凡納濱對蝦腐敗優(yōu)勢菌的分離鑒定及其群體感應(yīng)信號分子測定

李 燦，張煜琛，孫力軍，王雅玲，梁美晶，胡漢橋，徐德峰，劉 穎，葉日英

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088）

凡納濱對蝦腐敗優(yōu)勢菌的分離鑒定及其群體感應(yīng)信號分子測定

李 燦，張煜琛，孫力軍*，王雅玲，梁美晶，胡漢橋，徐德峰，劉 穎，葉日英

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東 湛江 524088）

從凡納濱對蝦中分離和鑒定腐敗優(yōu)勢菌，并對其進行群體感應(yīng)信號分子AHLs和AI-2的測定。通過細菌自動生化鑒定系統(tǒng)和16S rDNA序列鑒定優(yōu)勢腐敗菌；利用生物檢測菌根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）JZA-1測定其AHLs、哈維弧菌（Vibrio harveyi）BB170檢測其AI-2，并探究其動態(tài)生成規(guī)律。最終分離得到10 株腐敗優(yōu)勢菌，有4 株菌均為變形桿菌屬（Proteus），其他分別為Oceanisphaera profunda、溶血性葡萄球菌（Stapylococcus haemolyticus）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、短桿菌屬（Brevibacterium）、Bacillus siamensis、Exiguobacterium aaestuarii。分離腐敗優(yōu)勢菌中的6 株革蘭氏陰性菌均產(chǎn)生AHLs信號分子；變形桿菌屬、腐敗希瓦氏菌、短桿菌屬、Bacillus siamensis產(chǎn)生AI-2信號分子。優(yōu)勢腐敗菌的AHLs活性與菌體生長密度呈正相關(guān)，AI-2產(chǎn)生量在菌體生長對數(shù)期累積，在菌體生長24 h后活性迅速減弱。

凡納濱對蝦；優(yōu)勢腐敗菌；群體感應(yīng)；信號分子

李燦， 張煜琛， 孫力軍， 等. 凡納濱對蝦腐敗優(yōu)勢菌的分離鑒定及其群體感應(yīng)信號分子測定［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（8）: 164-169. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608029. http://www.spkx.net.cn

LI Can， ZHANG Yuchen， SUN Lijun， et al. Isolation and identification of dominant spoilage bacteria from Litopenaeus vannamei and detection of quorum sensing signaling molecules［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 164-169. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608029. http://www.spkx.net.cn

對蝦中營養(yǎng)物質(zhì)和水分含量高，pH值接近中性，其中可溶性蛋白質(zhì)含量較高。細菌很容易利用和分離其所需蛋白質(zhì)，產(chǎn)生胺、硫化物、醛、酮、酯和有機酸等［1-3］，使得對蝦產(chǎn)生不良氣味、感官和食用品質(zhì)下降、發(fā)生腐敗［4-5］。通過對水產(chǎn)食品腐敗微生物長期研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)食品所含微生物中只有部分微生物參與腐敗過程，稱為特定腐敗菌［2］，又稱優(yōu)勢腐敗菌。探求導(dǎo)致對蝦腐敗的優(yōu)勢腐敗菌種類，能有效進行品質(zhì)變化的監(jiān)控和產(chǎn)品腐敗的靶向抑制，是研發(fā)加工保藏技術(shù)、提高對蝦品質(zhì)的前提。

細菌能產(chǎn)生并釋放一種稱為自體誘導(dǎo)物質(zhì)的信號分子。當(dāng)信號分子達到一定的濃度閾值就會啟動細菌體內(nèi)相關(guān)基因的表達，使其適應(yīng)不同的環(huán)境變化，這種調(diào)控系統(tǒng)被稱為群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)［6-7］。革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生的群體感應(yīng)信號分子有AHLs和AI-2兩大類［8-9］。有研究［10-11］表明，食品腐敗變質(zhì)及腐敗指標(biāo)與細菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象及AHLs、AI-2信號分子有著密切的關(guān)系。

有研究曾報道凍藏條件下對蝦優(yōu)勢腐敗菌主要有假單胞菌、氣單胞菌、腐敗希瓦氏菌、乳酸菌、不動桿菌屬和短桿菌屬，并對這些菌的信號分子［12-13］及其作用［14］進行了相應(yīng)研究。但不同的貯藏條件及處理方式［15-16］會對優(yōu)勢腐敗菌群的種類產(chǎn)生一定影響，其產(chǎn)生的信號分子種類及其濃度也不一量，而此方面的研究相對缺乏。此外，對于優(yōu)勢菌菌種間信息交流及調(diào)控的AI-2信號分子研究相對較少，更缺少對于其信號分子的動態(tài)生成規(guī)律探究。本研究對凡納濱對蝦常溫和4 ℃貯藏條件下腐敗進程中的優(yōu)勢腐敗菌進行了分離、鑒定，利用群體感應(yīng)信號分子生物檢測菌根癌膿桿菌（Agrobacterium tumefaciens）JZA-1、哈維弧菌（Vibrio harveyi）BB170，分別檢測其AHLs、AI-2信號分子產(chǎn)生情況并探究其動態(tài)生成規(guī)律，為對蝦優(yōu)勢腐敗菌及其群體感應(yīng)相關(guān)研究積累資料。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

凡納濱對蝦（鮮活） 市售。

根癌膿桿菌（Agrobacterium tumefaciens）JZA-1、R10，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)朱軍教授惠贈；哈維弧菌（Vibrio harveyi）BB170、BB152，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院韓先干教授惠贈。所有分離用有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

VITEK-60全自動細菌鑒定儀 法國梅里埃公司；Infinite?M1000 TECAN全功能酶標(biāo)儀 蘇州賽恩斯儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1優(yōu)勢腐敗菌的分離、純化與鑒定

將鮮活對蝦冰猝死后置于無菌錐形瓶中，于4 ℃和常溫條件下，參照郭紅等［17］的方法進行細菌的分離，挑取占各稀釋梯度平板總數(shù)40%以上的單菌落進行純化。根據(jù)細菌菌落特征、革蘭氏染色、鏡檢，參照葉日英等［18］的方法進行細菌自動生化鑒定并進行16S rDNA測序、鑒定。通過BLAST軟件將其與GenBank中所有已測得原核生物的16S rDNA序列進行比對，將比對結(jié)果中相近模式生物的16S rDNA序列下載下來用ClustalX 1.8軟件進行分析，導(dǎo)入到MEGA 6.0軟件中構(gòu)建細菌的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其種屬。

1.2.2優(yōu)勢腐敗菌AHLs活性的檢測

篩選出對蝦優(yōu)勢腐敗菌中的革蘭氏陰性菌，其群體感應(yīng)信號分子AHLs的提取與活性測定參照文獻［19］中的平板劃線法及β-半乳糖苷酶法進行。

平板劃線法：在含0.8%瓊脂的LB平板上涂布40 μL 40 mg/mL的X-gal，將生物檢測菌JZA-1和待測腐敗菌培養(yǎng)菌液“非”字劃線于平板上，無菌風(fēng)吹干平板表面，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h，R10為陽性對照菌。

β-半乳糖苷酶法：按1∶100將過夜培養(yǎng)的JZA-1加入AT培養(yǎng)基中，加入10%（V/V）待測腐敗菌上清提取物（0.22 μm孔徑濾膜過濾），28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.4～1.0。取0.2 mL上述培養(yǎng)物于2 mL離心管中，加入0.8 mL Z-buffer、1 滴0.5%十二烷基磺酸鈉、3 滴氯仿，劇烈振蕩15 s后加入100 μL 3 mg/mL的顯色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG），計時至溶液顯黃色，加入0.6mL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測OD420nm，根據(jù)以下公式計算β-半乳糖苷酶活性：

式中：T為反應(yīng)所需時間/min；V為0.2 mL。

1.2.3優(yōu)勢腐敗菌AI-2活性的檢測

對蝦優(yōu)勢腐敗菌群體感應(yīng)信號分子AI-2的提取與活性測定參照文獻［20］的方法進行。用AB培養(yǎng)基以1∶5 000稀釋BB170培養(yǎng)物，加入BB152培養(yǎng)上清液作為陽性對照、LB液體培養(yǎng)基作為空白對照，28 ℃孵育6 h，用多功能酶標(biāo)儀檢測量品誘導(dǎo)BB170發(fā)光情況。以BB152誘導(dǎo)BB170的發(fā)光值為100%，其他組AI-2活性值為發(fā)光值與BB152發(fā)光值的百分比值。

1.2.4優(yōu)勢腐敗菌生長密度及AHLs、AI-2的動態(tài)檢測

分別按1.2.2節(jié)的AHLs檢測方法和1.2.3節(jié)中的AI-2檢測方法，在優(yōu)勢腐敗菌camtB、camtE、camtF、camtG、camtH培養(yǎng)0、3、6、9、12、15、18、21、24、30、36、42、48 h時，檢測其AHLs和AI-2產(chǎn)生量活性變化，并測菌液生長密度OD600nm。

1.3數(shù)據(jù)分析

2　結(jié)果與分析

2.1優(yōu)勢腐敗菌的鑒定結(jié)果

表1　優(yōu)勢腐敗菌生化鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical identification of dominant spoilage organisms

續(xù)表1

經(jīng)平板純化后最終共得到10 株優(yōu)勢腐敗菌。經(jīng)細菌自動生化鑒定系統(tǒng)鑒定出其中8 株菌（表1）。有4 株為羽狀變形桿菌屬（Proteus penneri，99%）：camtB、camtE、camtG、camtH，另外4 株分別為camtA-類產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes，89%）、camtC-假結(jié)核耶爾森（氏）菌（Yersinia pseudotuberculosis，96%）、camtF-腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens，93%）、camtK-少動鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas paucimobilis，97%）。將分離得到的10 株優(yōu)勢腐敗菌的16S rDNA部分序列進行測序鑒定，與GenBank中所有已測得原核生物的16S rDNA序列進行比對，得到這10 株菌分別為camtA-Oceanisphaera profunda，97.87%、camtB、camtE、camtG、camtH-變形桿菌屬（Proteus，100%），camtC-溶血性葡萄球菌（Stapylococcus haemolyticus，100%），camtF-腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens，100%），camtI-短桿菌屬（Brevibacterium，100%），camtJ-Bacillus siamensis，99.89%，camtK-Exiguobacterium aaestuarii，99.79%。

對蝦的多種相關(guān)研究認為，其腐敗變質(zhì)多以細菌性腐敗為主，其優(yōu)勢腐敗菌通常是一種或幾種。本研究從常溫和4 ℃貯藏條件下對蝦腐敗進程中分離出10 株優(yōu)勢腐敗菌，包括Oceanisphaera profunda、變形桿菌屬（Proteus）、溶血性葡萄球菌（Stapylococcus haemolyticus）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、短桿菌屬（Brevibacterium）、Bacillus siamensis以及Exiguobacterium aaestuarii，其分別占總平板菌落總數(shù)的9.2%、7.5%、6.4%、7.1%、5.9%、6.1%、8.2%。進一步證實凡納濱對蝦的腐敗以細菌性腐敗為主，與葉日英等［18］在冷藏條件下分離得到的新鮮對蝦內(nèi)源優(yōu)勢腐敗菌是短桿菌屬以及郭紅等［17］研究南美白對蝦在冰溫條件下達到一級鮮度時其特定腐敗菌為希瓦氏菌屬相一致。其中某些未見報道過的優(yōu)勢菌群如變形桿菌屬的出現(xiàn)可能是由于實驗設(shè)置溫度條件及對蝦原料的差異導(dǎo)致。本研究中應(yīng)用的細菌自動生化鑒定系統(tǒng)與16S rDNA鑒定結(jié)果有所不同，其原因可能為生化鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫信息不足，以及普通生化鑒定項目不夠全面無法為細菌鑒定提供準確結(jié)果。因此生化鑒定只能作為菌種鑒定中的一個輔助手段，如需準確對菌株進行鑒定則需應(yīng)用16S rDNA序列。

2.2優(yōu)勢腐敗菌AHLs的提取及活性

將篩選出的6 株革蘭氏陰性優(yōu)勢腐敗菌與生物檢測菌JZA-1平板劃線，觀察顏色變化，其中camtA、camtF、camtG、camtH以及陽性對照菌R10可誘導(dǎo)JZA-1水解X-gal產(chǎn)生特征性的藍綠色（圖1中未顯示顏色），說明可產(chǎn)生AHLs類信號分子，但特征性藍綠色有深有淺，如圖1所示。

圖1　優(yōu)勢腐敗菌AHLs產(chǎn)生情況Fig.1 AHLs production of dominant spoilage organism

由β-半乳糖苷酶法檢測6 株革蘭氏陰性優(yōu)勢腐敗菌的AHLs活性，根據(jù)公式計算得到活性有效值（millerunits，MU），結(jié)果見圖2。其中camtF、camtG、camtH的MU值較高，分別為131.31、70.73、65.13 MU（P＜0.05），與陽性對照組R10相對百分比分別為152%、88.7%、75.2%，其AHLs活性較高，camtE的MU值較低。結(jié)果顯示分離得到的6 株革蘭氏陰性優(yōu)勢腐敗菌均能產(chǎn)生AHLs信號分子，這與平板劃線法誘導(dǎo)生物檢測菌JZA-1產(chǎn)生顏色變化的結(jié)果一致。

圖2　優(yōu)勢腐敗菌AHLs活性Fig.2 AHLs activity of dominant spoilage organisms

目前的研究證實，食品中的腐敗菌多產(chǎn)生AHLs，其AHLs參與食品腐敗變質(zhì)過程的調(diào)控［11-12，21］。Jamuna等［22］研究表明AHLs對于腐敗菌——假單胞菌的胞外酶和生物被膜形成有促進作用。食品的軟腐是由歐文氏菌（Erwinia）產(chǎn)生的AHLs調(diào)控果膠酶活性加速豆芽的腐敗變質(zhì)［23］，導(dǎo)致巴氏消毒奶腐敗變質(zhì)的假單胞菌蛋白水解酶活性也是由QS系統(tǒng)所調(diào)控的［24］。劉尊英等［10］研究說明對蝦優(yōu)勢腐敗菌群體感應(yīng)信號分子AHLs與其腐敗指標(biāo)具有顯著正相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，分離出的革蘭氏陰性對蝦優(yōu)勢腐敗菌株均可產(chǎn)生AHLs。由AHLs介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)可能參與了其致腐過程，但其詳細的致腐機理及相關(guān)性有待進一步研究。

2.3優(yōu)勢腐敗菌AI-2的活性

圖3　優(yōu)勢腐敗菌AI-2活性Fig.3 AI-2 activity of dominant spoilage organisms

以哈維弧菌BB152誘導(dǎo)BB170發(fā)光值為100%活性，以LB培養(yǎng)基為空白對照，得到10 株優(yōu)勢腐敗菌的AI-2信號分子活性檢測結(jié)果，如圖3所示。camtA、camtC、camtH、camtK檢測值與BB152檢測值比值低于空白對照，說明該4 株優(yōu)勢腐敗菌不能有效誘導(dǎo)BB170發(fā)光，即不產(chǎn)生AI-2類信號分子；而camtB、camtE、camtF、camtG、camtI、camtJ這6 株優(yōu)勢腐敗菌產(chǎn)生AI-2，且生成量相對較高。即3 株變形桿菌屬Proteus、1 株腐敗希瓦氏菌Shewanella putrefaciens、1 株短桿菌屬Brevibacterium、1 株Bacillus siamensis產(chǎn)生AI-2信號分子。

AI-2類信號分子主要作用于菌種間的信息交流［25-26］，Widmer等［14］研究表明AI-2對于菌株的眾多毒力基因調(diào)控十分關(guān)鍵，Dourou等［27］研究表明其對其他菌株的生長有重要作用。單個菌群存在時其產(chǎn)量可能較弱，因此純培養(yǎng)條件下AI-2的產(chǎn)生量較少甚至某些菌株不產(chǎn)生。本研究分離得到的6 株優(yōu)勢腐敗菌能有效測出AI-2類信號分子，其他株優(yōu)勢腐敗菌可能是由于產(chǎn)生量少，生物檢測菌BB170未能有效檢出或者純培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生AI-2。

2.4優(yōu)勢腐敗菌生長密度及AHLs、AI-2的動態(tài)變化

圖4　優(yōu)勢腐敗菌生長密度動態(tài)變化Fig.4 Dynamic cell density of dominant spoilage organisms

優(yōu)勢腐敗菌camtB、camtE、camtF、camtG、camtH的48 h菌體動態(tài)生長變化如圖4所示，這5株優(yōu)勢腐敗菌生長趨勢相同，符合微生物生長“J”型圖。0～3 h菌群生長較緩，菌群處于生長調(diào)整期，3～21 h腐敗菌生長迅速，進入對數(shù)生長期，達到21～24 h后生長減緩，為對數(shù)后期，24～48 h進入生長平穩(wěn)期，菌群生長相對靜止。

圖5　優(yōu)勢腐敗菌AHLs活性動態(tài)變化Fig.5 Dynamic AHLs activity of dominant spoilage organisms

在汪映［28］的研究中，副溶血弧菌AHLs活性動態(tài)變化為隨著培養(yǎng)時間的延長先升高后降低，在對數(shù)生長末期（18 h）達到最大值。本研究得到的優(yōu)勢腐敗菌AHLs活性變化如圖5所示，在0～18 h時，AHLs生成量隨著菌體密度增加而持續(xù)累積，在菌體對數(shù)生長后期（21～24 h）達到最大值；菌體進入平穩(wěn)期（24～48 h）后，AHLs量變化較小?？赡苁怯捎趦?yōu)勢腐敗菌生長后期其培養(yǎng)液酸堿環(huán)境無較大變化，AHLs高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，因此活性變化不大。優(yōu)勢腐敗菌AHLs活性變化與生長變化呈正相關(guān)。

圖6　優(yōu)勢腐敗菌AI-2活性動態(tài)變化Fig.6 Ddynamic AI-2 activity of dominant spoilage organisms

如圖6所示，AI-2生成量活性變化趨勢均呈“倒鐘型”。在0～18 h，AI-2隨菌體密度持續(xù)累積，達到最大峰值；在菌體對數(shù)生長后期（21～24 h），AI-2的活性相對平穩(wěn)，出現(xiàn)一個最大峰值平臺；當(dāng)菌體進入平穩(wěn)期24～48 h后，AI-2的活性急劇下降，48 h時，AI-2幾乎降至初始值。汪映［28］在副溶血弧菌AI-2信號分子的動態(tài)檢測研究中表明其具有一定的生長階段依賴性，AI-2在對數(shù)生長后期達到峰值后仍保持較高的活性水平。結(jié)合本研究結(jié)果分析，信號分子AI-2的活性值不僅與腐敗菌菌體密度有關(guān)，且其活性不穩(wěn)定，能被培養(yǎng)液中菌體產(chǎn)生的某些代謝物降解，或者其可能與菌體生理代謝相關(guān)，即可參與胞體生長代謝，被胞體吸收利用。

3　結(jié) 論

本研究分離得到了10 株優(yōu)勢腐敗菌，有4 株均為變形桿菌屬（Proteus）。其他分別為Oceanisphaera profunda、溶血性葡萄球菌（Stapylococcus haemolyticus）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）、短桿菌屬（Brevibacterium）、Bacillus siamensis、Exiguobacterium aaestuarii。這些菌株中的6 株革蘭氏陰性菌均產(chǎn)生AHLs信號分子，其AHLs活性與菌體生長密度呈正相關(guān)。其中6 株（3 株變形桿菌屬Proteus、1 株腐敗希瓦氏菌Shewanella putrefaciens、1 株短桿菌屬Brevibacterium、1 株Bacillus siamensis）產(chǎn)生AI-2信號分子。AI-2信號分子活性不穩(wěn)定，其產(chǎn)生量在菌體生長對數(shù)期累積，在菌體生長24 h后活性迅速減弱。本研究結(jié)果將為水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌群體感應(yīng)系統(tǒng)及其與腐敗之間的關(guān)系研究積累資料，也可以為對蝦剩余貨架期預(yù)測和以群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶點進行保鮮貯藏新方法的開發(fā)提供依據(jù)。

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Isolation and Identification of Dominant Spoilage Bacteria from Litopenaeus vannamei and Detection of Quorum Sensing Signaling Molecules

LI Can， ZHANG Yuchen， SUN Lijun*， WANG Yaling， LIANG Meijing， HU Hanqiao， XU Defeng， LIU Ying， YE Riying
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，College of Food Science and Technology， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China）

This study was aimed at isolating， identifying the dominant spoilage bacteria from Litopenaeus vannamei using an automatic biochemical identification system and 16S rDNA sequence， detecting the quorum sensing signaling molecules acyl homoserine lactones （AHLs）， autoinducer-2 （AI-2） and exploring the dynamic formation regularities with indicator bacteria Agrobacterium tumefaciens JZA-1 and Vibrio harveyi BB170， respectively. Ten strains were selected and identified，including Oceanisphaera profunda， Stapylococcus haemolyticus， Shewanella putrefaciens， Brevibacterium sp.， Bacillus siamensis， Exiguobacterium aaestuarii and four strains of the Proteus genus. All the Gram-negative spoilage organisms isolated secreted signaling molecule AHLs while Proteus sp.， Shewanella putrefaciens， Brevibacterium sp. and Bacillus siamensis secreted signaling molecule AI-2. The AHLs activity of dominant spoilage organism was positively correlated with cell density. The AI-2 production was accumulated within the logarithmic phase and decreased rapidly from 24 h onwards.

Litopenaeus vannamei； dominant spoilage organism； quorurm sensing； signaling molecule

10.7506/spkx1002-6630-201608029

TS254.1

A

1002-6630（2016）08-0164-06

2015-07-08

國家自然科學(xué)基金面上項目（31371746；31201309；31171634）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD29B06）；廣東省高等學(xué)校創(chuàng)新強校項目（GDOU2013050312；GDOU2013050205；GDOU2013050203）

李燦（1991—），女，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量與安全研究。E-mail：lican625@163.com

孫力軍（1965—），男，教授，博士，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量與安全研究。E-mail：dfsun01@126.com

引文格式：