高效液相色譜法同時(shí)測定葡萄酒中16 種添加劑

呂夢莎，林能鏢，梁玉英，曾俊杰，彭碧寧，李衛(wèi)崗

（珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東 珠海 519015）

摘 要：研究同時(shí)測定葡萄酒中16 種添加劑的高效液相色譜方法。該法主要采用CAPCELL PAK C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）分離，以甲醇-20 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，采取梯度洗脫，在波長250 nm處進(jìn)行測定。結(jié)果表明，在0.1～20 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)良好，相關(guān)系數(shù)范圍為0.999 3～0.999 7，方法檢出限范圍為0.01～0.5 mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.3%～6.3%之間，平均回收率范圍在76.5%～108.5%之間。本方法簡便、可靠，能滿足對(duì)市場上葡萄酒中相關(guān)非法添加劑的檢測監(jiān)控要求。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；添加劑；葡萄酒

高效液相色譜法同時(shí)測定葡萄酒中16 種添加劑

呂夢莎，林能鏢，梁玉英*，曾俊杰，彭碧寧，李衛(wèi)崗

（珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東 珠海 519015）

摘 要：研究同時(shí)測定葡萄酒中16 種添加劑的高效液相色譜方法。該法主要采用CAPCELL PAK C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）分離，以甲醇-20 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，采取梯度洗脫，在波長250 nm處進(jìn)行測定。結(jié)果表明，在0.1～20 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)良好，相關(guān)系數(shù)范圍為0.999 3～0.999 7，方法檢出限范圍為0.01～0.5 mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.3%～6.3%之間，平均回收率范圍在76.5%～108.5%之間。本方法簡便、可靠，能滿足對(duì)市場上葡萄酒中相關(guān)非法添加劑的檢測監(jiān)控要求。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；添加劑；葡萄酒

呂夢莎， 林能鏢， 梁玉英， 等. 高效液相色譜法同時(shí)測定葡萄酒中16 種添加劑［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（8）: 222-225.

Lü Mengsha， LIN Nengbiao， LIANG Yuying， et al. Simultaneous determination of 16 additives in wine by high performance liquid chromatography［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 222-225. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608040. http://www.spkx.net.cn

根據(jù)GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》［1］，葡萄酒中允許使用的食品添加劑僅有山梨酸（≤0.2 g/kg）、酒石酸（≤4.0 g/L）、二氧化硫（≤0.25 g/L）等。未明確規(guī)定允許添加的若有檢出，均屬于違法添加。但葡萄酒市場仍有不少違法使用添加劑或者添加劑超標(biāo)的現(xiàn)象，甚至有不法商販利用酒精、水和著色劑、甜味劑、香精等添加劑進(jìn)行勾兌，制造假冒偽劣葡萄酒產(chǎn)品，擾亂葡萄酒市場，危害消費(fèi)者健康。為了打擊葡萄酒市場中的違法造假行為，保證人民食品安全，有必要建立一種準(zhǔn)確、靈敏、便捷的葡萄酒中的禁用食品添加劑檢測方法。

目前，國標(biāo)［2-4］有針對(duì)葡萄酒中防腐劑、色素和甜味劑等不同類別的添加劑分別測定的檢測方法，但檢測程序繁雜，檢測時(shí)間長，無法對(duì)葡萄酒中多種類別的添加劑進(jìn)行同時(shí)快速的測定。其他檢測方法還有毛細(xì)管電泳法［5-6］、近紅外光譜法［7］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［8-10］、高效液相色譜法［11-16］和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［17-25］等。前3 種檢測方法測定的添加劑種類都有限制，無法同時(shí)測定多種類別的添加劑。后2 種檢測方法以高效液相色譜為依托，適用性更廣泛。高效液相色譜法已能對(duì)葡萄酒中多種添加劑進(jìn)行檢測，但目前該法在文獻(xiàn)報(bào)道中檢測的添加劑種類較少，而高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測的添加劑種類較多，但設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜，較少應(yīng)用于日常檢測。

因此，本實(shí)驗(yàn)基于高效液相色譜法，增加了葡萄酒中添加劑的檢測種類，即針對(duì)葡萄酒中常見的可能添加16 種添加劑，通過方法優(yōu)化，建立高效液相色譜同時(shí)測定葡萄酒中16 種添加劑的方法。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

10 份葡萄酒量品（規(guī)格為750 mL，類型均為干紅）市購。

乙酸銨（分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；甲醇（色譜純） 德國Merker公司；安賽蜜（純度99%）、苯甲酸（純度99.5%）、山梨酸（純度99%）、糖精鈉（純度99.9%）、新紅（純度92%）、靛藍(lán)（純度91%）、對(duì)羥基苯甲酸甲酯（純度99.5%）、對(duì)羥基苯甲酸乙酯（純度99.9%）、對(duì)羥基苯甲酸丙酯（純度99.5%）、對(duì)羥基苯甲酸丁酯（純度99.5%）德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；檸檬黃（0.5 mg/mL）、莧菜紅（0.5 mg/mL）、胭脂紅（0.5 mg/mL）、日落黃（0.5 mg/mL）、誘惑紅（1.00 mg/mL）、赤蘚紅（0.5 mg/mL） 中國計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀（配有Waters 2998二級(jí)管陣列檢測器） 美國Waters公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.050 5 g安賽蜜、0.050 3 g苯甲酸、0.050 5 g山梨酸、0.050 1 g糖精鈉、0.054 3 g新紅、0.054 9 g靛藍(lán)、0.050 5 g對(duì)羥基苯甲酸甲酯、丙酯和丁酯、0.050 1 g對(duì)羥基苯甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至100 mL容量瓶中，配制成500 mg/L單標(biāo)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2 mL，混合于50 mL容量瓶中，用水定容，配制成20 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。用水逐級(jí)稀釋，制成質(zhì)量濃度范圍為0.1～20 mg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2量品溶液制備

取葡萄酒量品10 mL于50 mL燒杯中，超聲脫氣5 min；取脫氣后的量品5.0 mL于10 mL具塞試管中，用水定容至10 mL，過0.22 μm濾膜后分析。

1.3.3高效液相色譜分析條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）+乙酸銨（B）（20 mmol/L，pH 5～6之間）；流速：1.0 mL/min；柱溫：常溫；檢測波長范圍：200～700 nm；進(jìn)量量：10 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2　結(jié)果與分析

2.1高效液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相的選擇及洗脫條件的確定

分別比較考察乙腈-20 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇-20 mmol/L乙酸銨溶液2 種體系對(duì)16 種添加劑的分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)表明：由于乙腈-20 mmol/L乙酸銨體系中乙腈的洗脫能力較強(qiáng)，同時(shí)待分離的16 種添加劑極性相近，保留時(shí)間相近。從而導(dǎo)致幾個(gè)組分“共流出”，不能完全分離16 種添加劑（圖1A）。然而，在甲醇-20 mmol/L乙酸銨體系中，甲醇相對(duì)乙腈的洗脫能力較弱，對(duì)16 種添加劑的分離效果較好。因此，選擇甲醇-20 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相體系。

為得到所研究的16 種添加劑良好的分離效果，對(duì)甲醇（A）-20 mmol/L乙酸銨（B）為流動(dòng)相的洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化。顯然，等度洗脫也出現(xiàn)組分“共流出”的現(xiàn)象（圖1B），為了獲得更好的分離效果，需采用梯度洗脫，通過實(shí)驗(yàn)不斷調(diào)整甲醇與乙酸銨的比例。最終，確定梯度洗脫程序見表1。

圖1　乙腈-20 mmol/L乙酸銨（A）和體積分?jǐn)?shù)50%甲醇（B）梯度洗脫色譜圖Fig.1 Chromatograms of 16 additives separated by gradient elution with acetonitrile-20 mmol/L ammonium acetate （A） and 50% methanol （B）

2.1.2定量波長的確定

圖2　優(yōu)化條件下分離16 種添加劑的高效液相色譜圖Fig.2 Chromatograms of 16 additives under optimum separation conditions

對(duì)安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅等16 種添加劑標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行紫外光譜掃描，見圖2A，發(fā)現(xiàn)16 種添加劑的最大吸收波長均不相同。然而，在波長250 nm處16 種添加劑的峰形良好，同時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度均能滿足檢測需求。因此，最后確定定量波長為250 nm。

按照以上優(yōu)化后的色譜條件對(duì)16 種添加劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和1號(hào)葡萄酒加標(biāo)量品（經(jīng)檢測不含有待測組分的實(shí)際量品）進(jìn)行檢測，得到16 種添加劑的高效液相色譜圖見圖2B。16 種添加劑分離完全，峰形良好。

2.2方法線性范圍及檢出限

表2　葡萄酒中16 種添加劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Table 2 Linear ranges， correlation coefficients （r） and limits of quantification （LOQs） for 16 additives in wine

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋為0.1～20.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用所建立的方法進(jìn)行測定，外標(biāo)法定量。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，各添加劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：16 種添加劑的質(zhì)量濃度與峰面積在0.1～20.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.999 3～0.999 7之間，以16 種添加劑的信噪比為3時(shí)的進(jìn)量質(zhì)量濃度為檢出限，得到檢出限范圍為0.01～0.5 mg/L。方法線性范圍廣，檢出限低，符合實(shí)際量品的檢測要求。

2.3回收率與精密度結(jié)果

選取1號(hào)葡萄酒量品（經(jīng)檢測不含有待測組分的實(shí)際量品），分別添加0.5、4、10、16 mg/L 4個(gè)水平質(zhì)量濃度的16 種添加劑的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度水平取5 份量品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，16 種添加劑的平均回收率在76.5%～108.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.3%～6.3%之間，結(jié)果如表3所示。

表3　葡萄酒中16 種添加劑的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 3 Recoveries and relative standard deviation （RSD） of 16 additives in wine （n= 5）%

2.4方法應(yīng)用

應(yīng)用本方法對(duì)市售10 種葡萄酒進(jìn)行測定，根據(jù)添加劑的保留時(shí)間和光譜圖進(jìn)行定性分析后定量，其中3 個(gè)量品檢出山梨酸，見表4。陽性量品色譜圖如圖3所示。

表4　葡萄酒陽性樣品的檢測結(jié)果Table 4 Quantification results of additives in positive wine samples

圖3　葡萄酒陽性樣品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of positive wine samples

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用CAPCELL PAK C18色譜柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm）進(jìn)行分離分析，采用高效液相色譜檢測葡萄酒中安賽蜜等16 種常見添加劑，分別對(duì)流動(dòng)相和梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：以甲醇-20 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相，采用優(yōu)化后的梯度洗脫程序，在波長250 nm處進(jìn)行檢測，能獲得16 種添加劑的有效分離。對(duì)本方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明：本方法在0.1～20.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)范圍為0.999 3～0.999 7，方法檢出限范圍為0.01～0.5 mg/L，RSD在0.3%～6.3%之間，平均回收率范圍在76.5%～108.5%之間。與文獻(xiàn)［2-4，14，16］方法相比，本方法操作簡便、檢測種類多、分離效果好、線性范圍廣、回收率和精密度良好，適用于葡萄酒中多種添加劑的同時(shí)測定。

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Simultaneous Determination of 16 Additives in Wine by High Performance Liquid Chromatography

Lü Mengsha， LIN Nengbiao， LIANG Yuying*， ZENG Junjie， PENG Bining， LI Weigang
（Inspection Technical Center of Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Zhuhai 519015， China）

A high performance liquid chromatography （HPLC） method was developed in this study for the simultaneous determination of 16 additives in wine. Chromatographic separation was performed using gradient elution on CAPCELL PAK C18column （150 mm × 4.6 mm， 5 μm） with methanol-20 mmol/L ammonium acetate as mobile phase， followed by detection at 250 nm. The results showed that the method exhibited an excellent linearity in the concentration range of 0.1-20 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 3-0.999 7 and had a good repeatability with relative standard deviation （RSD） of 0.3%-6.3%. The limits of detection （LOD） were between 0.01 and 0.5 mg/L， and average recoveries ranged from 76.5% to 108.5%. The present method is simple and accurate and can meet the requirements for the analysis of illicit additives in wines.

high performance liquid chromatography （HPLC）； additives； wine

10.7506/spkx1002-6630-201608040

TS207.3

A

1002-6630（2016）08-0222-04

10.7506/spkx1002-6630-201608040. http://www.spkx.net.cn

2015-08-18

珠海檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目（ZH2014-14）

呂夢莎（1987—），女，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail：lv.mengsha@163.com

梁玉英（1965—），女，高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail：171275765@qq.com

引文格式：