%甲醇和10%冰醋酸；脫色液：含50%甲醇和10%冰醋酸，脫色至背景基本無(wú)色，在凝膠成像儀上成像。

1.3.10菌落總數(shù)測(cè)定

稱取肌原纖維蛋白凝膠樣品10 g，加入90 mL無(wú)菌生理鹽水中，拍打勻漿120 s，室溫靜置20 min后，對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋后選取合適的稀釋度，吸取1 mL不同梯度的稀釋液注入平板中，采用平板法30 ℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析處理，利用Origin 8.0軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在貯藏過(guò)程中凝膠強(qiáng)度的變化

表1　草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在4 ℃貯藏過(guò)程中凝膠強(qiáng)度的變化Table 1 Change in gel strength of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃

表2　草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在25 ℃貯藏過(guò)程中凝膠強(qiáng)度的變化Table 2 Change in gel strength of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃

凝膠強(qiáng)度是衡量凝膠制品品質(zhì)的一項(xiàng)常用的指標(biāo)，能反映凝膠制品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的堅(jiān)實(shí)程度。凝膠強(qiáng)度的大小主要與蛋白質(zhì)的變性程度及其所形成的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)［9-10］。由表1、2可知，在4 ℃條件下隨著貯藏期的延長(zhǎng)，空白組和對(duì)照組凝膠強(qiáng)度均先略有增加再逐漸下降；且對(duì)照組的變化幅度更大。可能是因?yàn)樵谖⑸锏淖饔孟鹿羌艿鞍自獾狡茐?，肌原纖維蛋白的凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并暴露出更多的巰基基團(tuán)，巰基含量的增加促使蛋白質(zhì)凝膠性能得到提高［11］。后期由于微生物大量繁殖，蛋白質(zhì)變性程度加快，導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)交聯(lián)度降低，蛋白質(zhì)分子間相互作用力減小而使凝膠強(qiáng)度降低。相比空白組，對(duì)照組凝膠中地衣芽孢桿菌大量繁殖并能產(chǎn)生較多胞外蛋白酶，更易破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，降低蛋白質(zhì)分子間的相互作用。在25 ℃條件下貯藏的凝膠強(qiáng)度較4 ℃條件下貯藏的凝膠強(qiáng)度變化幅度更大，同樣，對(duì)照組下降幅度大于空白組。相比4 ℃，25 ℃更適合于微生物的生長(zhǎng)、繁殖速度快，產(chǎn)生的胞外酶更多且活性更強(qiáng)，加速對(duì)蛋白質(zhì)的降解，破壞蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)的完整性，使蛋白質(zhì)分子間的相互作用減弱，蛋白凝膠軟化腐敗，凝膠強(qiáng)度逐漸降低。

2.2草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在貯藏過(guò)程中硬度和彈性的變化

表3　草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在4 ℃貯藏過(guò)程中的硬度和彈性變化Table 3 Changes in hardness and elasticity of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃

表4　草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在25 ℃貯藏過(guò)程中的硬度和彈性變化Table 4 Changes in hardness and elasticity of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃

由表3、4可知，在4 ℃條件下冷藏過(guò)程中，空白組和對(duì)照組凝膠的硬度均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，且對(duì)照組變化的幅度大于空白組，可能是在微生物的作用下蛋白質(zhì)骨架遭到破壞，并導(dǎo)致肌原纖維蛋白形成空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力變?nèi)?，使凝膠的保水性能逐漸降低，從而導(dǎo)致蛋白凝膠硬度略有增加［12-13］；后期微生物大量繁殖，蛋白質(zhì)逐漸被分解，凝膠結(jié)構(gòu)進(jìn)一步被破壞，導(dǎo)致凝膠腐敗變軟，硬度逐漸降低。在25 ℃條件下貯藏過(guò)程中，凝膠的硬度呈顯著下降趨勢(shì)，且對(duì)照組下降幅度大于空白組；可能是在25 ℃貯藏過(guò)程中，細(xì)菌大量生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)酶量及酶活性更高，加速了蛋白質(zhì)的降解，破壞了蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)空間結(jié)構(gòu)的完整性，使得蛋白凝膠軟化腐敗，硬度下降［14］。兩種貯藏溫度下，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，對(duì)照組凝膠硬度的變化幅度均大于空白組，原因可能與細(xì)菌數(shù)量及產(chǎn)酶量有關(guān)——對(duì)照組接種了地衣芽孢桿菌且其可以產(chǎn)生胞外蛋白酶，更容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)腐敗變質(zhì)。

凝膠的彈性是指當(dāng)外力促使凝膠變形后，除去外力時(shí)凝膠所能恢復(fù)到形變前狀態(tài)的程度。彈性反映的是固體力學(xué)性質(zhì)的物理量，只有發(fā)生了變形并且具有恢復(fù)形變的能力，才能說(shuō)明該樣品具有彈性，彈性可作為衡量凝膠制品品質(zhì)一項(xiàng)重要指標(biāo)［15］。由表3、4可知，4 ℃和25 ℃貯藏過(guò)程中，凝膠彈性均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。彈性降低可能是由于微生物及蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解，破壞了凝膠的空間立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)孔隙變大甚至破裂所致。實(shí)際上，肌原纖維蛋白的數(shù)量和完整性與蛋白凝膠的硬度、彈性、凝膠強(qiáng)度、持水力等指標(biāo)均直接相關(guān)。而由空白組與對(duì)照組比較可知，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，對(duì)照組凝膠彈性的變化幅度大于空白組，由于對(duì)照組接種了地衣芽孢桿菌且其可以產(chǎn)生胞外蛋白酶，更容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)腐敗變質(zhì)，所以其彈性的下降幅度要大于空白組。

2.3草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在貯藏過(guò)程中白度的變化

圖1　草魚(yú)肌原纖維蛋白在25 ℃（a）和4 ℃（b）貯藏的白度變化Fig. 1 Change in whiteness of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃ （a） and 4 ℃ （b）

對(duì)于蛋白凝膠而言，光在其中的散色是由肌原纖維蛋白凝膠結(jié)構(gòu)以及散色粒子的大小決定的［16］，即白度主要取決于蛋白質(zhì)變性與聚合程度以及其表面的光學(xué)特性［17-20］。由圖1可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，凝膠白度呈明顯下降趨勢(shì)，這可能是由于在貯藏過(guò)程中細(xì)菌大量繁殖，蛋白質(zhì)逐漸被氧化，凝膠結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白凝膠開(kāi)始腐敗變質(zhì)，逐漸生成一些黃色斑點(diǎn)所致。另外，Xia Xiufang等［21］認(rèn)為蛋白凝膠白度值的下降還可能和氨基酸側(cè)鏈與氧化產(chǎn)物在加熱形成凝膠時(shí)發(fā)生非酶褐變有關(guān)。25 ℃條件下蛋白凝膠白度的下降速率要大于4 ℃條件下貯藏的樣品，原因是25 ℃更適合細(xì)菌的生長(zhǎng)，其代謝速率比4 ℃時(shí)更快，能產(chǎn)生的胞外酶更多、酶活性更強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)的氧化分解作用更強(qiáng)，使凝膠結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞并逐漸腐敗變質(zhì)生成一些黃色斑點(diǎn)，并伴有汁液流出，甚至難以形成凝膠。而由空白組與對(duì)照組比較可知，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，對(duì)照組凝膠白度的變化幅度要大于空白組，原因可能與細(xì)菌數(shù)量及產(chǎn)酶量有關(guān)，由于對(duì)照組接種了地衣芽孢桿菌且其可以產(chǎn)生胞外蛋白酶，更容易導(dǎo)致蛋白凝膠發(fā)生腐敗變質(zhì)，所以白度值的下降幅度要大于空白組。

2.4草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在貯藏過(guò)程中水分含量的變化

肌原纖維蛋白凝膠中存在三部分水，分別是：結(jié)合水，是指與蛋白質(zhì)等大分子在氫鍵的作用下，氨基和羰基緊密結(jié)合形成的單分子層水［22］；不易流動(dòng)水，是位于蛋白質(zhì)空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)空隙中的水分，即束縛水［23］；自由水，是存在于細(xì)胞外的水，自由水是蛋白凝膠中結(jié)合最不緊密的水，也是離心等外界處理最易除去的水，該部分水相對(duì)百分含量越高，則蛋白凝膠的保水性越差。三部分水分占總水分的比例分別為W1、W2、W3。由表5、6可知，在貯藏過(guò)程中，W1變化范圍很小，基本保持不變。W2的所占比例最高（90%以上），變化幅度不顯著，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，初期逐漸下降，后期下降緩慢基本趨于穩(wěn)定，表明隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，由于細(xì)菌大量繁殖及其胞外酶的作用，束縛水存在的凝膠微觀結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致水分和大分子的結(jié)合力減弱，逐漸掙脫原有束縛向外部遷移，逐漸向自由水轉(zhuǎn)變［24］，使得W2減少。隨著貯藏期的延長(zhǎng)，W3呈明顯的上升趨勢(shì)，浮動(dòng)范圍最大，即隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白凝膠中自由水的含量顯著增加，表明蛋白凝膠的保水性越來(lái)越差。空白組與對(duì)照組之間的差異主要與細(xì)菌數(shù)量及產(chǎn)酶量有關(guān)，導(dǎo)致對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)的破壞程度不同所致。另外，與4 ℃條件下貯藏的凝膠相比，25 ℃條件下貯藏的凝膠W3變化幅度更明顯，表明在25 ℃時(shí)自由水對(duì)引起凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變所導(dǎo)致的水分遷移性的變化更敏感。

表5　草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在4 ℃貯藏過(guò)程中水分含量變化Table 5 Change in moisture content of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃%

表6　草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在25 ℃貯藏過(guò)程中水分含量變化Table 6 Change in moisture content of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃%

2.5草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在貯藏過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的分析

由圖2、3可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌原纖維蛋白凝膠的結(jié)構(gòu)由平整、光滑、緊實(shí)逐漸變得凹凸不平、粗糙、疏松多孔，25 ℃條件下貯藏的蛋白凝膠結(jié)構(gòu)變化程度要大于4 ℃條件下貯藏的樣品，貯藏后期凝膠結(jié)構(gòu)的孔隙也更大，可能是由于在25 ℃細(xì)菌可以大量繁殖且產(chǎn)酶量高，對(duì)于蛋白質(zhì)分解速率更快，降解程度也更高。而由空白組與對(duì)照組比較可知，空白組肌原纖維蛋白凝膠樣品的降解程度要小于對(duì)照組，地衣芽孢桿菌大量生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)生的胞外蛋白酶會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白逐漸被降解，因而導(dǎo)致對(duì)照組蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的破壞程度大于空白組。

圖2　草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在4 ℃貯藏的掃描電鏡圖Fig. 2 SEM photomicrographs of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃

圖3　草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在25 ℃貯藏的掃描電鏡圖Fig. 3 SEM photomicrographs of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃

2.6草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在貯藏過(guò)程中SDS-可溶性蛋白含量的變化

圖4　草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在4 ℃貯藏過(guò)程中的SDS-PAGE圖譜Fig. 4 SDS-PAGE pattern of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃

圖5　草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在25 ℃貯藏過(guò)程中的SDS-PAGE圖譜Fig. 5 SDS-PAGE pattern of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 25 ℃

由圖4、5可知，草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠的SDS-可溶性蛋白條帶眾多，分子質(zhì)量主要分布在10～200 kD之間，其中肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）最易發(fā)生降解［25］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，MHC條帶的光密度逐漸減弱，說(shuō)明肌球蛋白重鏈在貯藏過(guò)程中逐漸發(fā)生降解。與肌球蛋白重鏈的變化相比，肌動(dòng)蛋白（actin）的降解程度略低，但降解程度明顯。蛋白質(zhì)的降解的程度受很多因素影響，如溫度、微生物和酶等［26］，內(nèi)源性組織蛋白酶在80 ℃凝膠化過(guò)程中基本失活，而地衣芽孢桿菌在貯藏過(guò)程中產(chǎn)生的胞外蛋白酶及其他產(chǎn)酶細(xì)菌對(duì)蛋白的降解可能起到了主要作用。樣品在25 ℃貯藏36～48 h后條帶明顯變淺，基本不可見(jiàn)；而樣品在4 ℃貯藏到第28天時(shí)基本不可見(jiàn)，25 ℃條件下貯藏的樣品肌球蛋白重鏈降解速率明顯較4 ℃條件下貯藏的樣品更快，由于25 ℃時(shí)細(xì)菌大量繁殖且地衣芽孢桿菌等產(chǎn)酶細(xì)菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶量更多，導(dǎo)致肌原纖維蛋白更容易被降解。而由空白組與對(duì)照組比較可知，空白組MHC的降解程度要低于對(duì)照組，原因是對(duì)照組接種了地衣芽孢桿菌，其大量生長(zhǎng)繁殖及產(chǎn)生的胞外蛋白酶會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白逐漸降解。

2.7草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)的變化

圖6　草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠在4 ℃（a）和25 ℃（b）貯藏過(guò)程中的菌落總數(shù)變化Fig. 6 Change in total number of colonies of grass carp myofibrillar protein gel during storage at 4 ℃ （a） and 25 ℃ （b）

由圖6可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠菌落總數(shù)明顯增加，且在25 ℃條件下前24 h增長(zhǎng)迅速，后24 h增長(zhǎng)緩慢基本趨于穩(wěn)定，由于初期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比較豐富，有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌數(shù)量達(dá)到一定的限度，對(duì)肌原纖維蛋白的降解及結(jié)構(gòu)的破壞也已經(jīng)達(dá)到了極限，對(duì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中氫鍵、疏水相互作用等的破壞趨于飽和，此時(shí)凝膠難以形成，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)被大量消耗，導(dǎo)致后期菌落數(shù)量趨于平穩(wěn)。25 ℃條件下菌落總數(shù)的增長(zhǎng)速率明顯快于4 ℃條件下，可以看出25 ℃更適合于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。而由空白組與對(duì)照組比較可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，接種地衣芽孢桿菌的對(duì)照組細(xì)菌總數(shù)的增長(zhǎng)速率要快于空白組。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)表明，無(wú)論是在4 ℃還是25 ℃條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，空白組和對(duì)照組草魚(yú)肌原纖維蛋白凝膠中的細(xì)菌總數(shù)均明顯增加，凝膠強(qiáng)度、硬度和彈性大致呈下降趨勢(shì)，白度顯著下降；低場(chǎng)核磁共振結(jié)果顯示蛋白凝膠的自由水含量顯著增加，表明其保水性逐漸變差。此外，場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察到凝膠樣品的結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，由緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸變得疏松多孔；SDS-PAGE結(jié)果表明肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白逐漸被降解。對(duì)照組的肌原纖維蛋白凝膠樣品各指標(biāo)的變化幅度均大于空白組，表明地衣芽孢桿菌對(duì)蛋白凝膠特性產(chǎn)生較大影響，嚴(yán)重破壞了凝膠結(jié)構(gòu)；25 ℃條件下更適宜地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)，樣品凝膠破壞程度大于4 ℃條件下貯藏的樣品凝膠。

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Effect of Bacillus licheniformis on Gel Properties of Grass Carp Myofibrillar Protein

YU Yongming1， LIU Yan1， LI Xuepeng1， LI Chun2， YI Shumin1，*， LI Jianrong1，*（1. National & Local Joint Engineering Research Center of Storage， Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products， Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province， College of Food Science and Project Engineering， Bohai University， Jinzhou 121013， China； 2. School of Mathematics and Physics， Bohai University， Jinzhou 121013， China）

The effect of inoculation with Bacillus licheniformis on gel properties of grass carp myofibrillar protein during subsequent storage at different temperatures was investigated. The results showed that gel properties were greatly affected by Bacillus licheniformis， resulting in severely damaged gel structure. At 4 and 25 ℃，with the extension of storage time，gel strength， hardness， elasticity and whiteness showed a falling trend， and the control group presented a more significant decrease than the blank group. The total number of colonies in the two groups increased significantly， and the free water content of myofibrillar protein gels increased gradually with storage period， especially significantly in the control group，which in turn showed poorer water retention capacities. Moreover， the microstructure of gels was damaged and became more loose and porous， which was initially dense， as observed by FE-SEM. In addition， sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） results showed that myosin heavy chain （MHC） and actin were gradually degraded. The control group displayed a higher degree of structure and protein degradation than the blank group. Bacillus licheniformis grew better at 25 ℃， leading to more serious damage to the gel than at 4 ℃.

Bacillus licheniformis； grass carp； myofibrillar protein； gel properties

10.7506/spkx1002-6630-201615006

TS254.4

A

1002-6630（2016）15-0031-08

10.7506/spkx1002-6630-201615006. http://www.spkx.net.cn

2015-09-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571868）；遼寧省高校重大科技平臺(tái)-遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（LZ2015002）作者簡(jiǎn)介：余永名（1990—），男，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品貯藏加工及質(zhì)量安全控制研究。E-mail：yym1144@163.com

儀淑敏（1980—），女，副教授，博士，主要從事水產(chǎn)品貯藏加工及質(zhì)量安全控制研究。E-mail：yishumin@163.com勵(lì)建榮（1964—），男，教授，博士，主要從事水產(chǎn)品貯藏加工及安全控制研究。E-mail：lijr6491@163.com

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